Combinación de un agente de contraste de microburbujas con irradiación láser pulsada para la administración transdérmica de fármacos Parte 1

Abstracto: El proceso optodinámico de cavitación de microburbujas (MB) inducida por láser en líquidos se utiliza en diversas aplicaciones médicas. Sin embargo, rara vez se estima cómo la radiación láser incidente interactúa con los MB como agente de contraste de ultrasonido cuando el líquido ya contiene MB estables. El presente estudio investigó la eficacia de la cavitación mediada por láser de MB con cubierta de albúmina para mejorar la administración transdérmica de fármacos. Primero se evaluaron diferentes tipos y condiciones de cavitación inercial de MB mediada por láser. Se seleccionó un láser pulsado fraccionado de CO2 para combinar con MB en los experimentos in vitro e in vivo. La penetración cutánea in vitro de la -arbutina después de 2 h fue 2 veces mayor en el grupo que combinó un láser con MB que en el grupo control. En experimentos con animales pequeños, el efecto blanqueador en la piel de los ratones C57BL/6J en el grupo que combinaba un láser con MB en la piel más arbutina penetrante aumentó (significativamente) en un 48,0 por ciento en los días 11 y 5 0.0 por ciento en el día 14, y luego tendió a estabilizarse durante el resto del período experimental de 20- días. Los presentes resultados indican que la combinación de un láser de CO2 con MB recubiertos de albúmina puede aumentar la permeabilidad de la piel para mejorar el suministro de -arbutina para inhibir la melanogénesis en ratones sin dañar la piel.

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorio, ypromoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche yblanqueamiento de la pielradica en el efecto antioxidante deglucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana es producida por la oxidación de tirosina catalizada portirosinasa. La reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo tantoinhibiendo la producción de melanina.

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1. Introducción

La cavitación se refiere a la formación de cavidades en un líquido y generalmente ocurre cuando el líquido se somete a cambios rápidos de presión. Dichos cambios de presión se pueden inducir utilizando muchos métodos diferentes, y la cavitación acústica se inicia cuando la amplitud de una presión acústica aplicada supera un determinado umbral [1]. La cavitación acústica implica la formación, crecimiento, pulsación y colapso de microburbujas (MB) en líquidos durante la sonicación por ondas de ultrasonido (US) de alta intensidad. Se cree que estos fenómenos son responsables de la mezcla, la fragmentación, la erosión, la humectación, la sonocapilaridad y otros efectos que tienen diversas aplicaciones industriales prácticas [1].

La cavitación inducida por ecografía de los agentes de contraste MB también juega un papel importante en las aplicaciones médicas tanto diagnósticas como terapéuticas. Los agentes de contraste de EE. UU. son MB estabilizados y recubiertos que se inyectan por vía intravascular para mejorar la resolución de las imágenes de diagnóstico de EE. UU. [2]. Hay evidencia de numerosos estudios de que la presencia de agentes de contraste MB en la sangre puede disminuir el umbral de varios efectos biológicos inducidos por ecografía tanto in vitro como in vivo, como hemólisis, ruptura capilar y sonoporación [3]. Algunos estudios han indicado que la presencia de agentes de contraste MB en la sangre reduce significativamente el umbral de contracciones cardíacas prematuras inducidas por ecografía [4,5]. La resonancia de MB (cavitación estable) da como resultado emisiones armónicas no lineales que se pueden utilizar en imágenes de contraste específicas de MB. La cavitación inercial y la destrucción de MB pueden inducir fuertes tensiones mecánicas que aumentan la permeabilidad de las membranas celulares y la barrera hematoencefálica para mejorar la administración de agentes terapéuticos. En nuestros estudios anteriores, hemos aplicado la cavitación inercial de los MB inducidos por los EE. UU. para mejorar la administración transdérmica de fármacos (TDD), ya que se descubrió que la cavitación inercial da como resultado una mejora mucho mayor de la permeabilidad del estrato córneo en comparación con la cavitación estable [6–8] .

La irradiación con láser es un enfoque alternativo para mejorar la penetración del fármaco y, por lo tanto, facilitar la administración del fármaco en la piel oa través de ella. Cuando un pulso láser con una intensidad por encima de un cierto umbral se enfoca en un líquido, la vaporización explosiva del líquido también puede inducir la cavitación MB [9,10]. La naturaleza agresiva de la cavitación inducida por láser ha hecho que se utilice en una amplia gama de aplicaciones, incluida la lisis celular, la poración de la membrana celular y la cirugía ocular [11]. Las estrategias para mejorar de manera segura la apariencia de las cicatrices posoperatorias, atróficas y de acné se han demostrado recientemente utilizando láseres ablativos y no ablativos fraccionados [12]. El rejuvenecimiento cutáneo con láser ablativo proporciona las mayores mejoras clínicas, pero la recuperación posoperatoria lleva varias semanas [13]. Los procedimientos con láser no ablativos podrían ser más adecuados para pacientes que no pueden o no quieren tolerar una cicatrización posoperatoria prolongada. Sin embargo, una infección anterior por herpes simple puede reactivarse después de la remodelación cutánea con láser no ablativo debido al intenso calor producido por el láser u otra fuente de luz [13].

Se han desarrollado algunos métodos para reducir el calor producido por la irradiación láser, como el uso de piezas de mano de enfriamiento por contacto o dispositivos criogénicos dinámicos capaces de administrar chorros de un rocío de enfriamiento de duración variable [14]. Sin embargo, todavía no hay consenso sobre qué método de enfriamiento es más efectivo durante el tratamiento. Además, a diferencia de los EE. UU., el mecanismo subyacente a los efectos de la cavitación inducida por láser con MB recubiertos estabilizados en líquidos sigue sin estar claro.

2. Materiales y métodos

2.1. Producción de MB con cubierta de albúmina

Los MB con cubierta de albúmina se prepararon de acuerdo con el procedimiento utilizado en nuestros estudios previos [7, 15]. En resumen, los MB con cubierta de albúmina se generaron mediante sonicación en 10 ml de una solución que contenía 140 mg de albúmina (Octapharma, Viena, Austria) y gas perfluorocarbonado en solución salina fisiológica (pH 7,4, { {21}}.9 por ciento de cloruro de sodio) utilizando un sonicador (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, EE. UU.) durante 2 min. El número de MB de albúmina rellenos de perflfluorocarbono en la solución se midió con el dispositivo MultiSizer III (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.) con una sonda de apertura de 30- µm y límites de medición de 0,6 a 20 µm. La distribución de tamaños en la suspensión se midió en función de la dispersión de luz dinámica (Zetasizer Nano, ZS90, Malvern, Reino Unido), que reveló que los MB con cubierta de albúmina tenían un diámetro de 1,02 ± 0,11 µm (media ± SD) y una concentración de 1,40 × 108 MB/mL.

2.2. Interrupción de MB inducida por láser 

Estudios previos han sugerido que la interrupción de MB mediada por US (es decir, cavitación inercial) es necesaria para un TDD efectivo [8,16,17]. El presente estudio midió la eficiencia de la interrupción de MB al usar diferentes tipos de láseres en diferentes condiciones. La concentración de MB se ajustó a 2,8 × 107 MB/mL (dilución de cinco veces) y 1,4 × 107 MBs/mL (dilución de diez veces) en un tubo Eppendorf, y la irradiación se proporcionó mediante cuatro tipos de láser: Láser de iones de argón enfriado por aire (515 nm, onda continua), láser de fibra supercontinua (1064 nm, onda pulsada), láser Nd: YAG (532 nm, onda pulsada) y láser fraccional de CO2 (10 600 nm, onda pulsada). Las condiciones detalladas para los distintos tipos de láser se enumeran en la Tabla 1.

En la Figura 1 se muestra un ejemplo de la configuración óptica. El cambio de temperatura durante la irradiación con láser se midió con un termómetro (Optris LS, Optris, Berlín, Alemania). Luego, después de la exposición al láser, se agregaron 100 µL de la solución de MB a un portaobjetos de microscopio para su observación. La cantidad de MB en imágenes de microscopía óptica antes y después de la irradiación con láser se convirtió en imágenes en escala de grises de 8- bits utilizando MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) para facilitar las observaciones de la interrupción de MB. La tasa de destrucción de MB se cuantificó según las áreas dañadas utilizando la siguiente ecuación:

2.3. Profundidad de penetración en piel de cerdo

2.4. Penetración en la piel in vitro por solución de -arbutina

Se cosechó una muestra de piel de cerdo de {{0}} mm de espesor con un cuchillo Humby, se limpió cuidadosamente con PBS y se cortó en trozos cuadrados (2 cm × 2 cm). Las áreas circulares de las muestras de piel con un radio de 1,5 cm y una altura de 5 mm se rodearon con gel para evitar fugas cuando la muestra se cargó con 5{{30}}0 µL de MB. Después de irradiar la muestra siete veces (las condiciones se enumeran en la Tabla 1) con un láser fraccionado de CO2, se probó la penetración en la piel usando celdas estáticas de difusión de Franz sobre un área de 2,14 cm2 según el diseño experimental que hemos descrito anteriormente [7]. La temperatura del conjunto difusor se mantuvo a 37 ◦C. -arbutina (30 mg/mL, 500 µL, 4-hidroxifenil- -D-glucopiranósido, masa molecular=272.25 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) aplicado al lado epidérmico de la piel y ocluido con parafilm (Pechiney Laboratory Safety Products and Apparel, Chicago, IL, EE. UU.). El compartimento de difusión del receptor que mira hacia el lado dérmico se llenó con 12 ml de PBS (pH 7,4), que se agitó con una barra magnética que giraba a 600 rpm. Las soluciones de prueba que no contenían MB se filtraron a través de un filtro de microporos de 0,2-µm (Nalgene, Rochester, NY, EE. UU.) o un filtro de microporos de 0,22-µm (Millex, Darmstadt, Alemania). Se tomaron alícuotas (200 µL) de la solución de receptor a las 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 y 24 hy se reemplazaron por el mismo volumen de solución de receptor nueva.

2.5. Análisis HPLC de -arbutina

Se utilizó una columna Inspire™ C18 (250 mm × 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 µm; Dikma Technologies, Lake Forest, CA, EE. UU.) para medir las concentraciones de -arbutina. El sistema de HPLC estaba equipado con una bomba binaria (PU-2089, Jasco, Tokio, Japón), y la longitud de onda del detector ultravioleta (UV) (UV-2075, Jasco) se fijó en 280 nm. La fase móvil consistió en metanol: agua destilada (pH 5,5, 70:30 v/v) [18] a una velocidad de 0,6 ml/min. Todas las muestras a analizar se inyectaron en un volumen de 20 µL. El tiempo de retención de -arbutina fue de aproximadamente 4,3 min.

2.6. Tratamientos para animales

El contenido de melanina de los organoides se investigó en el modelo de ratón C57BL/6J [19]. Se obtuvieron ratones de cinco semanas de edad que pesaban entre 20 y 25 g de Bio Lasco (Taipei, Taiwán). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de Defensa Nacional, Taipei, Taiwán. Los procedimientos para el cuidado de los animales cumplieron con los lineamientos y reglamentos institucionales (aprobación no. IACUC-17-092). A lo largo de los experimentos, los animales se alojaron en jaulas de acero inoxidable en una habitación con aire acondicionado, manteniendo la temperatura entre 25 y 28 ◦C y alternando ciclos de luz y oscuridad de 12 h cada uno.

Los animales fueron aclimatados durante 7 días antes del experimento. Después de quitarles el cabello de un área de 2 cm × 2 cm, se midió el color de la piel usando un medidor de croma (CR-400, Konica Minolta Sensing, Tokio, Japón). Luego, los animales fueron expuestos a radiación ultravioleta B (UVB) (G8T5E, Sankyo, Tokio, Japón) para inducir hiperpigmentación (dosis de energía total por exposición=1 J/cm2, longitud de onda=306 nm, tres veces por semana durante 2 semanas), y luego se volvió a medir el color de la piel.

Los animales se dividieron en los siguientes cinco grupos (n {{0}} por grupo, tratamiento aplicado una vez cada 3 días durante 20 días): (1) sin tratamiento (grupo C); (2) aplicación de arbutina penetrante sola (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) (grupo A); (3) láser que irradia la piel directamente con la aplicación de arbutina penetrante (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) (grupo L más A); (4) láser irradiando la piel cubierta por solución salina y con la aplicación de arbutina penetrante (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) (grupo L más S más A); y (5) láser irradiando la piel combinado con MB sobre la piel y con la aplicación de arbutina penetrante (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) (grupo L más MB más A). El cambio en el color de la piel inducido por cada uno de los tratamientos se evaluó en tiempos predeterminados utilizando el medidor de crominancia. El índice de luminosidad, L [20], se calculó en cada día de medición antes y después del tratamiento.

2.7. Estudio Histológico

Se tomaron muestras de tejido de la piel (aproximadamente 8 mm × 8 mm) del área de tratamiento inmediatamente después de los experimentos y se almacenaron en una solución de formalina al 10 por ciento. Se aplicó tinción con hematoxilina y eosina (HE; Sigma-Aldrich) y las muestras fueron analizadas por un dermatólogo experto (HWG). Algunas otras muestras se tiñeron con nitrato de plata Fontana-Masson (Kojima Chemical, Kashiwabara, Japón) durante 30 min a 60 ◦C, luego se lavaron con agua destilada y se fijaron en solución de tiosulfato de sodio al 5 por ciento (Duksan, Seúl, Corea) durante 2 min, antes de lavar nuevamente con agua destilada. Luego, las muestras se tiñeron con solución de rojo sólido nuclear (Fluka, Buchs, Suiza) durante 5 min y se lavaron dos veces con agua destilada. Finalmente, las muestras se deshidrataron en un 95 por ciento seguido de etanol al 100 por ciento y luego se lavaron dos veces con xileno (Duksan) [21].

2.8. Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente utilizando la prueba t de Student. Un valor de probabilidad de p < 0.05 se consideró indicativo de una diferencia significativa.

3. Resultados

3.1. Interrupción de MB inducida por láser

En la Figura 2 se muestran imágenes de microscopía de MB diluidos cinco veces sin y con irradiación por un láser continuo (ion de argón enfriado por aire) de 10,8 mW y un láser pulsado (fibra supercontinua) de 10,8 mW durante 60, 120 y 180 s. las tasas de destrucción del láser pulsado aumentaron un 17,66 %, un 20,52 % y un 39,05 % en comparación con el láser continuo a los 60, 120 y 180 s, respectivamente. La figura 3 muestra la eficacia de destrucción de MB diluidos cinco y diez veces cuando se usa un láser pulsado Nd: YAG a 60, 120 y 180 s. Las tasas de destrucción de los MB diluidos cinco y diez veces fueron 72,46 % y 78,59 %, respectivamente, a los 60 s, 88,06 %, 96,10 % a los 120 s, 85,22 % y 98,80 % a los 180 s. La Figura 4 muestra la eficacia de destrucción de MB diluidos diez veces al ser irradiados una, tres y siete veces por el láser pulsado fraccionado de CO2 clínico. La tasa de destrucción aumentó con el tiempo de irradiación, siendo cercana al 100 por ciento para siete veces la irradiación, por lo que esta condición se utilizó en los experimentos posteriores in vitro e in vivo.

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