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Perfiles químicos y estudio de metabolitos de Cistanche Deserticola cruda y procesada en ratas por UPLC-Q-TOF-MSE Parte 1

Apr 04, 2023

Abstracto

Fondo:El procesamiento de la materia médica china es una técnica farmacéutica distinguida y única en la medicina tradicional china (MTC) que se utiliza para reducir los efectos secundarios y aumentar o incluso cambiar la eficacia terapéutica de las hierbas crudas. Los cambios en los componentes esenciales inducidos por un procedimiento de procesamiento optimizado son los principales responsables de la mayor eficacia de las plantas medicinales. El efecto vigorizante riñón-yang de la Cistancha deserticola (C. deserticola) cocida al vapor con vino de arroz fue más fuerte que el de la C. deserticola (CD) cruda.

Métodos:Se realizó un análisis de comparación utilizando el UPLC-Q-TOF-MSE con la plataforma informática UNIFI para determinar la influencia del procesamiento. Se realizaron estudios in vitro para la caracterización de constituyentes y metabolitos in vivo. Se determinaron los componentes químicos en CD y sus productos procesados. Los análisis estadísticos multivariados se realizaron para evaluar las variaciones entre ellos, mientras que OPLS-DA se utilizó para la comparación por pares.

Resultados:Los resultados de este estudio revelaron variaciones considerables en los glucósidos feniletanoides (PhG) e iridoides después del procesamiento. Se detectaron un total de 97 compuestos en los extractos de CD y su producto procesado. Los PhG que tienen el grupo 4'-O-cafeoilo en la parte 8-O- -d-glucopiranosilo, como el acteósido, el cistanosido C, el campneósido II y el osmanthusido, disminuyeron después de ser procesados, mientras que los PhG con el grupo 6'- El grupo O-cafeoilo en la parte 8-O- -d-glucopiranosilo, como el isoacetósido, el isocistanósido C, el isocampneósido I, el isomartinosido aumentó, especialmente en el grupo CD-NP. La intensidad del equinacósido y el cistanósido B cuya estructura posee un resto 6'-O- -d-glucopiranosilo también aumentó. En un estudio in vivo, se detectaron 10 componentes prototipo y 44 metabolitos en plasma, heces y orina de rata. Los resultados obtenidos revelaron que el procesamiento conduce a una variación considerable en los constituyentes químicos de la CD y afecta la disposición de los compuestos in vivo, y los procesos metabólicos de fase II son las cascadas clave de cada compuesto y la mayoría de los metabolitos están asociados con el equinacósido o el acetónido.

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Conclusiones:Esta es la primera investigación de comparación global de CD en bruto y procesado. Estos hallazgos se suman a nuestra comprensión del impacto del procesamiento de CD y brindan datos importantes para futuras investigaciones de eficacia.
Palabras clave:Cistanche deserticola, Procesamiento, UPLC-Q-TOF-MSE, Perfiles químicos, Metabolitos in vivo

Introducción

El procesamiento de la materia médica china (CMM) ha demostrado una aplicabilidad significativa en la práctica clínica de la medicina tradicional china (MTC), y se ha considerado un tratamiento viable durante varios siglos. Esta es una tecnología farmacéutica única que se ha derivado de la teoría de la medicina tradicional china. En el siguiente procesamiento, se identificaron diferencias significativas en la apariencia, los componentes químicos, las características y la importancia medicinal de todos los tipos de MTC, lo que lleva a suponer que el procesamiento podría mejorar la eficacia o reducir los efectos tóxicos de la MTC.

Durante cientos de años, Cistanche deserticola (Roucongrong en chino, CD) se usa comúnmente en la práctica clínica de la MTC para complementar las funciones del riñón. También ayuda en la hidratación del intestino, lo que conduce a la relajación del intestino [1]. Cistanche se registró por primera vez en ShenNongBencaoJing. Se encuentra comúnmente en hábitats áridos y semiáridos en Eurasia y el norte de África, incluidos Irán, China, India y Mongolia [2]. El procesado de CD se ha llevado a cabo mediante vaporización con vino de arroz a presión normal, que es un método de preparación documentado en la farmacopea china (Jiucongrong en chino, en adelante denominado “CD-NP”). Y la cocción al vapor de CD con vino de arroz a alta presión es un método de preparación más eficaz (en lo sucesivo denominado "CD-HP") [3, 4]. Varios estudios han revelado que los efectos farmacológicos de la CD son diferentes a los de sus productos procesados ​​[5]. El CD puede tonificar el yang del riñón y relajar el intestino, mientras que después de ser cocido al vapor con vino de arroz, se fortalecería el efecto de reponer el yang del riñón. En nuestro estudio anterior, se encontró que CD-NP podría mejorar la sonificación del riñón y apoyar el yang, y aliviar los efectos de humedecer los intestinos y defecar [6–8]. En la práctica clínica, los productos procesados ​​son la forma más utilizada.

Hasta la fecha, varios estudios han analizado los componentes químicos de la EC, seguido del aislamiento e identificación de más de 100 compuestos [9–11], como los glucósidos feniletanoides (PhG), los iridoides, los lignanos y los oligosacáridos como sus principales constituyentes químicos. . También se ha informado que existen muchas actividades farmacológicas de las PhG, que incluyen inmunomoduladoras, neuroprotectoras, hepatoprotectoras, antiinflamatorias, antioxidantes, etc. [12–14]. Los iridoides poseen actividades antiinflamatorias [15, 16]. Estudios anteriores también han revelado que algunos componentes químicos mostraron variaciones durante el procesamiento [17–20]. Con base en estos informes, se puede suponer que después del procesamiento, las variaciones en la composición química conducen a varios efectos farmacológicos, que deben explorarse más a fondo.

En el estudio actual, se realizó un método sensible y efectivo, es decir, cromatografía líquida de rendimiento ultra alto junto con TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) para el análisis comparativo, y se realizaron estudios in vitro para analizar cualitativamente los extractos. de CD, CD-NP y CD-HP para dilucidar sus perfiles químicos. En general, los productos químicos exógenos con alta exposición en los órganos diana se consideraron componentes eficaces. Por lo tanto, en ratas, la CD y sus productos procesados ​​se administraron por vía oral respectivamente, seguido de su caracterización. El estudio existente revela un estudio comparativo (tanto in vitro como in vivo) de CD crudo y procesado por primera vez. Los resultados obtenidos ampliarían nuestra comprensión del efecto del procesamiento de CD, lo que podría ser útil para estudios posteriores.

Materiales y métodos

Materiales

Los compuestos estándar de ajugol (180120) y 2'-actilacetósido (M0601AS) fueron proporcionados por Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, China). El cistanósido F (MUST-17022620), el echinacósido (D1105AS), el cistanósido A (M0906AS) y el isoactósido (M0106AS) fueron proporcionados por Must company (Sichuan, China); el acteósido (O0618AS), el salidrosido (J0526AS), el catalpol (S0728AS), el genipósido (A0407AS) y el ácido geniposídico (MB6001-S) se adquirieron de Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, China). El 8-ácido epideoxilogánico (B31123) se obtuvo de Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, China. El metanol y el acetonitrilo eran de grado MS y se obtuvieron de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. El ácido metanoico (CH2O2) de grado HPLC fue proporcionado por Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). El agua utilizada en el estudio existente se procesó a través del sistema Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Ma, EE. UU.). El vino de arroz fue proporcionado por Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

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Cistanche deserticola se recolectó de Neimenggu wangyedi cistanche Co. Ltd. Las muestras fueron identificadas por el Prof. Yanjun Zhai (facultad de farmacia, Universidad de Liaoning de MTC). Las muestras se enviaron a la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning.

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Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource
Centro de la provincia de Liaoning, número de licencia: SCXK- 2015–0001). Estas ratas se alojaron en una sala de cría con temperatura y humedad bien mantenidas, es decir, 20-26 grados, 50-70 por ciento durante una semana. Las ratas fueron alimentadas con agua y alimentos de laboratorio habituales antes de la experimentación. Los animales ayunaron durante la noche, sin embargo, el agua se proporcionó ad libitum antes de la experimentación. Las ratas fueron ejecutadas con un 10 por ciento de anestésico de hidrato de cloral. El Comité Institucional de Ética Animal del Hospital Provincial de Medicina China de Liaoning aprobó todos los protocolos experimentales (2019.3.25, 2019015).

Preparación de extractos de CD, CD‑NP y CD‑HP

CD-NP y CD-HP se procesaron del mismo lote de Cistanch deserticola. Para preparar CD-NP, las piezas secas de CD (5 mm de espesor, 100 g) se humedecieron con vino de arroz (30 ml) y se cocieron al vapor a 100 grados durante 16 horas, seguido de un secado a 55 grados en un horno de secado. Mientras que el CD-HP se preparó mediante la infiltración de piezas secas de CD (5 mm de espesor, 100 g) con vino de arroz (30 ml), seguido de vaporización a una presión atmosférica de 1,25 durante 4 h. y luego secado en un horno de secado a 55 grados.

En un matraz de medición de 100 ml, se tamizó un gramo del polvo a través del tamiz n.° 4, luego se agregó el 50 por ciento de metanol (50 ml) y luego se cubrió herméticamente y se mezcló. Esta mezcla se pesó, seguido de media hora. maceración Después de la maceración, la mezcla se ultrasonicó (potencia 250 W, frecuencia 35 kHz) durante 40 min, seguido de enfriamiento y pesado nuevamente. La pérdida de peso se repuso con metanol al 50 por ciento, se mezcló adecuadamente y se dejó reposar, seguido de filtrado del sobrenadante y luego utilizando el filtrado obtenido como solución de prueba.

Análisis MSE de componentes activos

Preparación de sustancias estándar: tableside-A (3.02 mg), echinacósido (3.00 mg), 2'-acetilacteoside (2,34 mg), acetonide (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanosido-F (2,14 mg), salidrosido (3,39 mg), genipósido (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catálogo (2,39 mg), ácido tenipósido (2,56 mg) y 8-ácido epideoxilogánico (2,34 mg) en un matraz aforado de 10 ml, se añadió metanol a volumen constante a escala, configurado en una solución de referencia de concentración correspondiente. Cada uno de los 100 μL se configuró en una solución de referencia mixta.

Condición de análisis de MS: el valor de masa te se corrigió antes del experimento y se utilizó el modo de iones negativos. El rango de masa fue de 50–1200 Da, y la muestra se inyectó a través de unas pocas bombas de inyección. La velocidad del cono fue de 100 l/h, el caudal de disolvente se fijó en 800 l/h. Los voltajes de capilar y cono se fijaron en 2500 y 40 V, en consecuencia. La temperatura de la fuente de iones y del gas disolvente fue de 100 y 400 grados, respectivamente, y la frecuencia de adquisición de la señal fue de 0,5 S−1.

Análisis UPLC‑Q-TOF‑MSE de extracto de CD

Las evaluaciones cromatográficas se llevaron a cabo en un sistema UPLC ACQUITY I-CLASS de Waters (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.). Incluye columna ACQUITY UPLC® BEH C18 (50×2,1 mm, 1,7 μm, Waters). La fase móvil estaba compuesta por agua que tenía 0,1 por ciento de ácido fórmico (A) y acetonitrilo que contenía 0,1 por ciento de ácido fórmico (B), la condición de elución era la siguiente: 97 por ciento a 85 por ciento A (0–5 min), 85 % a 75 % A (5–15 min), 75 % a 65 % A (15–16 min), 65 % a 55 % A (16–18 min) . El caudal fue de 0,3 ml min−1, mientras que la temperatura de la sala y la columna del automuestreador fue de 30 y 8 grados por separado. El volumen de inyección fue de 1,0 μL.

La evaluación espectrométrica de masas se llevó a cabo a través de Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.), que comprende una fuente ESI. El caudal de nitrógeno gaseoso se fijó en 800 L·hrs−1 con una temperatura de 400 grados, la temperatura de la fuente se fijó en 100 grados y el cono de gas se fijó en 50 L·h−1. El voltaje del cono y del capilar se ajustó a 40 y 2000 V, según corresponda. La energía de colisión de la rampa se utilizó en el rango de 20 a 30 V. Los datos centroides de todas las muestras se obtuvieron de 50 a 1200 Da, con un 5-tiempo de exploración de 0,5 s durante un tiempo de análisis de 10 min. . Se empleó LockSpray TM para la validación de la precisión de la masa. El ion [M–H]− de leucina encefalina (200 pg·μL−1 caudal de infusión 10 μL min−1) a m/z 554,2615 se utilizó como masa de bloqueo. Se empleó el software MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, EE. UU.) para calcular la masa exacta, la composición de los iones precursores y los iones de fragmentos.

Análisis de datos en la plataforma Masslynx

Además, se estableció una biblioteca interna que comprende el nombre del compuesto, su estructura y la fórmula molecular (en mol.) con base en la literatura. Todos los compuestos fueron anotados en una plantilla especial, realizada en Excel. Además, los archivos mol (ChemDraw Ultra 8.0, Cambridge soft, EE. UU.) y los archivos de Excel de todas las estructuras compuestas individuales también se guardaron en la PC local. Estableció una hoja de Excel con datos importantes importados directamente a la biblioteca científica en UNIFI.

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Se empleó UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Reino Unido para la evaluación de las características estructurales, en particular para los fragmentos característicos y la fragmentación de MS. Se estableció un área de pico mínima de 500 para la detección de picos 2D. Durante la revelación de los picos 3D, se eligió una intensidad máxima de energía baja de más de 300 cuentas y una intensidad máxima de energía elevada de más de 80 cuentas. Se encontró que el error de masa era de hasta ±10 ppm para compuestos conocidos, y la tolerancia del tiempo de retención se fijó en el rango de ±0,1 min. Seleccionamos los aductos negativos que contenían –H, más HCOOH. El procesamiento de los datos sin procesar obtenidos de MS se llevó a cabo a través del software UNIFI optimizado para identificar rápidamente los componentes químicos que cumplían con los estándares con la base de datos autoconstruida y la Biblioteca de Medicina Tradicional interna.

A continuación, para verificar la estructura química de cada compuesto objetivo, los isómeros se distinguieron por sus patrones característicos de fragmentación de MS que se revelaron en los estudios informados y comparando los tiempos de retención de los estándares de referencia.

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Análisis metabolómico basado en análisis estadístico multivariante

Antes de procesar los datos sin procesar, se establecieron los parámetros, como masa que va desde 150 a 1200 Da, rango de tiempo de retención (0 a 20 min), umbral de intensidad ( 2000 recuentos), tolerancia de masa, es decir, 5 mDa, mientras que la ventana de masa y tiempo de retención fue de 0,20 min y 0,05 Da, respectivamente. En la lista posterior de la base de datos, el identificador de iones fue el par RT-m/z en relación con sus tiempos de elución. Los mismos valores para RT y m/z en varios lotes de muestras se consideraron como el mismo compuesto.

Multivariate statistical analysis was conducted to evaluate effective biomarkers that considerably contributed to variations among different groups. During the analysis, principal component analysis (PCA) was employed to indicate the maximum differences and pattern recognition for obtaining an overview and classification. The OPLS-DA is a modeling tool that provides visualization of the OPLS-DA predictive component loading to assist model evaluation. Variable importance for the projection (VIP) was used for assessing the evaluation of various components, and the metabolites with VIP values>1.0 y valor P<0.05 were regarded as effective markers. Furthermore, a permutation test was conducted for providing reference distributions for the R2/Q2 values that could show statistical significance.

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Las ratas se clasificaron aleatoriamente en cuatro grupos (n=6 para cada grupo), seguido de la administración oral de varios extractos: (1) Grupo de control en blanco: las ratas recibieron solución salina normal (2 ml/100 g); (2) grupo CD: las ratas recibieron extracto de CD (2 ml/100 g); (3) grupo CD-NP: las ratas recibieron extracto de CD-NP (2 ml/100 g); (4) Grupo CD-HP: las ratas recibieron extracto de CD-HP (2 ml/100 g). La categorización adicional de todos los grupos se llevó a cabo en tres subgrupos para plasma, orina y heces, según corresponda. Dos horas más tarde, a cada rata se le administró por vía oral la misma cantidad de extractos.

Después de la administración, la recolección de muestras de sangre se llevó a cabo a las 1.0 h, 2.0 h y 4.0 h en tubos de polietileno heparinizados de 1,5 ml (de las venas orbitarias) , seguido de centrifugación (a 4500 rpm) de todas las muestras durante 15 min.

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Para las muestras de orina y heces, las ratas se mantuvieron en jaulas de metabolismo, y luego se llevó a cabo la recolección de muestras de orina y heces durante 24 h después de la administración. La centrifugación de las muestras de orina se realizó a 4500 rpm durante 15 min, mientras que las muestras de heces se secaron a la sombra y se molieron en polvo, luego se tomaron 0.2 g y se agregaron a 0.5 mL solución salina, ultrasonido por 5 min y centrifugado a 12,000 rpm por 15 min. Todas las biomuestras se mantuvieron a -80 grados hasta su análisis.

Preparación de muestras biológicas

La adición de muestras de plasma, orina y heces se realizó con 3 volúmenes de metanol, seguido de agitación vorticial durante 3 min. A continuación, se llevó a cabo la centrifugación (a 12, 000 rpm) de las mezclas durante 10 min, seguido de la transferencia del sobrenadante al tubo EP y luego secado con nitrógeno a 37 grados. Además, se realizó la adición de 200 μL de solución de HCN-H2O (50 por ciento). Luego, se usó el vórtice para mezclar (1 min), seguido de centrifugación (a 12,000 rpm) durante 5 min. El sobrenadante (5 μL) de las muestras tratadas se inyectó en el sistema UPLC-Q-TOF-MSE.

Estado cromatográfico de líquidos y espectrométrico de masas

El análisis de metabolitos también fue realizado por el instrumento Waters UPLC a través de una interfaz ESI. Las separaciones se llevaron a cabo utilizando una columna Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), la fase móvil era 0,1 por ciento de ácido fórmico (A): Acetonitrilo (B), la condición de elución en gradiente fue de 0–3 min (99,8 % →98 % A), 3–5 min (98 % →95 % A), 5–8 min (95 % →90 % A), 8 –12 min (90 % →85 % A), 12–17 min (85 % →70 % A), 17–22 min (70 % →60 % A), 22–23 min (60 % →58 % A) , 23–25 min (58 % A), 25–32 min (58 % →45 % A) y 32–37 min (45 % →35 % A), 0,4 ml min−1 fue el caudal. La temperatura de la columna y la sala de muestras se fijó en 40 y 8 grados, respectivamente. Se utilizaron las condiciones de espectrometría de masas mencionadas anteriormente.

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Estrategia para el análisis sistemático de metabolitos en muestras biológicas

Se empleó el software UNIFI (1.8.2) para el procesamiento de datos. La función Binary Compare se utilizó para la identificación de metabolitos efectivos. Los metabolitos evaluados no existían en la muestra de control equivalente o existían a bajas intensidades de iones. El umbral de intensidad relativa se fijó en 3 o 5, y se pudieron evaluar los metabolitos que cumplían con los criterios subrayados. Los metabolitos comunes y predecibles fueron luego determinados por EIC. Para la búsqueda de metabolitos de dos fases, se aplicó la función NLF. Por ejemplo, en el software UNIFI, los parámetros podrían establecerse en 176.0321 para buscar posibles conjugados de ácido glucurónico. Después del procesamiento, se puede establecer o identificar una pérdida neutral en el método. MassFragment se utilizó para determinar o caracterizar las estructuras de los metabolitos detectados, la función de interpretación espectral de UNIFI es la función principal utilizada para analizar la fragmentación secundaria de los componentes originales. Esta función se puede utilizar razonablemente para una verificación rápida de la ruta de fragmentación.

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