Selección y caracterización de inhibidores de tirosinasa de Atractylodis Macrocephalae Rhizoma según la relación espectro-actividad y acoplamiento molecular

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Cistanchetiene la función de promover la producción de colágeno, que puede aumentar la elasticidad y el brillo de la piel y ayudar a reparar las células dañadas de la piel.CistancheLos glucósidos de feniletanol tienen un efecto de regulación negativa significativo sobre la actividad de la tirosinasa, y se ha demostrado que el efecto sobre la tirosinasa es una inhibición competitiva y reversible, lo que puede proporcionar una base científica para desarrollar y utilizar los ingredientes blanqueadores en Cistanche. Por lo tanto, la cistanche tiene un papel clave en el blanqueamiento de la piel. Puedeinhibir la producción de melaninapara reducir la decoloración y la falta de brillo; y promover la producción de colágeno para mejorar la elasticidad y el brillo de la piel. Debido al reconocimiento generalizado de estos efectos de la cistanche, muchos productos para blanquear la piel han comenzado a infundir ingredientes herbales como la cistanche para satisfacer la demanda de los consumidores, aumentando así el valor comercial de la cistanche enblanqueamiento de la pielproductos En resumen, el papel de la cistanche en el blanqueamiento de la piel es crucial. Su efecto antioxidante y su efecto productor de colágeno pueden reducir la decoloración y la opacidad,mejorar la elasticidad y el brillo de la piel, y así conseguir un efecto blanqueador. Además, la amplia aplicación de Cistanche en productos para blanquear la piel demuestra que no se puede subestimar su papel en el valor comercial.

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Atractylodis macrocephalus Rhizoma (AMR) es una famosa medicina tradicional china clásica (CTM), que se ha utilizado como un tónico para muchas enfermedades durante miles de años. En la antigua China, se usaba como alimento complementario para la belleza en el palacio. En estudios preliminares, se descubrió la función de blanqueamiento de la piel y el efecto inhibidor significativo sobre la tirosinasa (TYR), que es la enzima reactiva en la composición de la melanina de AMR, y rara vez se informó sobre la investigación relevante. En este estudio, se aplicó la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) junto con el análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS) para examinar la coherencia entre los constituyentes químicos y la actividad inhibidora de 11 lotes de AMR en la actividad de TYR. Los resultados de PLS mostraron que los picos cromatográficos 11 (atractilenolida III) y 15 podrían ser ingredientes efectivos importantes para la inhibición de la actividad de TYR según lo determinado por las relaciones espectro-actividad. Además, la actividad inhibidora de TYR de la atractilenolida III se validó mediante una prueba in vitro con -arbutina que sirvió como fármaco de control positivo.ElLos resultados de la prueba in vitro y el acoplamiento molecular mostraron que la atractilenolida III tiene una alta actividad inhibidora de TYR y podría unirse a los residuos en el bolsillo catalítico de TYR.Elpor lo tanto, los bioensayos, el acoplamiento molecular y las relaciones espectro-actividad son apropiados para vincular la calidad de las muestras con los ingredientes activos relacionados con la industria farmacéutica. Y nuestro estudio sentaría una base teórica para aplicar los extractos de agua de AMR en cosméticos blanqueadores.

1. Introducción

La tirosinasa (TYR), también denominada polifenol oxidasa, es una enzima polifuncional que contiene cobre glicosilado que existe ampliamente en el organismo de animales, plantas y microorganismos [1–3]. En presencia de oxígeno molecular, la tirosina es catalizada primero por TYR para oxidarse a dopa y luego se oxida a dopaquinona, que se isomeriza para formar pigmento de dopa. El pigmento dopa finalmente formó melanina con la participación de CO2 y TRP-2, que causan varias enfermedades de la piel como hiperpigmentación, melasma, pecas y manchas de la edad [4, 5]. TYR juega un papel vital porque es la enzima crítica y la enzima de restricción en el curso de la composición de la melanina [6-8]. Las manchas de pigmento y el melanoma aumentaron notablemente al aumentar la actividad y la cantidad de TYR [9]. Hoy en día, los inhibidores de TYR han recibido una amplia atención debido a su uso latente como agentes hipopigmentados [10].

Atractylodis macrocephalus rhizoma (AMR), el rizoma seco de Atractylodes macrocephalaKoidz., es una de las hierbas medicinales chinas recopiladas en la Farmacopea china [11–15]. En la antigua China, AMR se optó por formar la famosa fórmula clásica para el blanqueamiento denominada "ungüento de siete blancos" y se usó como alimento complementario para la belleza en el palacio [16]. Se informó que AMR contenía principalmente sesquiterpenoides y triterpenoides (incluidos atractilenolido I, atractilenolido II y atractilenolido III), poliacetilenos, cumarinas y fenilpropanoides, flavonoides y glucósidos de flflavonoides, polisacáridos, esteroides, benzoquinonas y otros constituyentes [17, 18]. Sin embargo, rara vez se informaron sus efectos sobre el blanqueamiento de la piel y los ingredientes activos.ElSe aplicó el estudio de la relación espectro-actividad para explorar su relevancia.

La investigación sobre la relación espectro-actividad no solo puede eludir la deficiencia de la segregación entre los ingredientes químicos y la farmacodinámica, sino que también puede asociar suficientemente las huellas dactilares con la farmacodinámica mediante el modelo matemático [19, 20].elLa relación espectro-actividad explora la relevancia entre la huella digital y la farmacodinámica para ofrecer un método creíble para aclarar la base material de la medicina herbaria china [21].Ellas huellas dactilares se establecieron por HPLC, UPLC, GC, GC MS y LC-MS generalmente [19, 22–24]. Los datos de "farmacodinámica" son adquiridos por los modelos por lo general [25].ElLos métodos de procesamiento de datos incluyen principalmente el análisis de componentes principales (PCA), el análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS), el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA), el análisis de correlación canónica (CCA) y el análisis relacional de grises (GRA). por lo general [26-29].

Para aclarar los componentes de AMR que contribuyen a la actividad de inhibición de TYR [30, 31], se establecieron las huellas dactilares de 11 lotes de AMR mediante HPLC; la farmacodinámica de la actividad de inhibición de TYR in vitro se evaluó por el método bioquímico enzimático. Los compuestos eficaces 2e se seleccionaron mediante el modelo de relación espectro-actividad que se estableció correlacionando los picos de las huellas dactilares con los datos farmacodinámicos. Además, las sustancias activas se validarían mediante pruebas in vitro y experimentos de acoplamiento molecular. Este estudio podría sentar una base teórica para aplicar AMR como medicamento de tratamiento para las enfermedades de la piel pigmentada y desarrollarlo como complemento de los cosméticos blanqueadores.

2. Materiales y métodos

2.1. Químicos y Materiales.El metanol (superior o igual al 99,5 por ciento) se compró a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). El ácido fosfórico (mayor o igual al 99 por ciento) se adquirió de Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd. (Chengdu, China). El acetonitrilo se compró a Tiandi Reagent Co., Ltd. (EE. UU.). Atractylodes III (mayor o igual al 98 por ciento), tampón de fosfato, tirosinasa y L-tirosina se compraron a Beijing Soleibao Technology Co., Ltd. (Beijing, China). -La arbutina (mayor o igual al 99,7 por ciento) se compró en la Academia China de identificación de alimentos y medicamentos. La tirosinasa y la L-tirosina se disolvieron en tampón fosfato (pH 6,8) antes de su uso. Se disolvieron atractilosas III y -arbutina en metanol al 50 por ciento (v/v).ElEl agua pura se compró a Hangzhou Wahaha Baili Food Co., Ltd., (Hangzhou, China). La columna Comix C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) se compró a Guangzhou Philemon Scientific Instrument Co., Ltd. (Guangzhou, China).

2.2. Materiales vegetales.ElSe recolectaron 11 lotes de muestras medicinales AMR y se muestran en la Tabla 1.ElLas muestras anteriores fueron autenticadas por el profesor Ronggui Qin (Facultad de Farmacia, Universidad Médica de Guizhou).

2.3. Extracción.Se pesaron con precisión piezas de hierbas de cada muestra (alrededor de 10 g) y luego se colocaron en un matraz de fondo redondo, se agregó agua y se sometió a reflujo para extraer. Los productos se secaron a presión reducida para obtener el extracto acuoso de AMR. 2en, los extractos acuosos de AMR (alrededor de 30,00 mg) se pesaron con precisión y se disolvieron con metanol al 50 por ciento (v/v).

2.4. Análisis HPLC.Columna de cromatografía de fase inversa Comix C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm).Ella fase móvil 0.1 por ciento fosfórico era una mezcla de agua ácida (A)-acetonitrilo (B); el sistema de elución está diseñado y se enumera en la Tabla 2.Ella siguiente velocidad se fijó en 0,6 ml/min. La temperatura de la columna 2e fue de 30 grados.ElLa longitud de onda de UA fue de 210 nm.Elel volumen de inyección fue de 30 μL.

El método de detección se verificó mediante una prueba de precisión, una prueba de repetibilidad y una prueba de estabilidad.

2.5. Análisis quimiométrico.En este estudio, la información de picos comunes de las huellas dactilares de 11 lotes de AMR se importó al software SIMCA14.1 para HCA, PCA y OPLS-DA.

2.6. Prueba de Inhibición de TYR In Vitro. ElLos extractos de AMR se disolvieron con tampón de fosfato (pH 6,8), se almacenaron a 4 grados y luego se usaron para el ensayo de la enzima.

En este estudio, se utilizó L-tirosina como sustrato para determinar la inhibición de la actividad TYR.Ellas soluciones de reacción se prepararon de acuerdo con la Tabla 3 y se determinó la tasa de inhibición de AMR sobre la actividad de TYR. En primer lugar, las soluciones de reacción se colocaron en un baño de agua a 37 grados durante 10 min. En segundo lugar, la solución de TYR se añadió inmediatamente a las soluciones de reacción T2 y T4. En tercer lugar, las soluciones de reacción reaccionaron a una temperatura constante del baño de agua de 37 grados durante 10 minutos después de mezclarlas completamente. Finalmente, las soluciones de reacción de los valores de absorbancia se midieron a 475 nm inmediatamente. Las tasas de inhibición (porcentaje) se obtuvieron de la ecuación: la tasa de inhibición (porcentaje) =[(AT2− AT1) − (AT4 − AT3)]/(AT2− AT1) × 100 por ciento.

2.7. Análisis de la relación espectro-actividad. ElSe utilizó el software "Sistema de evaluación de similitud de huellas dactilares cromatográficas de medicina tradicional china 2012 A Edition" para ajustar los tiempos de retención de cada pico, y el área del pico (PA) se procesó mediante ecualización.Eln, se obtuvieron los datos cuantitativos.ElLa ecuación de regresión PLS se configuró con el software SIMCA14.1; el área del pico se tomó como variable independiente (X), y la tasa de inhibición de TYR se fijó como variable dependiente (Y).

2.8. Efecto inhibidor de Atractylodes III sobre TYR y acoplamiento molecular.Para atestiguar el efecto inhibidor de Atractylenolide III sobre TYR, se realizaron pruebas de actividad enzimática in vitro con -arbutina como fármaco de control positivo.

Se aplicó el programa AutoDock4.2 en las simulaciones de acoplamiento. La estructura cristalina de Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) se tomó como la estructura 3D de TYR [32]. Realizamos simulaciones del acoplamiento de TYR a Atractylodes III. Con el fin de acoplarse con AutoDock Vina, el tamaño de la cuadrícula se diseñó para (x, y, z) =(16, 12, 14) y el centro de la cuadrícula se diseñó para (x, y, z) { {10}} (−10,348, −28,279, −45,925). En cada procedimiento de simulación, el progreso con los parámetros predeterminados opera desde AutoGrid y AutoDock. Se adoptó el algoritmo genético de Lamarckian (LGA) para determinar las orientaciones de unión de ligandos más apropiadas.

3. Resultados y discusión

3.1. Validación de Metodología.Se validaron la precisión, la repetibilidad y la estabilidad del método analítico. En las pruebas de precisión, la precisión de los tiempos de retención relativos (RRT) y las áreas máximas relativas (RPA) no excedieron {{0}}.02 por ciento y 4 por ciento en RSD, respectivamente; la similitud fue 1. La repetibilidad de RRT y RPA fue menor que 0.11 por ciento y 4 por ciento en RSD, y la similitud fue mayor o igual a 0.998. La estabilidad se estimó analizando una solución de muestra conservada a temperatura ambiente de laboratorio después de 0, 6, 8, 12 y 18 h. Los RSD de RRT y RPA de los picos comunes fueron inferiores al 0,1 por ciento y al 4 por ciento, respectivamente; la similitud fue de más de 0,999.ElLos resultados sugirieron que el sistema experimental AMR para el análisis de huellas dactilares es estable y confiable.

3.2. Establecimiento de huellas dactilares HPLC y análisis de similitud.La huella dactilar de las sustancias de referencia Atractylodes III se muestra en la Figura 1(a). La muestra AMR mostró una segregación favorable entre sus picos (Figura 1(b)). En condiciones perfectas, se generaron las huellas dactilares de HPLC de los 11 lotes diferentes de muestras de AMR (Figura 1(c)) y se calcularon las similitudes. Los resultados de similitudes se muestran en la Tabla 4, que mostró que todos los valores de similitud de las 11 muestras fueron mayores que 0.8, lo que indica que todas las muestras eran similares en los tipos de composiciones químicas. Se observaron dieciséis picos comunes comparando su tiempo de retención del espectro UV. El pico 11 se identificó como Atractylodes III por sustancias de referencia. Los RSD de PA de 16 picos comunes estaban entre 1,18 por ciento y 58,68 por ciento (Tabla 5). Estos resultados indicaron que los contenidos de las sustancias químicas en AMR de diferentes áreas de producción eran diferentes.

3.3. Análisis quimiométrico

3.3.1. HCA. Se aplicó HCA para identificar AMR de diferentes áreas de producción en función de diferentes grupos y la similitud de las huellas dactilares. Se utilizó como indicador el área de pico común en 11 lotes de AMR, y el análisis de conglomerados se realizó mediante el software SIMCA14.1. Los resultados se muestran en la Figura 2. Las muestras de 11 lotes de AMR se dividieron en 3 categorías cuando las distancias de clase oscilaron entre 20 y 30, de las cuales S4, S8, S9, S1 y S3 se agruparon en las categorías I y S7 fue agrupados en la categoría II, mientras que S2, S5, S10, S6 y S11 se agruparon en la categoría III.

3.3.2. PCA. En este estudio, se calculó el PCA de 11 lotes de AMR; en 16 componentes principales, la contribución acumulada de la varianza de los primeros cinco componentes principales fue del 91,3 por ciento.ElLa matriz de puntuación de los dos primeros componentes se utilizaría para el análisis, ya que la varianza acumulada superó el 65,9 por ciento.Elpor lo tanto, en ausencia de alguna información, construya un plano bidimensional de la componente principal en el que la abscisa sea una componente principal y la ordenada sea otra componente principal. Luego, las 11 muestras se proyectaron en el plano 2D para que se observara su reunión natural (Figura 3(a)). Se encontró que S4, S8, S9, S1 y S3 tenían clasificaciones obvias, S7 se podía dividir en un tipo y S2, S5, S10, S6 y S11 se podían dividir en otro tipo.ElEl resultado de PCA fue consistente con el resultado de HCA.

Cada punto en el diagrama de carga representaba un pico cromatográfico, que representa la contribución de cada pico cromatográfico al efecto integral de lacomponentes principales.Elvalor de peso de las variables puedereflejan la correlación entre la composición químicay la muestra en la mayor medida.Elmás lejos deel origen del diagrama de carga, mayor es la variablepeso.ElEl resultado se muestra en la Figura 3 (b), que sugirióque los picos cromatográficos 9, 11 (atractilenolida III),y 12 tuvieron un mayor impacto en el primer componente principal. Sin embargo, los picos cromatográficos 4, 5, 6, 15 y 16tuvo un mayor impacto en el segundo componente principal. Élmostró que los picos cromatográficos anteriores podrían tener unmayor impacto en la clasificación.

3.3.3. OPLS-DA.El11 muestras se dividieron en dos grupos S1, S3, S4, S8 y S9 fueron el primer grupo y S2, S5, S6, S7, S10 y S11 fueron el segundo grupo.ElLa información de picos comunes de todas las muestras se importó al software SIMCA14.1 para OPLS-DA. R2 X y R2 Y caracterizan la tasa explicativa del modelo a las matrices x e y, individualmente, y Q2 caracteriza la capacidad predictiva del modelo.ElLos resultados mostraron que los valores de R2 X, R2 Y y Q2 fueron 0.939, 0.992 y 0.583, respectivamente, todos los cuales fueron mayores que {{ 9}}.5, indicando que el modelo podía distinguir los dos grupos de muestras y tenía un mejor ajuste y capacidad predictiva en el procesamiento de datos. Podría usarse para distinguir la resistencia a los antimicrobianos de diferentes áreas de producción (Figura 4(a)).

ElEl perfil de variables importantes para la proyección (VIP) en el modelo OPLS-DA puede reflejar la contribución de cada pico cromatográfico a la muestra.ElLos valores VIP de los 16 picos cromatográficos reflejaron el poder de influencia en cada muestra AMR. Con base en el principio de selección de que el valor VIP era mayor que 1.0 y la barra de error era menor que el origen (Figura 4(b)), se seleccionaron los 4 picos cromatográficos importantes, que se ordenaron: pico 1 > pico 6 > pico 16 > pico 5.

ElLos resultados del análisis del diagrama de carga se muestran en la Figura 4(c), que mostró que las posiciones de los 4 picos cromatográficos importantes anteriores estaban lejos del origen. Se sugirió que los 4 picos cromatográficos afectaron significativamente la clasificación de AMR, y estos componentes representados por 4 picos cromatográficos podrían ser los principales componentes marcadores de cada muestra.

3.4. Evaluación de la Actividad Inhibitoria de AMR sobre TYR In Vitro.ElLos efectos inhibidores de AMR de diferentes áreas productoras sobre la actividad de TYR se determinaron mediante el método bioquímico de enzimas.Ellos efectos de las muestras sobre la actividad de TYR se enumeran en la Tabla 6. Cada muestra con una concentración de 10 mg/mL pudo inhibir la actividad de TYR y la actividad farmacológica fue notablemente diferente, entre las cuales la tasa de inhibición de S5 fue la más alta, mientras que la de S6 fue la más baja.

3.5. Análisis de relaciones espectro-efecto. En este artículo, se aplicó PLS para analizar la relación espectro-actividad.ElEl coeficiente de regresión parcial y el valor VIP se muestran en las Figuras 5(a) y 5(b), que mostraron que los picos cromatográficos 1, 2, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 15 y 16 se correlacionaron positivamente con el inhibición de la actividad TYR, pero los picos cromatográficos 3, 4, 8, 12, 13 y 14 se correlacionaron negativamente con ellos. Entre los picos cromatográficos correlacionados positivamente con la inhibición de la actividad TYR, los valores de VIP de los picos cromatográficos 11 (Atractylodes III) y 15 fueron superiores a 1, lo que indica que estos dos componentes influyen significativamente en la inhibición de la actividad TYR.

3.6. Efecto inhibidor de Atractylodes III sobre TYR y acoplamiento molecular.ElEl efecto inhibidor de Atractylodes III sobre la actividad de TYR se determinó mediante el método bioquímico enzimático in vitro con -arbutina como control positivo.ElLos resultados mostraron que las tasas de inhibición de Atractylodes III y -arbutina sobre la actividad de TYR fueron 63,68 ± 2,36 por ciento y 94,85 ± 0,35 por ciento, respectivamente, cuando la concentración de las muestras fue de 1 mg/mL.

El acoplamiento molecular se utilizó para estudiar el mecanismo de unión de Atractylodes III que interactúa con TYR (Figuras 6(a)–6(c)).ElEl sitio de unión de la tirosinasa de hongo está compuesto por una cavidad angosta y poco profunda con dos iones de cobre (Cu2+), cada uno estabilizado por tres residuos de histidina (p. ej., His 61) en el centro activo de la enzima. En este estudio, Atractylodes III es un compuesto de molécula pequeña ubicado en el centro activo de la enzima e interactúa con los residuos circundantes (His 244, Phe 264, Ala 286, His 263, Val 283, His259, His 85, Asn 260). Sorprendentemente, Atractylodes III formó un enlace de hidrógeno estable con Asn 260 con una longitud de enlace de 1,9 ˚ A.

4. Conclusiones

En este estudio, se estableció un método sistemático que conecta las huellas dactilares de HPLC con el análisis quimiométrico para distinguir las muestras de AMR de diferentes orígenes, y se probó el efecto blanqueador de AMR mediante el método bioquímico de enzimas. Las relaciones espectro-efecto indicaron que los picos cromatográficos 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11, 15 y 16 se correlacionaron positivamente con el efecto de inhibición de AMR en la actividad de TYR, entre los cuales los picos 11 (atractilenolida III) y 15 podrían ser componentes activos importantes. Mientras tanto, la atractilenolida III tiene una alta actividad inhibidora de TYR en la prueba in vitro, y el resultado del acoplamiento molecular mostró que su mecanismo podría estar relacionado con la unión de residuos de aminoácidos en la cápsula catalítica de TYR.ElPor lo tanto, estos resultados demostraron que los bioensayos, el acoplamiento molecular y las relaciones espectro-actividad son apropiados para vincular la calidad de las muestras con los ingredientes activos relacionados con la industria farmacéutica.

Disponibilidad de datos

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

Divulgación

Yong-Qin Liu y Chang-Yan Xu son considerados coprimeros autores.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés en este estudio.

Contribuciones de los autores

Yong-Qin Liu y Chang-Yan Xu contribuyeron al trabajo.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue patrocinado por el Programa de Capacitación en Innovación y Emprendimiento para Estudiantes Universitarios en la Provincia de Guizhou (no. 20195200925).

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