Comparación de dos ensayos de diagnóstico para la detección de anticuerpos neutralizantes en suero contra el virus de la diarrea epidémica porcina

Abstracto:

La inmunidad lactogénica es importante para la protección de los lechones contra muchos patógenos, incluido el virus de la diarrea epidémica porcina. Los niveles de anticuerpos neutralizantes circulantes en el suero de las cerdas pueden ayudar a determinar si una respuesta inmune detectable podría conferir protección a los lechones. Los anticuerpos neutralizantes se pueden detectar mediante varios ensayos de diagnóstico. Este estudio evaluó las características diagnósticas de dos ensayos de anticuerpos neutralizantes para anticuerpos neutralizantes del virus de la diarrea epidémica porcina en el suero de primerizas expuestas. Cuatro grupos de tratamiento, control, no vacunados, vacunados antes de la exposición y vacunados después de la exposición, estaban compuestos por 20 primerizas. Se recogieron muestras de suero de cada primeriza antes y después del desafío con el virus de la diarrea epidémica porcina. Las muestras se evaluaron para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante un ensayo de neutralización de foco fluorescente y un ensayo de neutralización de alto rendimiento. La sensibilidad y especificidad diagnóstica para los ensayos de neutralización del foco fluorescente y de neutralización de alto rendimiento para este estudio se optimizaron con un límite de una dilución de 80 y 80 % de reducción fluorescente respectivamente y demostraron una concordancia moderada según la estadística kappa. Los ensayos de neutralización fluorescente focalizada y de neutralización de alto rendimiento se pueden utilizar para controlar el estado de los anticuerpos neutralizantes en animales o en una población de animales. El ensayo de alto rendimiento tiene ventajas sobre el ensayo fluorescente focalizado porque tiene una mayor especificidad en el punto de corte indicado y la naturaleza de los resultados permite una mayor discriminación entre los resultados individuales.

Beneficios del suplemento cistanche: aumentar la inmunidad.

Palabras clave: PEDV; anticuerpo neutralizante; ensayo de diagnóstico

1. Introducción

El virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) es un alfacoronavirus que se ha vuelto endémico en las Américas luego de su aparición en los Estados Unidos en 2013 [1–3]. Las medidas de bioseguridad se centran en mantener patógenos como el PEDV fuera de las piaras de cerdos para mitigar el impacto de la enfermedad [4]. Las pruebas serológicas son una herramienta útil para determinar si los cerdos han estado expuestos e infectados previamente por un patógeno. La exposición puede ocurrir de forma natural (p. ej., ingestión de material cargado de virus) o intencional (p. ej., mezcla con animales sembradores que se mudan, inoculación oral-nasal o lavado gástrico). Para los fines de este estudio, la exposición se logró mediante desafío intencional con un homogeneizado de tejido positivo para PEDV de un brote clínico confirmado de PEDV. Canción y col. [5] demostraron que los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero no diferían entre las cerdas a las que se les administró una vacuna PEDV DR13 atenuada con células Vero oral o intramuscular. Este estudio también demostró que las cerdas vacunadas por vía oral tenían una menor mortalidad de los lechones en comparación con la vacunación intramuscular. Además, de Arriba et al. [6] demostraron una correlación entre las células secretoras de anticuerpos (ASC) IgA e IgG en la sangre y el tejido linfoide asociado al intestino. La placenta epiteliocorial difusa de las cerdas evita que las células inmunitarias y los anticuerpos se transfieran a los lechones en el útero, lo que provoca que los cerdos tengan agammaglobulinemia al nacer [7]. La inmunidad materna se transfiere de las cerdas a sus lechones a través de secreciones mamarias y desempeña un papel fundamental en la protección contra patógenos entéricos como PEDV, TGEV y rotavirus. Por lo tanto, los lechones dependen del calostro y de los anticuerpos de la leche para protegerse contra estos patógenos. Las inmunoglobulinas séricas contribuyen en gran medida al calostro, mientras que las inmunoglobulinas de la leche se producen dentro de la glándula mamaria [8]. Por lo tanto, los ensayos de anticuerpos neutralizantes pueden ayudar a determinar si una respuesta inmune detectable en sueros de cerdas preparto podría conferir protección a los lechones. Los mecanismos de neutralización de los anticuerpos incluyen agregación, inhibición de la entrada viral de la célula diana e inhibición de la replicación viral dentro de la célula diana [9]. Se han desarrollado ensayos de diagnóstico para detectar anticuerpos neutralizantes contra PEDV, incluida la neutralización del virus (VN), la neutralización del foco fluorescente (FFN) y la prueba de neutralización de alto rendimiento (HTNT) [2,10-13]. Como lo describen Sarmento et al. [2], el ensayo FFN es una mejora con respecto al ensayo VN ya que el ensayo es más sensible porque el ensayo se basa en la detección de antígenos virales expresados ​​en la superficie de células Vero infectadas, mientras que el ensayo VN se basa en el efecto citopático causado. por el virus. Además, los resultados de FFN se pueden obtener más rápidamente que los resultados de VN, ya que el efecto citopático tarda más en observarse en comparación con la unión viral con la FFN. El ensayo HTNT es una mejora adicional con respecto al ensayo FFN, ya que el ensayo HTNT se basa en la citometría de imagen digital en lugar de la interpretación técnica para obtener los resultados. De esta forma, se permite leer una placa completa en menos de 3 minutos, lo que produce una medición cuantitativa de la intensidad fluorescente y la posibilidad de almacenar imágenes para su revisión. Por lo tanto, el HTNT parecía ser adecuado para su uso en piaras de cerdos comerciales. El presente estudio comparó las características diagnósticas (sensibilidad y especificidad) y los valores predictivos positivos y negativos de dos ensayos de anticuerpos neutralizantes para los ensayos PEDV, FFN y HTNT. Esto se basa en el trabajo de Sarmento et al. [2] probando animales vírgenes, infectados y vacunados para ayudar a validar el ensayo para su uso en un laboratorio de diagnóstico de alto rendimiento. Con base en los resultados de Sarmento et al. [2], nuestra hipótesis nula es que no hay diferencia en las características diagnósticas de los dos ensayos para detectar anticuerpos neutralizantes contra PEDV en el suero de primerizas expuestas a PEDV.

Beneficios del suplemento cistanche: aumentar la inmunidad.

2. Materiales y métodos

2.1. Fuentes y selección de cerdos

Como lo describieron previamente Brown et al. [14], este estudio utilizó 4 grupos de tratamiento denominados Control, NV (no vacunados), Pre (vacunados antes de la exposición) y Post (vacunados después de la exposición). Cada grupo estaba compuesto inicialmente por 20 primerizas comerciales, mestizas. Se seleccionaron convenientemente un total de 60 primerizas de una granja porcina comercial en el centro de Iowa que no tenía antecedentes de PEDV. Las 20 primerizas del grupo Control se reutilizaron para el grupo NV. El grupo NV estaba compuesto por sólo 18 cerdos, ya que dos primerizas fueron retiradas del estudio debido a complicaciones no relacionadas con la exposición a PEDV.

Como prueba adicional del estado negativo de PEDV, se recogieron 12 ml de sangre mediante punción venosa yugular utilizando un calibre 16-, una aguja de 1,5- pulgada y una jeringa de 12 ml. Se recogió suero de muestras de sangre mediante centrifugación a 1.500 x g durante 8 min (min), se dividió en alícuotas de 1 ml y se almacenó a -80 ◦C. Las muestras de suero se analizaron con un wv-ELISA en el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa (ISU-VDL, Ames, IA, EE. UU.) [15].

2.2. Asignación de animales a grupos de tratamiento

Las sesenta primerizas se dividieron uniformemente en 3 grupos, cada uno compuesto por 20 hembras mestizas comerciales. Para formar cuatro grupos de tratamiento, se utilizaron 20 primerizas secuencialmente para dos de los grupos de tratamiento, CONTROL y NV. La reutilización de las 20 primerizas permitió el desarrollo y control de un grupo de primerizas positivas para PEDV que habían estado expuestas a PEDV y redujo el número total de animales utilizados en el estudio. Las 40 primerizas restantes comprendían los grupos PRE y POST, con 20 primerizas dentro de cada grupo. La cronología de los eventos por grupo de tratamiento se describe en Brown et al. [14]. En resumen, se recolectaron muestras de sangre individuales una vez por semana en cada grupo de tratamiento después del desafío. Se analizan más detalles en las Secciones 2.4 y 2.5. Las primerizas del grupo de tratamiento "PRE" fueron vacunadas antes de su llegada a las instalaciones externas. Las primerizas del grupo de tratamiento "POST" no fueron vacunadas hasta después del desafío.

2.3. Alojamiento y cuidado de cerdos

A su llegada a las instalaciones de investigación, las primerizas fueron alojadas en un grupo de tratamiento: las 20 primerizas de un grupo de tratamiento estaban en un corral con alimento y agua ad libitum. Todos los corrales estaban en la misma habitación. Se dejó un corral vacío entre los grupos NV PRE y POST para minimizar la contaminación. Se monitorearon los alimentos, el agua, los máximos y mínimos de temperatura ambiente y los máximos y mínimos de humedad para garantizar la coherencia con los estándares de producción. Se realizaron y registraron observaciones de salud una vez al día para evaluar la deambulación, el letargo, la consistencia fecal y otros signos clínicos de enfermedad. Se colocó una etiqueta en la oreja (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, EE. UU.) en la oreja derecha de cada primeriza para la identificación individual de los animales.

2.4. Desafío oral

Después de un período de aclimatación de 4- días, cada primeriza de CONTROL fue expuesta oralmente al PEDV utilizando un homogeneizado de tejido recolectado de un brote clínico confirmado de PEDV en una granja comercial. El homogeneizado fue secuenciado por el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa y resultó ser la cepa prototipo estadounidense, genogrupo G2b. Se mezclaron diez mililitros del homogeneizado con 590 ml de solución salina tamponada con fosfato y se administraron irónicamente 30 ml de la mezcla a cada primeriza. Se confirmó que el inóculo era positivo para PEDV mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real con un valor de CT de 19,6 y 14,23 × 107 copias genómicas por ml y el desarrollo de diarrea en las primerizas después de la exposición. Se recogieron muestras de sangre individuales cada 7 días después de la exposición mediante venopunción yugular como se describe anteriormente hasta el día 42 después de la exposición. El suero se recogió y almacenó como se describió anteriormente y las muestras se enviaron al ISU VDL para la detección de anticuerpos neutralizantes mediante un ensayo de neutralización fluorescente focalizado y una prueba de neutralización de virus de alto rendimiento. El día 60 después del desafío inicial de CONTROL, las 40 primerizas restantes fueron llevadas al centro de investigación y 18 de las primerizas de CONTROL se convirtieron en NV. Dos primerizas fueron retiradas de CONTROL debido a condiciones no relacionadas con el estudio. Después de un período de aclimatación de 3- días después de la llegada, se volvieron a desafiar a 18 primerizas (NV) y a 40 primerizas (PRE y POST), se recogieron muestras de sangre, se recogió suero y se enviaron muestras para análisis como se describe en este documento. .

2.5. Vacunación de primerizas

Cuarenta primerizas permanecieron en la granja de origen y fueron llevadas a las instalaciones de investigación 8,5 semanas después de la llegada de CONTROL. Veinte primerizas habían sido vacunadas 5 y 2 semanas antes del desafío, según lo recomendado por la compañía que produce la vacuna, con una vacuna PEDV muerta disponible comercialmente, genogrupo G2b (Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Zoetis, Inc., Florham Park, Nueva Jersey). , EE.UU.) que integran el grupo PRE. Los veinte restantes fueron vacunados con la misma vacuna, 1 y 3 semanas después de la exposición a PEDV que comprende el grupo POST. Dieciocho de las veinte primerizas de CONTROL originales permanecieron en el estudio y formaron parte del grupo NV y no recibieron la vacuna contra PEDV.

planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico

2.6. Ensayos de anticuerpos neutralizantes

2.6.1. Procedimiento de neutralización del foco fluorescente (FFN)

La FFN fue realizada por el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa, procedimiento operativo estándar 9.5324 [16]. Brevemente, se prepararon células Vero 76 enjuagando e incubando con ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 5 minutos a 37 ◦C. Se hizo una dilución 1:20 de células y medio de propagación celular y se agregaron 200 µl a cada pocillo de una placa de pocillos 96- y se incubaron durante 48 h. Las placas se vaciaron y se enjuagaron con medio de inoculación de virus. Las muestras de suero se inactivaron térmicamente en un baño de agua a 56 ◦C durante 30 minutos y luego se diluyeron en una dilución en serie 2- veces comenzando en 1:10 en la placa. El virus madre se diluyó en 100–200 unidades formadoras de focos por 100 µL y se agregaron 100 µL a cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos a 37 ◦C con 5% de dióxido de carbono (CO2). La placa de prueba se descartó, se enjuagó y se agregaron 150 µL de la mezcla de suero/virus a los pocillos correspondientes y se incubó durante 60 minutos a 37 ◦C. Se desecharon las mezclas de suero/virus y se lavaron los pocillos con medio de inoculación de virus. A cada pocillo se agregaron 150 µL de medio de inoculación de virus y se incubaron durante 24 h a 37 ◦C y 5% de CO2. Se retiró el medio de la placa y las células se fijaron añadiendo acetona al 80%, que se enfrió en un baño de hielo, durante 15 minutos. Se descartó la acetona y la placa se secó al aire. Se preparó una dilución 1:100 de anticuerpo monoclonal PEDV NP conjugado con FITC diluido en PBS (pH 7,2) y se agregaron 50 µL a todos los pocillos y se incubaron a 37 ◦C durante 60 min. La placa se lavó con PBS y luego se leyó usando un microscopio de fluorescencia (Olympus BX51, objetivo 10X, filtro FITC). Los pocillos positivos no muestran placas fluorescentes y los negativos muestran placas verdes. Los títulos de anticuerpos neutralizantes se expresaron como la dilución de suero más alta con una reducción del 90 % de la replicación del virus en comparación con el control del virus. Las muestras con un título mayor o igual a 20 se clasificaron como positivas para anticuerpos neutralizantes del PEDV. Un título más alto indica una mayor concentración de anticuerpos neutralizantes en la muestra. En los materiales complementarios se encuentran disponibles ejemplos de muestras de suero positivas y negativas.

2.6.2. Procedimiento de prueba de neutralización fluorescente de alto rendimiento (HTNT)

La HTNT fue realizada por el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa, procedimiento operativo estándar 9.5324 Versión 2 [17]. Las muestras de suero se inactivaron térmicamente en un baño de agua a 56 ◦C durante 30 min. El stock de virus se diluyó en serie 10- veces en medio de inoculación de virus (DMEM con 2 µg/ml de tripsina-TPCK), se transfirió a células Vero 81 (ATTC® CCL-81™) y se incubó a 37 ◦C. con 5% de CO2 durante 5 días. La última dilución en la que se observó efecto citopático se utilizó para determinar la dosis infecciosa mediana en cultivo de tejidos (TCID50) utilizando el método de Spearman y Karber [18]. Se diluyeron cien microlitros de solución celular (medio de propagación celular, tripsina-EDTA y células Vero 81) con 100 µl de medio de propagación celular (DMEM con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina) para hacer una dilución 1:1. . Se usó un hemocitómetro para contar y calcular la dilución para producir 5 × 104 células/pocillo y se añadió a cada pocillo de una placa de pocillos 96- negra con fondo transparente (microplaca Coring CellBind de 96 pocillos, Sigma) y se incubó durante 48 h a 37 ◦C con 5% de CO2 para hacer confluentes las células (100% confluentes). Cada placa tenía pocillos de control positivo, control negativo y control de virus. Luego, se colocaron cinco microlitros de controles y muestras inactivados por calor en pocillos duplicados para hacer una dilución 1:40, primero 1:20 agregando 95 µL de medio de inoculación de virus, luego 100 µL de virus PEDV diluido 1:10 (3,16 × 105). DICT50/mL). La mezcla suero/virus se incubó durante 1 h a 37 ◦C con 5% de CO2. Todos los pocillos celulares de la placa de prueba se lavaron 3 veces con 150 µL de medio de lavado celular (DMEM con penicilina-estreptomicina al 1%), y se transfirieron 150 µL de la mezcla de suero/virus y los controles de virus a la placa de prueba y se incubaron durante 90 minutos. a 37 ◦C. Se descartó la mezcla de suero/virus y las placas se lavaron una vez con un medio de lavado de células, como se describió anteriormente, seguido una vez con un medio de inoculación de virus. Se añadió medio de inoculación de virus (150 µL) a cada pocillo y se incubó durante 24 h a 37 ◦C con 5% de CO2. Se descartó el medio de inoculación del virus y se lavó la placa con PBS pH 7,4. Las células se fijaron añadiendo 4 ◦C, 80% de acetona a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se eliminó la acetona y la placa se secó al aire durante 30 min. Cada pocillo se lavó con PBS pH 7,4. Se agregaron a cada pocillo 50 µL de anticuerpo monoclonal PEDV NP conjugado con FITC (clon SD6-29, Medgene Labs) diluido 1:100 en PBS pH 7,4 y se incubaron durante 60 minutos a 37 ◦C. La placa se lavó cuatro veces con PBS pH 7,4, dejando el último lavado en la placa durante 5 minutos, luego se descartó y se reemplazó con 100 µL de PBS pH 7,4. Luego, las placas se leyeron con SpectraMax i3× usando SoftMax Pro 6.5 (Molecular Devices, San José, CA, EE. UU.) usando un tiempo de exposición de 30 ms y ajustes focales de 20 um para 541 longitudes de onda. Las muestras con una reducción de fluorescencia total (%FR) mayor o igual al 85% se clasificaron como positivas para anticuerpos neutralizantes [2]. La reducción total de la fluorescencia se calculó como 100 - ([Intensidad de fluorescencia total de la muestra promedio/Intensidad de fluorescencia total del control negativo promedio]) × 100). Una mayor reducción de la fluorescencia total indica mayores concentraciones de anticuerpos neutralizantes dentro de las muestras. En los materiales complementarios se encuentran disponibles ejemplos de muestras de suero positivas y negativas.

2.7. Características diagnósticas: sensibilidad y especificidad y valores predictivos positivos y negativos

La sensibilidad y especificidad diagnóstica se calcularon para HTNT usando un límite de %FR de 70, 75, 80, 85 y 90 y para FFN usando límites de dilución de muestra de 20, 40, 80 y 160 para determinar el límite optimizado. Optimizado se definió como el punto de corte donde se maximiza la especificidad diagnóstica con una pérdida mínima de especificidad diagnóstica. Se seleccionó un subconjunto de setenta y seis muestras negativas conocidas para PEDV de los dos primeros puntos de muestreo para los grupos CONTROL y POST. Se seleccionaron 36 muestras positivas para PEDV de los dos últimos puntos de muestreo para el grupo NV. Se utilizó un límite superior a 85 para definir muestras positivas, en congruencia con el procedimiento operativo estándar de ISU VDL para el ensayo [17]. La sensibilidad diagnóstica se estimó dividiendo el número de muestras positivas conocidas que dieron positivo por el total de muestras positivas conocidas. La especificidad diagnóstica se estimó dividiendo el número de muestras negativas conocidas que resultaron negativas por el número de muestras negativas conocidas. Se seleccionó el punto de corte que optimizó la especificidad y la sensibilidad diagnóstica para comparar los ensayos. Para los fines de este estudio, se maximizaron la especificidad diagnóstica (DSp) y la sensibilidad (DSe), donde el valor absoluto de la diferencia entre los valores de sensibilidad y especificidad es el más pequeño. El valor predictivo positivo (VPP) se estimó dividiendo el número de muestras positivas conocidas que dieron positivo (TP) por el total de muestras positivas (TP más falso positivo [FP]). El valor predictivo negativo (VPN) se estimó dividiendo el número de muestras negativas conocidas (TN) que dieron negativo por el total de muestras negativas (TN más falsos negativos [FN]).

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Haga clic aquí para ver los productos Cistanche Enhance Immunity

【Pregunte por más】 Correo electrónico:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Análisis estadístico

No hubo resultados indeterminados ni datos faltantes en este estudio. Todos los datos se analizaron utilizando SAS Versión 9.4 (SAS Instit. Cary NC). Se utilizaron 609 observaciones de 6{{10}} cerdos pertenecientes a uno de los 4 grupos. Se consideraron dos posibles valores de corte (40 y 80) para el ensayo FFN y se compararon con un límite de 85 para el HTNT. Para cada uno, se ajustó un modelo lineal de efectos mixtos para explicar el efecto del grupo en la concordancia de los ensayos FFN y HTNT, con un efecto aleatorio específico de los cerdos. Se realizaron todos los análisis de comparación por pares de grupos. Además, para dos de los tres valores de corte utilizados para el ensayo FFN, se calculó el coeficiente Kappa de Cohen para determinar la concordancia general de los ensayos FFN y HTNT. Los coeficientes kappa se interpretaron de la siguiente manera: menos de 0.0, acuerdo "pobre"; entre 0.0 y 0.20, acuerdo "ligero"; entre 0.21 y {{30}}.40, acuerdo "justo"; entre 0,41 y 0,60, acuerdo "moderado"; entre 0,61 y 0,80, acuerdo "sustancial"; y entre 0,81 y 1,0, acuerdo "casi perfecto" [19]. La significancia se fijó en p Menor o igual a 0,05. Los diagramas de caja y bigotes se desarrollaron utilizando el software R.

3. Resultados

La Tabla 1 muestra la sensibilidad y especificidad diagnóstica de los ensayos FFN y HTNT en los puntos de corte seleccionados. La sensibilidad y especificidad diagnóstica de los dos ensayos de este estudio se optimizaron con un límite de dilución de 80 y 80 % de FR, respectivamente.

Tabla 1. Sensibilidad diagnóstica (DSe), especificidad diagnóstica (DSp), valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) para ensayos HTNT y FFN utilizando varios puntos de corte enumerados en la segunda fila de la tabla. Por ejemplo, para el ensayo HTNT con un punto de corte de 70, el DSe=0.97 (97%), el DSP=0.91 (91%), PPV=0.83 ( 83%), y VPN=0.95 (95%). U=indefinido.

La Figura 1 muestra diagramas de caja y bigotes de los resultados de HTNT por días después del desafío por grupo de tratamiento del estudio. Las muestras de los grupos CONTROL y POST (n=76) se clasificaron como negativas los días −4, 0 y 7 como se esperaba debido al estado previo de los cerdos. El grupo NV desarrolló una respuesta anamnésica tras el desafío. Se produjo una disminución de la variabilidad entre los resultados de HTNT, como lo muestra una disminución en el rango de valores en ambos grupos vacunados (PRE y POST) después de la exposición a PEDV. Esta variación disminuida se puede observar en la Figura 1 a medida que los bigotes y los valores atípicos de las parcelas POST y PRE se acortan 14 días después del desafío. La Figura 2 muestra diagramas de caja y bigotes de los resultados de FFN transformados logarítmicamente naturales por días después del desafío por grupo de tratamiento, que tienen resultados similares a los del ensayo HTNT. Tanto los resultados de HTNT (Figura 1) como los de FFN (Figura 2) muestran una respuesta a la exposición y a la vacunación, como se observa con un aumento en el %FR y los títulos de ambos ensayos. Si bien fue similar en magnitud, la variación de los resultados de cada ensayo se redujo después del desafío homólogo (NV). También se produjo una disminución de la variación después de la vacunación (PRE y POST). Esta variación de los valores de anticuerpos neutralizantes por semana después de la exposición disminuye después de la vacunación y la exposición homóloga al PEDV (Figuras 1 y 2). Hubo una tendencia similar en la disminución de la variación del anticuerpo neutralizante observada en los resultados de ambos ensayos de los grupos de tratamiento vacunados y expuestos a homólogos. La exposición homóloga de PEDV y las segundas vacunaciones produjeron una respuesta anamnésica que generó un mayor nivel de anticuerpos neutralizantes con una variación reducida entre cerdos en comparación con los valores previos a la exposición y posteriores a la vacunación, medidos por ambos ensayos (Figura 1). Con base en el análisis de la sensibilidad y especificidad del diagnóstico, se seleccionaron los puntos de corte de 80 (título) y 85 (% FR) para analizar la concordancia de las pruebas para los ensayos FFN y HTNT respectivamente. La prueba kappa demostró una concordancia "moderada" de 0.5257 con un intervalo de confianza del 95 % de 0.461, 0,5904 de los ensayos para el punto de corte 80 (título) y 85 (%FR) para el Ensayos FFN y HTNT.

Figura 1. Gráficos de caja y bigotes de las curvas de respuesta de anticuerpos HTNT por días después del desafío para cada grupo de tratamiento. La barra del medio representa el valor mediano de los resultados por semana. Las bisagras (superior e inferior de la caja) representan el primer (Q1) y el tercer (Q3) cuartil. La región sombreada representa el rango intercuartil (IQR). Los bigotes se determinan de la siguiente manera: Bigote superior=Q3 + 1.5∗IQR; Bigote inferior=Q1 + 1.5∗IQR. Si ningún punto de datos se encuentra en el valor calculado, el siguiente punto de datos más cercano a Q1 o Q3 es el límite del bigote. Los círculos abiertos (◦) indican valores atípicos. Un corte de 85 se indica mediante la línea discontinua en 85 en el eje y.

Figura 2. Gráficos de caja y bigotes de las curvas de respuesta de anticuerpos FFN por días después del desafío para cada grupo de tratamiento. La barra del medio representa el valor mediano de los resultados por semana. Las bisagras (superior e inferior de la caja) representan el primer (Q1) y el tercer (Q3) cuartil. La región sombreada representa el rango intercuartil (IQR). Los bigotes se determinan de la siguiente manera: Bigote superior=Q3 + 1.5∗IQR; Bigote inferior=Q1 + 1.5∗IQR. Si ningún punto de datos se encuentra en el valor calculado, el siguiente punto de datos más cercano a Q1 o Q3 es el límite del bigote. Los círculos abiertos (◦) indican valores atípicos. Un corte de 40 se indica mediante la línea discontinua en ln(40) en el eje y.

4. Discusión

Nuestra hipótesis es que la variación reducida y una respuesta anamnésica se asocian con una inmunidad colectiva homogénea y protección contra enfermedades, a pesar de que todavía se observaron signos clínicos en el grupo PRE como se describió anteriormente [14]. Para los fines de este estudio no se evaluaron el impacto clínico ni la gravedad de la enfermedad en estos animales. La enfermedad se manifiesta de manera diferente entre adultos y recién nacidos, con signos clínicos más graves y muerte en los recién nacidos en comparación con los animales adultos [1,20]. Si bien los niveles de anticuerpos neutralizantes circulantes por sí solos no confieren protección [21], pueden usarse para evaluar una respuesta de anticuerpos luego de una exposición intencional o la administración de vacunación en rebaños. Si bien la ausencia de viremia es característica del PEDV, se ha informado de viremia en lechones de hasta 4 semanas de edad [22,23]. Por tanto, los anticuerpos neutralizantes circulantes pueden influir en el curso clínico de la enfermedad [21]. Sin embargo, la inmunidad lactogénica, específicamente la IgA en las secreciones mamarias, sería una medida más precisa de protección para los lechones [21]. Los ensayos descritos en este estudio podrían usarse para monitorear los anticuerpos neutralizantes séricos después de la administración de la vacunación en grupos de cerdas o primerizas, además de recolectar secreciones mamarias para realizar pruebas de IgA lactogénica/secretora. Sería beneficioso si los datos generados a partir de estos ensayos pudieran predecir la cantidad y estabilidad de la inmunidad lactogénica producida después de la vacunación. Sin embargo, eso no fue analizado en el presente estudio. Se ha demostrado que las respuestas de anticuerpos IgG séricos después de la vacunación predicen la respuesta de IgG calostral, pero no hubo correlación entre los anticuerpos neutralizantes séricos y los de las secreciones mamarias [15]. Si bien no hubo correlación entre los anticuerpos neutralizantes del suero y los de las secreciones mamarias, se demostró que los animales vacunados tenían mayores anticuerpos neutralizantes en las secreciones mamarias en comparación con los animales de control [15]. Por lo tanto, según lo respaldado por Bjustrom-Kraft, et al. [15], si los anticuerpos neutralizantes séricos son altos, entonces la IgG y la IgA en las secreciones mamarias también pueden aumentar. Por lo tanto, la recolección de muestras de suero antes del traslado de las hembras a la sala de partos minimizaría el estrés y el dolor inducidos durante la recolección periparto de sangre y secreciones mamarias que pueden afectar negativamente a la cerda y a la camada [24]. Es importante que los usuarios comprendan cómo el valor de corte puede afectar la sensibilidad y especificidad diagnóstica de un ensayo. Aumentar el valor de corte disminuirá la cantidad de resultados falsos positivos y aumentará la cantidad de resultados falsos negativos. A la inversa, disminuir el valor de corte aumentará la cantidad de resultados falsos positivos y disminuirá la cantidad de resultados falsos negativos. Este conocimiento permite al usuario elegir qué valor de corte utilizar para su situación específica. Para este estudio, con base en los resultados de este estudio y los resultados anteriores publicados por Sarmento et al. [2], elegimos 80 %FR para el HTNT y una dilución de 80 FFN. En estos puntos de corte, la especificidad diagnóstica es mayor para HTNT (97%) en comparación con FFN (76%) y proporciona un valor predictivo positivo más alto para HTNT en comparación con FFN. También debe entenderse que los valores predictivos dependen de la prevalencia de la enfermedad [25,26]. En este estudio, según las muestras clasificadas la prevalencia fue del 32,1% (36 muestras positivas y 76 negativas). A medida que aumenta la prevalencia, el VPP también aumentaría porque es más probable que el animal analizado (muestra) sea positivo; a medida que la prevalencia disminuye, el VPN disminuiría. Las Figuras 3A y B ilustran esto para los ensayos HTNT y FFN en los distintos puntos de corte evaluados en este estudio siguiendo los métodos descritos por Erb [25]. Por lo tanto, al considerar los resultados del diagnóstico, se debe considerar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del ensayo y comprender la prevalencia dentro del grupo si se utilizan valores predictivos.

Figura 3. (A). Valores predictivos positivos para los ensayos HTNT (líneas negras) y FFN (líneas grises) en varios puntos de corte. Un límite de 90 no está representado para el HTNT. (B). Valores predictivos negativos de los ensayos HTNT (líneas negras) y FFN (líneas grises) en varios puntos de corte. No se representa un límite de 20 para el ensayo FFN.

El HTNT tiene una sensibilidad y especificidad diagnóstica superiores en comparación con el FFN. Al analizar los resultados de anticuerpos, esto es ideal para minimizar la cantidad de resultados falsos positivos y falsos negativos. Por ejemplo, cuando utilizamos un punto de corte de 80 para la FFN, observamos una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 76 %. Esto significa que habría pocos resultados falsos negativos pero habría una gran cantidad de falsos positivos. Si los resultados se clasifican falsamente como positivos, esto puede dar lugar a una interpretación errónea de que un rebaño tiene anticuerpos contra el PEDV cuando en realidad no los tiene. Dado que el HTNT tiene un diagnóstico y especificidades más altos en varios puntos de corte, es el ensayo preferible para la detección de anticuerpos contra PEDV. Los resultados de Sarmento et al. [2] mostró especificidades de diagnóstico mucho más altas para FFN y sensibilidades y especificidades comparables para HTNT. Estos ensayos de diagnóstico mostraron una concordancia moderada según la estadística kappa (κ). Una debilidad de κ es que una prueba debe considerarse el estándar de oro. Al comparar dos ensayos imperfectos, esto puede sesgar la interpretación de κ. Para este estudio, evaluamos el rendimiento diagnóstico de los ensayos junto con κ para determinar si la prueba concuerda pero puede tener una utilidad diferente. Una ventaja adicional del HTNT sobre el ensayo FFN es que los resultados del HTNT se calculan a partir de datos continuos en comparación con los valores categóricos (titulación) del FFN. La naturaleza continua de los datos HTNT permite una mayor discriminación de los resultados de las muestras para describir el estado de los anticuerpos neutralizantes de las cerdas. Según lo informado por Sarmento et al. [2], el HTNT tiene un tiempo de lectura más corto de una placa de 96 pocillos a menos de 4 minutos, lo que permite obtener resultados más rápido. Los anticuerpos sistémicos circulantes pueden contribuir a la protección de los lechones contra las infecciones por PEDV [21]. Sin embargo, no existe literatura sobre qué cantidad de anticuerpos neutralizantes circulantes en la cerda conferiría protección contra el PEDV a los lechones. Los niveles altos de anticuerpos circulantes conducen a concentraciones más altas en el calostro y brindan una mayor protección. Se justifica una evaluación adicional para determinar una asociación entre el momento durante la gestación para recolectar las muestras y la protección de los anticuerpos del calostro contra la infección por PEDV. La inmunidad lactogénica y mucosa es de vital importancia para la supervivencia de los cerdos expuestos al PEDV. Los anticuerpos se acumulan en la leche a través del eje intestino-MG-sIGA y pasan a los lechones para conferirles protección. Langel et al. [27] encontraron que las cerdas primerizas expuestas durante el segundo trimestre tenían niveles significativamente más altos de IgA, IgG y anticuerpos neutralizantes circulantes en comparación con las cerdas primerizas del primer y tercer trimestre. Además, Langel et al. [27] encontraron que los lechones de primerizas expuestas a PEDV en el segundo trimestre tenían una tasa de supervivencia del 100% en comparación con menos del 87,2% en otros trimestres, lo que sugiere que los niveles elevados de IgA, IgG y anticuerpos neutralizantes en suero están asociados con la supervivencia de los lechones frente a PEDV. Aunque los anticuerpos séricos no confieren protección contra el PEDV, los resultados de nuestro estudio sugieren que los niveles de anticuerpos neutralizantes en suero están asociados con la protección contra la infección por PEDV. Como informaron anteriormente Brown et al. [14], el PEDV se elimina en las heces después de la exposición homóloga y la vacunación de primerizas. El presente estudio utilizó muestras de los mismos animales que Brown et al. [14]. muestra además que el aumento de anticuerpos neutralizantes en suero después de la exposición a la exposición o la vacunación no influye en el patrón de eliminación del virus, ya que los niveles de anticuerpos aumentaron después de la exposición a la exposición y la vacunación. Se necesitan más estudios para confirmar si la cantidad de virus eliminado en las heces está asociada con la cantidad de anticuerpos neutralizantes presentes en el suero [21].

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

5. Conclusiones

La hipótesis nula de este estudio fue que no había diferencias en las características diagnósticas de dos ensayos de anticuerpos neutralizantes del PEDV, FFN y HTNT. Los resultados muestran que estos ensayos concuerdan moderadamente según la estadística kappa, mientras que existe una variación en sus características diagnósticas y valores predictivos según el punto de corte del ensayo. Estos ensayos podrían usarse para medir la respuesta a la vacunación de un rebaño. No rechazar la hipótesis nula muestra que HTNT es la prueba preferida para la detección de anticuerpos neutralizantes del PEDV en suero. Tras la vacunación tanto en el grupo PRE como en el POST, este estudio encontró que la mayoría de los resultados fueron positivos. En el grupo PRE, la variación reducida entre los resultados también siguió al desafío. Estos resultados sugieren que los profesionales porcinos podrían medir los anticuerpos neutralizantes del suero para determinar si las vacunas PEDV se están administrando correctamente en la piara.

Referencias

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasova, A.; Jung, K.; Xiao, S. Coronavirus. En Enfermedades de los cerdos, 11ª ed.; Zimmerman, JJ, Ed.; Wiley Blackwell: Hoboken, Nueva Jersey, EE. UU., 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​L.; Mora-Díaz, JC; Principal, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Detección de anticuerpos neutralizantes del virus de la diarrea epidémica porcina mediante citometría de imágenes de alto rendimiento. J. Veterinario. Diagnóstico. Investigando. 2020, 32, 324–328. [Referencia cruzada]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, ER; Sol, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pillatzki, A.; Calibre, P.; Schmitt, BJ; et al. Aparición del virus de la diarrea epidémica porcina en los Estados Unidos: signos clínicos, lesiones y secuencias genómicas virales. J. Veterinario. Diagnóstico. Investigando. 2013, 25, 649–654. [Referencia cruzada]

4. Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Evaluación de medidas de bioseguridad para prevenir la transmisión indirecta del virus de la diarrea epidémica porcina. Veterinario BMC. Res. 2017, 13, 89. [Referencia cruzada]

5. Canción, DS; Oh, JS; Kang, BK; Yang, JS; Luna, HJ; Yoo, SA; Jang, YS; Park, BK Eficacia oral de la cepa DR13 del virus de la diarrea epidémica porcina atenuada con células Vero. Res. Veterinario. Ciencia. 2007, 82, 134-140. [Referencia cruzada] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Respuestas y protección de anticuerpos específicos de isotipo sistémico y de mucosas en cerdos convencionales expuestos al virus de la diarrea epidémica porcina virulento o atenuado. Veterinario. Inmunol. Inmunopatol. 2002, 85, 85–97. [Referencia cruzada] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. Una comparación de la estructura histológica de la placenta en animales de experimentación. J. Toxicol. Patol. 2014, 27, 11-18. [Referencia cruzada] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. La transferencia de inmunoglobinas IgG, IgA e IgM del suero al calostro y la leche en la cerda. Inmunología 1973, 24, 157–162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR La actividad antiviral de los anticuerpos in vitro e in vivo. Adv. Inmunol. 2001, 77, 195–262. [Referencia cruzada]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Sol, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Calibre, P.; et al. Detección del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) y respuesta de anticuerpos en cerdos de engorde comerciales. Veterinario BMC. Res. 2016, 12, 99. [Referencia cruzada]

11. Oh, JS; Canción, DS; Yang, JS; Canción, JY; Luna, HJ; Kim, TY; Park, BK Comparación de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas con una prueba de neutralización sérica para el serodiagnóstico de la infección por el virus de la diarrea epidémica porcina. J. Veterinario. Ciencia. 2005, 6, 349–352. [Referencia cruzada]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Clemente, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Desarrollo de un ELISA indirecto, ELISA de bloqueo, inmunoensayo de microesferas fluorescentes y ensayo de neutralización de foco fluorescente para la evaluación serológica de la exposición a cepas norteamericanas del virus de la diarrea epidémica porcina. Veterinario BMC. Res. 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Stasko, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pillatzki, AE; Medidor, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; et al. Aislamiento y caracterización de virus de diarrea epidémica porcina asociados con el brote de enfermedad de 2013 entre cerdos en los Estados Unidos. J.Clin. Microbiol. 2014, 52, 234–243. [Referencia cruzada]

14. Marrón, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Eficacia de una vacuna comercial contra el virus de la diarrea epidémica porcina para reducir la duración de la eliminación viral en primerizas. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Respuestas de anticuerpos séricos y de secreción mamaria en cerdas primerizas inmunes a la diarrea epidémica porcina después de la vacunación contra la diarrea epidémica porcina. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. Universidad Estatal de Iowa. Procedimiento para la prueba de neutralización del foco fluorescente (FFN) del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV). Serología 2017, 1–7.

17. Universidad Estatal de Iowa. Procedimiento para la prueba de neutralización de virus de alto rendimiento (HTNT) del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV). Serología 2017, 1–16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, Manual de métodos de virología BWJ; Prensa académica: Londres, Reino Unido, 1996; pag. 21.

19. Thrusfield, M. Epidemiología veterinaria, 2ª ed.; Blackwell Science LTD: Hoboken, Nueva Jersey, EE. UU., 1995; pag. 479.

20. Lee, C. Virus de la diarrea epizoótica porcina: un virus porcino epizoótico emergente y reemergente. Virol. J. 2015, 12, 193. [Referencia cruzada]

21. Poonsuk, K.; Giménez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Carrión, L.; Magtoto, R.; Piñeyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; et al. ¿Los anticuerpos circulantes desempeñan un papel en la protección de los lechones contra el virus de la diarrea epidémica porcina? MÁS UNO 2016, 11, e0153041. [Referencia cruzada]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; An, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; et al. Localización de tejidos, diseminación, transporte de virus, respuesta de anticuerpos y transmisión por aerosol del virus de la diarrea epidémica porcina después de la inoculación de cerdos de engorde de 4- semanas de edad. J. Veterinario. Diagnóstico. Invertir. 2016, 28, 671–678. [Referencia cruzada]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, República Dominicana; Burrough, ER; Hoang, H.; Sol, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Medidor, PC; Stevenson, GW; et al. Caracterización de aislamientos del virus de la diarrea epidémica porcina US/Iowa/18984/2013 Infección en 1-lechones de un día privados de calostro obtenidos por cesárea. Veterinario. Patol. 2016, 53, 44–52. [Referencia cruzada]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Dolor y malestar provocado por el parto en vacas y cerdas. Aplica. Animación. Comportamiento. Ciencia. 2011, 135, 241–251. [Referencia cruzada]

25. Erb, HN La probabilidad previa (la mejor suposición previa a la prueba) afecta los valores predictivos de las pruebas de diagnóstico. Veterinario. Clínico. Patol. 2011, 40, 154-158. [Referencia cruzada] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, Prevalencia por RM. En StatPearls; StatPearls Publishing: Treasure Island, FL, EE. UU., 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Cerveza, KM; Vlasova, AN; Saif, LJ La etapa de gestación en la infección por el virus de la diarrea epidémica porcina en cerdos preñados afecta la inmunidad materna y la protección inmune lactogénica de los lechones lactantes neonatales. Frente. Inmunol. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]