Elaboración de perfiles integrales de formulaciones de secretoma a partir de células madre de líquido amniótico humano fetal y perinatal Parte 1

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Resumen:Anteriormente informamos que c-KIT más células madre derivadas de líquido amniótico htaman obtenidas de muestras sobrantes de diagnóstico prenatal de rutina en el segundo trimestre (hAFS fetal) están dotadas de un potencial paracrino regenerativo que impulsa efectos pro-supervivencia, antifibróticos y proliferativos. have también se puede aislar de muestras de desechos clínicos del tercer trimestre durante cesáreas programadas (hAFS perinatal), lo que ofrece una alternativa más accesible en comparación con hAFS fetal. No obstante, se sabe poco sobre el perfil paracrino de hAFS perinatal. Aquí proporcionamos una caracterización detallada del secretoma total de hAFS (es decir, la totalidad de los factores paracrinos solubles liberados por las células en el medio acondicionado, hAFS-CM) y las vesículas extracelulares ( hAFS-EVs) dentro de él, a partir de células perinatales fetales del segundo trimestre frente a células perinatales del tercer trimestre. Las hAFS fetales y perinatales se caracterizaron y se sometieron a preacondicionamiento hipóxico para mejorar su potencial paracrino. Las formulaciones de hAFS-CM y hAFS-EV se analizaron para determinar el contenido de proteínas y quimiocinas/citocinas, y la carga de EV se investigó más a fondo mediante secuenciación de ARN. El fenotipo de hAFS fetal y perinatal, junto con sus correspondientes formulaciones de secretoma, se superpusieron; sin embargo, la hAFS fetal mostró actividad de fosforilación oxidativa inmadura en comparación con las perinatales. El perfilado de su carga paracrina reveló algunas diferencias según la etapa gestacional y el precondicionamiento hipóxico. Ambas fuentes de células proporcionaron formulaciones enriquecidas con factores estimulantes neurotróficos, inmunomoduladores, antifibróticos y endoteliales, y el secretoma de hAFS fetal inmaduro se definió por un perfil provasculogénico, regenerativo, prorresolutivo y antienvejecimiento más pronunciado. El perfil de ARN pequeño mostró un enriquecimiento de microARN en la carga de hAFS-EV tanto fetal como perinatal, con un núcleo pro-resolución expresado de manera estable como firma molecular de referencia. Aquí confirmamos que hAFS representa una fuente atractiva de factores paracrinos regenerativos; la selección de formulaciones de secretoma de hAFS fetal o perinatal para futuras terapias paracrinas debe evaluarse teniendo en cuenta el escenario clínico específico.

Palabras clave:líquido amniótico; Células madre; efectos paracrinos; vesículas extracelulares; medio acondicionado con células; quimiocina; citocinas; proteómica; secuenciación de ARN; microARN

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1. Introducción

La medicina regenerativa se ha desarrollado recientemente como un campo emergente para proporcionar restauración funcional del tejido lesionado por medio de varias estrategias. A medida que los enfoques de ingeniería de tejidos han avanzado significativamente en los últimos años, la investigación de los efectos paracrinos de las células madre se ha intensificado cada vez más. Se ha demostrado ampliamente que el potencial terapéutico de las células madre trasplantadas está mediado principalmente por sus factores solubles secretados, que pueden orquestar un microambiente favorable a la regeneración en el tejido del huésped al tiempo que desencadenan la activación de mecanismos endógenos de recuperación funcional [1,2]. Por lo tanto, el secretoma de células madre, la totalidad de las moléculas tróficas paracrinas liberadas por las células, así como las vesículas extracelulares unidas a la membrana, se han propuesto cada vez más como un medicamento terapéutico innovador en múltiples estudios preclínicos independientes dirigidos a problemas cardiovasculares, neurológicos y/o inflamatorios. enfermedad. En consecuencia, las células madre pueden concebirse como fábricas biológicas para la explotación de su secretoma terapéutico al ofrecer tratamientos regenerativos listos para usar y listos para usar. Al aplicar una estrategia de este tipo basada en células, pero sin células, se pueden superar muchos aspectos limitantes asociados con la terapia celular canónica, al mismo tiempo que se garantizan los efectos beneficiosos.que es una cistancheEn esta perspectiva, las células estromales mesenquimales (MSC) han sido ampliamente probadas como células candidatas putativas. De hecho, las MSC y las células madre/progenitoras han sido diseñadas y/o estimuladas mediante diferentes estrategias de preacondicionamiento para mejorar su capacidad regenerativa y su potencial secretor [3,4] con un interés explícito en la relevancia biológica de sus vesículas extracelulares secretadas (EV).

Los EV son partículas de tamaño nanométrico delimitadas por una bicapa lipídica y secretadas activamente por todos los tipos de células. Los vehículos eléctricos incluyen muy pequeños (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500nm); funcionan como transportadores biológicos críticos de señalización intercelular al entregar su carga molecular desde una célula parental a una respondedora/objetivo [5,6]. Dado que su potencial paracrino peculiar en el ejercicio de efectos beneficiosos es comparable a sus células de origen, los vehículos eléctricos de células madre han surgido como opciones terapéuticas atractivas en modelos preclínicos de enfermedades, como isquemia, inflamación o lesión, como se revisa ampliamente en [{{3 }}]. Desde una perspectiva traslacional, además del potencial de modulación celular, la viabilidad del aislamiento y la autorrenovación elevada son aspectos clave de la fuente ideal de vehículos eléctricos terapéuticos y factores solubles. En tal escenario, las CMM fetales y perinatales pueden ofrecer una opción interesante dado su potencial proliferativo y su perfil de desarrollo inmaduro con características intermedias entre los progenitores somáticos embrionarios y adultos [10,11]. Las MSC fetales se pueden aislar de los anexos extraembrionarios durante la gestación como muestras sobrantes obtenidas durante el cribado prenatal (es decir, vellosidades coriónicas [12-14] y líquido amniótico [15,16]) u obtenidas como progenitores perinatales al nacer. de material de desecho clínico (es decir, membranas amnióticas y placentarias [17-21], componentes del cordón umbilical [22-24] y líquido amniótico a término [25,26]).

Cistanche puede antienvejecimiento

En particular, las células madre de líquido amniótico humano (hAFS) se han destacado como estrategias terapéuticas prometedoras en medicina regenerativa. y se ha demostrado que son ampliamente multipotentes in vitro e in vivo [16,27,28], contribuyen al linaje hematopoyético después del trasplante en el útero [29] y se injertan en órganos lesionados mientras ejercen efectos inmunomoduladores [26,30] y activan respuestas reparadoras endógenas, como se describe detalladamente en [31]. Nuestro equipo y otros han demostrado además que hAFS libera un secretoma altamente enriquecido con moléculas tróficas bioactivas capaces de dirigirse a diferentes mecanismos de reparación. Se ha informado que los factores paracrinos hAFS brindan estímulos favorables a la supervivencia con la extinción de la inflamación [32], proporcionan cardioprotección contra la isquemia prolongada [33,34] y la cardiotoxicidad [35], y estimulan la angiogénesis local con el reingreso al ciclo celular de los cardiomiocitos [ 34,36]. Dado que se ha demostrado que la mayoría de estos efectos se recapitulan con la administración de hAFS-EV sola, los estudios independientes se han centrado en diseccionar su perfil regenerativo frente a diferentes antecedentes patológicos, que incluyen lesión del músculo esquelético y cardíaco, enfermedad renal, osteoartritis, osteoporosis, enterocolitis necrosante y enfermedades neurodegenerativas. modelos [34,37-44].

Si bien la evidencia puede respaldar la traducción clínica de hAFS-EV para futuras terapias paracrinas, es importante considerar que la mayoría de estos estudios han investigado principalmente el potencial modulador de hAFS fetal obtenido durante la detección prenatal de Ⅱ trimestre De hecho, un perfil completo del secretoma de la contraparte perinatal (es decir, de cesáreas del tercer trimestre) aún no se ha explorado en detalle. Las hAFS perinatales del tercer trimestre han mostrado propiedades reguladoras inmunitarias distintivas en comparación con las del primer y segundo trimestre [26], al tiempo que mantienen un potencial regenerativo endotelial relevante [25].cuanta cistanche tomarEs de destacar que el informe reciente sobre la morfología heterogénea de hAFS fetal [45] ha proporcionado nuevos conocimientos sobre su perfil de expresión génica y tallo.bioflavonoidesEsto ha arrojado nueva luz sobre el valor regenerativo de las diferentes fracciones celulares de hAFS[46]. Por lo tanto, la caracterización integral de las diferentes subpoblaciones de hAFS está atrayendo cada vez más atención. Anteriormente informamos que una estimulación hipóxica y sin suero de 24 horas representa una estrategia eficaz para aumentar el potencial paracrino de la SAF fetal de segundo trimestre [34,35,37]. Dado que se sabe poco sobre la composición del secretoma del hAFS del tercer trimestre, aquí informamos la comparación exhaustiva de hAFS del Ⅱ versus el Ⅲ trimestre y sus fracciones de secretoma (incluidos los hat-EV), para abordar la influencia de la etapa gestacional y la célula hipóxica. preacondicionamiento de las características de la célula y el secretoma.

2. Resultados

2.1.Perinatal hAFS presenta una coincidencia fenotípica cercana a Fetal has

No se apreció ninguna diferencia estadísticamente relevante en la edad del donante entre las muestras de líquido amniótico del trimestre II fetal y del trimestre perinatal III. c-KIT* hAFS fetal (f-hAFS de muestras de líquido amniótico del segundo trimestre) y c-KIT* hAFS perinatal (p-hAFS de desechos clínicos de líquido amniótico del tercer trimestre) confirmaron características similares con morfología ovalada y similar a fibroblastos (Figura 1A) y fenotipo estromal mesenquimatoso (datos no mostrados), como se informó anteriormente [16,25]. Tanto f-hAFS como p-hAFS cultivados in vitro hasta el paso 5 mostraron niveles insignificantes de senescencia a partir de la activación de la - -galactosidasa asociada a la senescencia (SA- -Gal) en aproximadamente el 4 % de las células (Figura 1B) . Tanto f-hAFS como p-hAFS presentaron un alto nivel de coexpresión de los marcadores mesenquimales CD107a y CD146, que se ha informado recientemente que definen un fenotipo altamente secretor[47]. Las células CD107at CD146* representaron la mayoría de la población f-hAFS (aproximadamente el 64 por ciento,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Figura 1. Valoración fenotípica de los órganos fetales y perinatales. (A) Imágenes representativas de hAFS fetal (f-hAFS, panel izquierdo) y perinatal hAFS (p-hAFS, panel derecho) cultivadas in vitro en condiciones estándar; barra de escala: 200 um. (B) Análisis del marcador senescente beta-galactosidasa (SA- -Gal, en azul) mediante tinción citoquímica en f-hAFS y p-hAFS después de 5 pases en cultivo; las imágenes representativas se reportan en el panel izquierdo, barra de escala: 200 um. El porcentaje correspondiente de células/campo positivas para -Gal se informa en el gráfico del panel derecho (f-hAFS: 4.12±0.58 por ciento y p-hAFS: 3.88±2.10 por ciento; p=0.1424,n{ {24}} experimentos). (C) Inmunofenotipo de hAFS que expresa marcadores mesenquimales CD146 y CD107a. Gráficos representativos de citometría de flujo de f-hAFS y p-hAFS (panel izquierdo) y los valores correspondientes referidos a células CD107a plus CD146 plus doblemente positivas; CD107a más CD146* f-hAFS: 63,68±5,82 %,*p=0,016 en comparación con el 36,32±5,82 % restante de f-hAFS (otro); CD107 en CD146 más p-hAFS: 52,07±6,76 % con el restante47. 93±56,76 por ciento p-hAFS (Otro); CD107a más CD146 más f-hAFS frente a CD107a más CD146 más p-hAFS p=0.2403,n=4 experimentos. Otros: monto total de CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS y CD107at CD146-hAFS restantes. Todos los valores se expresan como media ± sem de experimentos independientes. SA- -Gal:- -galactosidasa asociada a la senescencia.

2.2.La hAFS fetal muestra un metabolismo diferente al de la hAFS perinatal

Para evaluar si la etapa gestacional puede influir en el metabolismo mitocondrial, se analizaron f-hAFS y p-hAFS en condiciones estándar de cultivo in vitro mediante análisis bioquímicos. La evaluación del metabolismo aeróbico mostró que la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la síntesis de ATP fueron menores en f-hAFS con respecto a p-hAFS, ambos estimulados con piruvato más malato (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. El preacondicionamiento hipóxico no afecta la viabilidad fetal y perinatal y mantiene su actividad secretora

Para definir las formulaciones de secretoma hAFS, las células se cultivaron en condiciones sin suero para evitar cualquier contaminación con FBS. Anteriormente demostramos que las condiciones de cultivo hipóxico de 24 h sin suero (SF) y 1 por ciento de O2 no alteraron significativamente la viabilidad de hAFS fetal de Ⅱ trimestre (f-esperanza), mientras que apoyaron la liberación de factores paracrinos regenerativos en su medio condicionado por células (hAFS-CM) y en vesículas extracelulares (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Aquí, además de perfilar las fracciones de secretoma p-hAFS por primera vez, evaluamos si p-han presentado un comportamiento similar bajo el mismo régimen de preacondicionamiento, utilizando la condición de cultivo normóxico como control. La viabilidad de f-hAFS y p-hAFS se analizó después de 24 h en las siguientes configuraciones: condición normóxica (20 por ciento de O2) en medio de cultivo de control completo (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo y Ctrl p-hAFSnormo), una condición normóxica en medio SF (SF f-hAFSnormo y SF p-hAFSnormo), condición hipóxica (1 por ciento de O2) en medio de control completo (Ctrlf-tiene hipo y Ctrl p-hAFSnypo) y condición hipóxica en medio SF (SF f-tiene hipo y SF p -tiene hipo, Figura 3A). Confirmamos que la viabilidad de f-has no se alteró en condiciones Ctrl y SF y bajo estimulación hipóxica, con más del 80 por ciento (hasta casi el 88 por ciento) de las células totales sin verse afectadas. Las células apoptóticas tempranas y tardías oscilaron entre ca. 13 por ciento a 18 por ciento en condiciones SF, sin ninguna relevancia estadísticamente significativa. Asimismo, la viabilidad perinatal estuvo en el rango del 80-92 por ciento, y las células apoptóticas tempranas y tardías representaron hasta el 18 por ciento en condiciones de SF. p-hAFS se vio influenciado marginalmente solo bajo las condiciones combinadas de hipoxia y SF; de hecho, aunque el preacondicionamiento no influyó en la supervivencia celular cuando se cultivó p-hAFS en un medio completo, la condición SF correspondiente mostró un aumento de aprox. 4- veces (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Figura 2. Caracterización metabólica de SAF fetal y perinatal. (A) Tasa de consumo de oxígeno (OCR), síntesis de ATP a través de F1-F.ATP sintasa y relación P/O en f-have y-have en presencia de piruvato más malato (P/M) o succinato (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistancheLa comparación del porcentaje de inhibición de OCR y la síntesis de ATP en f-and-hAFS debido a los inhibidores indicados anteriormente se informa en el panel inferior B. Para experimentos de OCR: hAFS más Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Luego evaluamos el rendimiento de las fracciones de secretoma obtenidas de f-hAFS versus p-hAFS en función del enriquecimiento de proteínas. El secretoma total tiene, ya que la totalidad de los factores paracrinos secretados por células, está representado aquí por el hAFS-CM. La concentración de proteína de f-hAFS-CM y p-hAFS-CM en medio SF después del preacondicionamiento de células hipóxicas frente a la condición normóxica de control como base (es decir, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo y p -hAFS-CMHypo,) se evaluó mediante ensayo BCA y se midió según 10§ células.cistanchLos resultados adquiridos sugirieron que f-has-CM y p-hAFS-CM mostraron una tendencia positiva igual en el enriquecimiento de proteínas luego del cebado hipóxico (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 células de grado; p-hAFS-CMNypo∶182.30±29.71 ug/10 células de grado） sobre sus contrapartes normóxicas (f-hAFS-CMnormo:105.50±19.89 ug/10 células de grado; p- hAFS-CMhypoi 91.12±24.39 ug/10 grados de células） Del mismo modo, la concentración de proteína superficial de hAFS-EVs se midió en f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo y p-hAFS-EVShypo Los EV mostraron un rendimiento comparable cuando se obtuvieron de f-hAFS o p-hAFS. En cuanto a las formulaciones de hAFS-CM, se apreció una tendencia positiva en el aumento del contenido de proteínas en f-hAFS-EV y p-hAFS. Los EV se apreciaron después de la estimulación hipóxica durante el condición normóxica correspondiente （f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10 grados de células y p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10 grados de células;f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/10 grados de células y p -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31 ug/10 grados de células, Figura 3C).

2.4. EV de liberación de hAFS fetal y perinatal con morfología análoga y distribución de tamaño

El análisis morfológico por microscopía electrónica de transmisión (TEM) aumentó la alta proliferación secretora de EV tanto de f-hAFS como de p-hAFS (Figura 4). Investigamos más a fondo el tamaño y el área de f-hAFS-EV y p-hAFS-EV (Figura 4B) después del preacondicionamiento hipóxico en comparación con la línea de base normóxica. Fetal y perinatal han liberado vehículos eléctricos de tamaño heterogéneo, en el rango de 40-250 nm, por lo tanto, incluyen exosomas/pequeños vehículos eléctricos y microvesículas/vesículas que se desprenden. El tamaño medio de los EV/campo en los diferentes grupos fue comparable, los EV-hAFS fetales medidos 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) y perinatales medidos 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, Figura 4B, panel izquierdo). En cuanto al rendimiento, hAFS estimulado bajo hipoxia mostró una tendencia positiva en el aumento de la cantidad de EV pequeños, aunque este aumento no fue estadísticamente significativo. f-hAFS-EVStypo midió 40-70 nm, que era casi el doble en comparación con su contraparte normóxica. Perinatal-has-EVSHypo que midió 40-70 nm, 70-100 nm y 100-130 nm fueron casi el triple de las obtenidas en cultivo normóxico (Figura 4B).

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) mostró un número elevado de partículas en las preparaciones de f-hAFS-EV y p-hAFS-EV, y confirmó el aumento de EV en las muestras hipóxicas, como también se observó en los análisis anteriores (f-hAFS-EV). EVsnormo: 182±0.10'partículas/10 grados de celdas f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 grados de partículas/10 grados de celdas ;p-hAFS-EVsnormo: 2,43 ± 0,80 × partículas de 10 grados/células de 10 grados; p-hAFS-EVshipo: 3,05 ± 0,62 × partículas de 10 grados/células de 10 grados, Figura 4C).

Figura 4. Caracterización morfológica de las VE fetales y perinatales. (A) Imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de f-hAFS y p-hAFS (panel izquierdo superior e inferior, respectivamente, con flechas negras que indican cuerpos multivesiculares intracitoplasmáticos con pequeños EV/exosomas dentro de ellos), y de f -hAFS-EVs y p-hAFS-EVs (panel superior e inferior derecho, respectivamente) liberados en condiciones libres de suero y bajo preacondicionamiento normóxico versus hipóxico (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; y f-hAFS-EVshypo, respectivamente), barras de escala: 200 nm. (B) Panel izquierdo: análisis TEM de la distribución de tamaños de hAFS-EV; panel derecho: se consideró la distribución del número f-hAFS-EV y p-hAFS-EV por intervalos de tamaño de campo desde 40 nm hasta 250 nm; los valores se expresan como media ± sem de n=3 experimentos independientes. (C) Análisis de seguimiento de nanopartículas para el tamaño y la distribución de hAFS. Panel izquierdo: imagen representativa de la salida gráfica; panel derecho: concentración de hAFS-EVs medida como partículas de 10 grados por células secretoras de 10 grados; nm: nanómetro; mL: mililitro.

2.5.La caracterización proteómica de hAFS fetal versus perinatal destaca las diferencias en la composición de su secretoma según la edad gestacional y el precondicionamiento hipóxico

La caracterización proteómica de las formulaciones de secretoma de f-hAFS y p-hAFS se realizó mediante una plataforma sin etiquetas de escopeta, basada en el acoplamiento de cromatografía de nano líquidos y espectrometría de masas de alta resolución (nLC-HRMS). Se adquirieron cuarenta y ocho perfiles proteómicos mediante el análisis por duplicado de tres réplicas biológicas de hAFS-CM y have-EV de f-hAFS y p-hAFS sometidos a preacondicionamiento de células hipóxicas en comparación con la condición normóxica como control. Se identificaron un total de 4179 grupos de proteínas distintos con al menos un péptido único y con pesos moleculares que oscilan entre 2 y 3900 kDa y puntos isoeléctricos entre 3,6 y 13. Se observó una expresión de proteína promedio más alta en hAFS-EV en comparación con hAFS-CM . El alineamiento de todas las listas de proteínas obtenidas se realizó sobre la base de las proteínas identificadas. Para cada condición experimental, se creó una lista única normalizando y promediando[50] los valores de coincidencia del espectro de péptidos (PSM) atribuidos a las proteínas, que representan el número de espectros de masas asignados a cada uno e indirectamente representan su abundancia en las muestras. La lista completa de proteínas identificadas en hAFS-CM y formulaciones have-EV se informa en la Tabla S1.

La aplicación del análisis discriminante lineal (LDA[51]) sobre esta lista maestra permitió la extracción de proteínas estadísticamente significativas (Fratio Mayor o igual a 4.5 y** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 en las formulaciones hAFS-CM y have-EV consideradas por separado. Si bien alrededor del 69,5 % y el 69,9 % de las proteínas se compartieron entre las condiciones hAFS-EV y hAFS-CM, respectivamente, el contenido restante apareció exclusivo en diferentes proporciones, que oscilaron entre el 3,7 % y el 13,4 %, entre las formulaciones.

Para examinar cuantitativamente los cambios proteómicos, se realizó un análisis diferencial sin etiqueta utilizando el software MAProMa casero y aplicando dos algoritmos, DAve (Promedio diferencial) y DCI (Índice de confianza diferencial, que representa la relación y la confianza en la expresión diferencial, respectivamente), en los PSM de cada proteína individual entre los dos términos comparados. Usando filtros estrictos para DAve y DCI para maximizar la confianza de identificación y para considerar proteínas con una variación mayor que un cambio de 1,5 veces, comparaciones por pares de f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM y de f-hAFS-EV versus Los p-hAFS-EV se realizaron de acuerdo con la etapa gestacional de la célula. Se encontraron un total de 58 y 109 proteínas expresadas diferencialmente en los compartimentos has-CM y have-EV anteriores, respectivamente (Figura S1B, C para detalles seleccionados y Tablas S2-S3 en forma extendida). Entre estas, 30 proteínas resultaron reguladas al alza en f-hAFS-CM y 28 estaban reguladas al alza en p-hAFS-CM (Figura S1B); Del mismo modo, 44 ​​proteínas distintas dieron como resultado una regulación positiva en f-have-EV y 65 se regularon positivamente en p-hAFS-EV (Figura S1C). En particular, las proteínas que dieron como resultado una regulación al alza en f-have deben considerarse reguladas a la baja en p-has y viceversa.

se informan los valores; consulte la Tabla S2 para ver la lista completa y los parámetros detallados de las proteínas informadas. (C) Análisis de enriquecimiento de procesos biológicos de proteínas identificadas con una frecuencia de al menos 2 en hAFS-CM fetal (panel izquierdo) y perinatal have-CM (panel derecho) según el precondicionamiento hipóxico celular. Con base en la herramienta FunRich, los términos de ontología de genes se muestran en gráficos de barras que informan el porcentaje de genes enriquecidos para cada categoría (barras rosas para-tener-CMnormo, barras moradas para f-hAFS-CMhy o barras azul claro para p-hAFS-CMnormo, y bolas azules para p-hAFS-CMhypo).comprar cistancheSolo términos de ontología génica con Bonferroni corregidos con *p<0.05 are="">

Este artículo está extraído de Int. J. Mol. ciencia 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms