Extractos de flores como tintes multifuncionales en la industria cosmética Parte 2

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Muchos productos naturales se utilizan en los sistemas médicos tradicionales para tratar el alivio de los síntomas del dolor y la inflamación, [61] Por lo tanto, se investigó el efecto de los extractos analizados sobre la inhibición de la actividad de la lipoxigenasa y la proteinasa. En el rango de concentraciones analizadas (100-500 ug/mL), el extracto de agua CTE mostró la mayor capacidad para inhibir la proteinasa (Figura 4) (al 57 por ciento para una concentración de 500 ug/mL). Esta actividad se comparó con el conocido inhibidor de proteinasa diclofenaco, utilizado como control (alrededor del 89 por ciento de inhibición en la concentración más alta probada). Sin embargo, se obtuvieron resultados similares para los extractos GGE y KTE (alrededor del 56 % y 53 %, respectivamente, para las concentraciones más altas). Se observó una inhibición de proteinasa más baja para los extractos de PRE y PGE. En una prueba adicional que mide la capacidad de inhibir la lipoxigenasa, los extractos acuosos de KTE y CTE muestran los valores más altos (alrededor de 67 por ciento y 64 por ciento de inhibición, respectivamente, para una concentración de 500 ug/mL). También se usó diclofenaco como control. Los extractos de GGE, PGE y PRE también presentan valores significativamente altos (60 por ciento, 57 por ciento y 54 por ciento, respectivamente). También se observó que la capacidad de inhibir las enzimas LOX y proteinasa depende de la concentración del extracto (Figura 5).

Estudios previos indicaron que muchos compuestos polifenólicos contribuyeron significativamente a las actividades antiinflamatorias de muchos extractos de plantas[62]. Los estudios han demostrado la participación de ROS en el proceso inflamatorio, y los compuestos fenólicos como el ácido gálico y quínico pueden bloquear el metabolismo del ácido araquidónico al inhibir la actividad de la actividad de la lipoxigenasa, o pueden servir como radicales libres reactivos depuradores, que se producen durante el ácido araquidónico. [63]. Los resultados obtenidos por BenSaad et al. indican que el ácido elágico, el ácido gálico y la punicalagina A&B aislados de P. granatum inhibieron la producción de óxido nítrico (NO), prostaglandina E2 (PGE2) e interleucina 6 (IL-6) en lipopolisacáridos (LPS) inducidos por RAW 267.4 macrófagos. Si estos compuestos funcionan como agentes únicos o tienen un efecto sinérgico sigue siendo una pregunta [64]. Dado que muchos flavonoides muestran propiedades antiinflamatorias, debido a su comportamiento antioxidante intrínseco, se les ha implicado en diversos trastornos inflamatorios.método de extracción de flavonoides pdf,En particular, la quercetina es la molécula más interesante porque interfiere con rutas biológicas específicas. Además, los estudios sugieren que puede reducir el proceso inflamatorio involucrado en varios modelos a través de diferentes mecanismos[65]. En particular, la proteína quinasa activada por AMP y la vía histona/proteína desacetilasa (AMPK/SIRT1) dan como resultado un manejo de la inflamación más interesante. Por lo tanto, los activadores de AMPK pueden reducir la inflamación de los macrófagos. La quercetina y otros flavonoides, como activadores de AMPK y SIRT1, pueden reducir la inflamación al interferir con esta vía [66]. También se ha demostrado que la quercetina y los monoglucósidos de quercetina ejercen un mayor potencial de inhibición de la LOX [67] Nair et al. han demostrado propiedades antiinflamatorias del extracto de KTE mediante la evaluación de la presencia de flavonoles con el resto de quercetina como manghaslin Qu 3-[2G] ramnosilrutinosido, Qu 3-O-dirhamnosido y rutina. Estas moléculas han mostrado una fuerte inhibición de la actividad COX-2 y una supresión parcial de ROS. En general, los polifenoles presentes en CTE mostraron propiedades antiinflamatorias en la inflamación inducida por LPS en células de macrófagos RAW 264.7 [68].

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2.5.Evaluación de citotoxicidad

En la creación de nuevas materias primas cosméticas, una de las propiedades más importantes es su seguridad de uso. Las sustancias destinadas a uso en cosmética deben ser no tóxicas, especialmente en relación con las células de la piel, como los queratinocitos y los fibroblastos. Se han utilizado dos tipos de pruebas para determinar la toxicidad de los extractos analizados en células HaCaT y BJ.flavonoidesEl primer estudio, utilizando el ensayo de captación de rojo neutro, nos permite evaluar la viabilidad de las células tratadas con los extractos analizados. Este tinte ingresa a los lisosomas de una célula viva y se libera en el citoplasma de las células muertas. Se observó (Figura 6) que el extracto de CTE tiene la mayor capacidad para aumentar la proliferación tanto de las células HaCaT como de las BJ. En comparación con el control, este extracto alcanzó valores un 20 % y un 40 % más altos que el parámetro probado a la concentración de 250 μL/mL (HaCaT y B) y 500 μL/mL (células BJ), respectivamente. El extracto de GGE a concentraciones de 100 y 250 μL/mL y el extracto de KTE a la concentración de 500 μL/mL se caracterizaron por un pequeño efecto tóxico sobre las células BJ. Otros extractos tuvieron una influencia positiva en la viabilidad de estas células. Los extractos de PRE y PGE a una concentración de 100 μL/mL no difirieron significativamente del control y aumentaron la proliferación de células BJ en aproximadamente 10-15 por ciento en comparación con el control a la concentración de 250 y 500 μL/ ml. En el caso de los queratinocitos, no se observó disminución de la viabilidad celular. Para los extractos de PGE, PRE y CTE, se observó un aumento en la proliferación con el aumento de la concentración, mientras que se demostró una disminución en la viabilidad celular con el aumento de la concentración de los extractos de KTE y GGE.

La segunda prueba realizada para determinar la citotoxicidad de los extractos ensayados fue la prueba de resazurina (Alamar Blue). Se ha demostrado (Figura 7) que la viabilidad de las células depende de la concentración del extracto con el que se incubaron las células. En el caso de los fibroblastos, los extractos PRE, PGE y CTE provocan una mayor proliferación celular con un aumento de su concentración. En la concentración más alta analizada (500 μL/mL), se observó una proliferación un 20 % mayor en comparación con el control.usos de hesperidinaEn el caso de los extractos de KTE y GGE, se observó una disminución de la viabilidad celular con un aumento de la concentración de los extractos. Estos extractos mostraron un pequeño efecto tóxico sobre BJ a concentraciones de 250 y 500 μL/mL. En el caso de los queratinocitos se observó un efecto similar de los extractos analizados sobre las células de la piel, pero su capacidad de proliferación no fue tan fuerte como en el caso de los fibroblastos. La mayor capacidad para aumentar la proliferación de queratinocitos se observó para el extracto de CTE en todo el rango de concentraciones analizadas. Valores similares se obtuvieron para el extracto PRE a una concentración de 250 μL/mL y para el extracto PGE a una concentración de 500 μL/mL. El extracto KTE mostró un efecto tóxico significativamente mayor sobre las células HaCa que el extracto GGE.

Los extractos analizados no se han probado exhaustivamente antes en cuanto a su toxicidad para las células de la piel. Existen pocos estudios de citotoxicidad sobre extractos o sus principales principios activos, especialmente frente a células cancerosas. Los autores de estudios anteriores indicaron que estos extractos generalmente no tienen un efecto tóxico sobre las células de la piel, y su capacidad para aumentar la proliferación celular se atribuye con mayor frecuencia al alto contenido de polifenoles, antocianinas y flavonoides [45,69-73 ]. Algunos autores también indicaron que los componentes individuales contenidos en los extractos pueden presentar un efecto tóxico sobre las células de la piel, mientras que el extracto en su conjunto no lo hace. Ali Hiyazi et al. [69] mostró que los alcaloides extraídos de Punica granatum son tóxicos para las líneas celulares normales y cancerosas, mientras que el extracto completo es menos tóxico. El estudio de Nasiri et al. [70] indica que el extracto de flor de Punica granatum puede ser útil para acelerar el proceso de cicatrización de heridas debido a su capacidad para aumentar la proliferación de células de la piel. En nuestra investigación anterior [45], se demostró que los extractos hidroetanólicos obtenidos de las plantas analizadas se caracterizaron por una mayor capacidad para aumentar la proliferación de células BJ, y los extractos KTE y GGE mostraron un menor efecto tóxico sobre estas células. .imperio perdido cistancheEl efecto de los extractos de agua-etanol sobre las células HaCaT fue similar al de los extractos acuosos puros, pero en el caso de los extractos obtenidos con etanol se observaron propiedades de proliferación ligeramente más favorables que en el caso de los extractos acuosos. Las diferencias entre la composición de ambos tipos de extractos analizados pueden provocar diferencias en su toxicidad. Como se muestra, los extractos de agua no son tan ricos en ingredientes bioactivos como los extractos de agua y etanol. Las mayores diferencias se observan en el contenido de rutina e isoquercitrina.

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2.6.Determinación del Factor de Protección Solar

Los efectos desfavorables de la radiación UV en la piel pueden manifestarse tanto poco tiempo después de la exposición como incluso años después. La radiación solar tiene un efecto inmunosupresor que acelera el proceso de envejecimiento de la piel con todas las consecuencias asociadas al mismo, incluido el aumento de la carcinogénesis[74]. Las tendencias observadas actualmente indican una necesidad creciente de desarrollar productos que se caractericen no solo por un nivel muy alto de seguridad en el uso, sino también por su multifuncionalidad, en el sentido de que los productos contarán con la protección antirradiación de la piel con un alcance de acción más amplio que el utilizado hasta ahora. Algunas sustancias vegetales juegan un papel inestimable en este aspecto, que es capaz no solo de proporcionar protección solar sino también de neutralizar los efectos negativos ya existentes de las radiaciones solares sobre la piel [75-77]. La investigación realizada mostró que los extractos de plantas analizados PRE, PGE, KTE, CTE y GGE se caracterizan por altos coeficientes SPF.

El análisis de los coeficientes (SPF) se realizó para los extractos acuosos obtenidos de las plantas antes mencionadas a concentraciones de 10 y 50 mg/mL. Para cada planta investigada, una mayor concentración del extracto resultó en un valor significativamente mayor de SPF.fracción de flavonoides purificada micronizada 1000 mg usosLa comparación entre extractos muestra que los valores más altos de SPF se observaron para el extracto KTE, lo que se mantiene para ambas concentraciones investigadas. Otra observación interesante es que incluso en las concentraciones más bajas investigadas, el extracto de KTE todavía exhibió un SPF alto, mientras que los valores de otros extractos disminuyeron notablemente. Esto queda claro cuando analizamos en qué medida el resultado de KTE fue superior al de otros extractos. Para la concentración de 50 mg/mL, el SPF fue mayor por el factor de 1,2 (en comparación con PGE, CTE) al factor de casi 1,9 (en comparación con PRE, GE). El mismo cálculo para la concentración de 10 mg/mL dará factores de 1,4 (en comparación con PGE) a factores del rango 2-3 (en comparación con CTE, GGE), incluso hasta factores como 10 en comparación con PRE. Al centrarse en el extracto de KTE, se puede notar que una concentración decreciente del extracto por el factor 5 (de un valor de 50 mg/mL al valor de 10 mL/mL) resulta en una disminución del valor SPF por el factor 3.4 , lo que significa que el SPF disminuye más lentamente que la concentración. Lo anterior demuestra que el extracto de KTE puede ser eficiente incluso cuando se aplica en bajas concentraciones (Figura 8).

2.7. Mediciones de pérdida de agua transepidérmica (TEWL) y de hidratación de la piel

Debido a la amplia gama de actividad biológica y farmacológica de las materias primas vegetales, las sustancias vegetales contenidas en los extractos tienen un impacto significativo en el estado de la piel. En particular, estamos hablando aquí de la influencia de los metabolitos secundarios en el estado de nuestra piel [78,79].

En la siguiente etapa de la investigación se realizaron los análisis de hidratación y TEWL. Se evaluó el efecto de los extractos probados sobre la piel. Las mediciones se realizaron en dos intervalos de tiempo de 60 y 360 min para la concentración de extracto de 10 mg/mL. Para la medición de TEWL, la mayor disminución porcentual se mostró para el extracto de PGE, donde el valor de control de 13,9 cayó a 8,71, lo que resultó en una disminución porcentual del 37 por ciento. También vale la pena analizar el extracto de KTE desde esa perspectiva, ya que este fue el que exhibió los valores más altos de SPF. Para el extracto de KTE, el valor de control de TEWL disminuyó al valor de 10,22, lo que significa una disminución del 26 por ciento (Figura 9A).

Sin embargo, en el caso de la segunda medición del instrumento, se demostró que los extractos analizados provocan un aumento de la hidratación en relación a la muestra control, tanto a los 60 como a los 360 min.

Como resultado de los análisis, se encontró que los extractos de PRE, PGE, KTE, CTE y GGE analizados aumentan la hidratación de la piel (Figura 9B). Se observó un aumento en las propiedades humectantes junto con un aumento en la concentración del extracto en las preparaciones. Las propiedades humectantes más fuertes se han observado para los extractos de PRE y PGE que equivalen al 32 por ciento y al 29 por ciento después de 60 minutos y al 21 por ciento y al 22 por ciento después de 360 ​​minutos. Sin embargo, se encontró el nivel más bajo de hidratación de la piel para el extracto de KTE, que equivale al 18 por ciento después de 60 minutos y cerca del 3 por ciento después de 360 ​​minutos.

2.8. Análisis de aplicaciones

2.8.1. Determinación de los parámetros de color de los extractos

Debido a su color natural, los ingredientes activos de las flores de las plantas se pueden utilizar como tintes naturales en muchos productos comerciales, como cosméticos y alimentos. Se realizó análisis de color para los extractos obtenidos (Cuadro 5).

Se encontró que los extractos PRE, KTE y CTE tienen el mayor potencial como pigmentos cosméticos naturales. Sin embargo, los valores más altos de croma (C*) se observaron para CTE. Con base en el valor del parámetro de grado h, se encontró que es el color amarillo de este extracto el que se observa y es visible a simple vista. En el caso de los extractos KTE y PRE, a pesar del bajo valor de C* (2,8), el color de estos extractos se puede ver claramente a simple vista y se especificó como rojo-púrpura para el extracto PRE y azul-violeta para el extracto KTE. Los extractos acuosos de PGE y GGE eran de color rojizo y ligeramente anaranjado, y los valores de croma obtenidos estaban en el nivel de 1,3. Para este color, estos valores no fueron significativamente perceptibles a simple vista.

2.8.2. Determinación de los Parámetros de Color de Cosméticos Basados ​​en los Extractos

En los últimos años ha surgido una fuerte necesidad de desarrollar nuevos colorantes de origen natural, especialmente en la industria alimentaria y cosmética. En comparación con los tintes obtenidos sintéticamente, pueden tener un menor impacto negativo en la salud humana y el medio ambiente [80]. Los extractos obtenidos se utilizaron en la formulación de un líquido desmaquillante micelar modelo. En cada formulación, se utilizaron en una concentración del 1 por ciento. Los resultados de los parámetros de color de los cosméticos modelo se presentan en la Tabla 6.

Se observó que la adición de extractos de agua al 1 por ciento de PRE, PGE, CTE y GGE influyó significativamente en el color del desmaquillador. Cada muestra era claramente visible a simple vista en color. El extracto de PRE cambió el color del cosmético a naranja, y el extracto de PGE, CTE y GGE lo cambió a amarillo.

La posibilidad de utilizar los extractos analizados como colorantes potenciales se confirma por los valores relativamente altos de △Desmaquillante con extracto/desmaquillante base, lo que indica un cambio significativo en el color de los cosméticos modelo con la adición del extracto comparado. a la muestra base (sin adición de los extractos). Los datos de la literatura [73] muestran que si los valores de AE ​​son superiores a 5, el color es percibido por la víspera desnuda y percibido como un efecto de color. Para los desmaquillantes que contienen extractos de PRE, KTE y CTE, se obtuvieron valores de AE ​​de 8,83, 9,17 y 8,14, respectivamente. En el caso de los productos con los extractos de PGE y GGE, no se observó influencia significativa del extracto sobre el color del preparado. Los valores de AE ​​están en el rango de 2.51-2.82. Esto significa que la diferencia de color solo es perceptible para un observador experimentado [80,81].

3. Materiales y Métodos

3.1. Material Vegetal y Procedimiento de Extracción

El material vegetal utilizado en la investigación fueron flores secas de P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. y G.globosa L., las cuales se obtuvieron de la herbolaria local. . El proceso de extracción se realizó en un baño ultrasónico (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlín, Alemania), el cual se llevó a cabo utilizando el método descrito por Yang et al.[82]. Se utilizaron 10 gramos de flores secas y 100 g de agua para preparar extractos acuosos de las plantas ensayadas. El proceso se llevó a cabo durante 20 min a temperatura ambiente. Los extractos obtenidos fueron luego recolectados y filtrados tres veces a través de papel filtro Whatman No. 1. Después de la filtración, los extractos se evaporaron a presión reducida a 40 grados. Se preparó una solución madre a una concentración de 100 mg/mL a partir de los extractos secos y se almacenó en la oscuridad a 4 grados hasta su posterior análisis. Se utilizan las siguientes abreviaturas: PRE: extracto de Papaver rhoeas, PGE: extracto de Punica granatum, GGE: extracto de Gomphrena globosa, CTE: extracto de Carthamus tinctorius, KTE: extracto de Clitoria ternatea.

3.2. Determinación de Compuestos Bioactivos por HPLC-UV-ESI-MS

Los extractos obtenidos se analizaron para determinar sus principales compuestos bioactivos mediante un HPLC (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, EE. UU.), acoplado con un espectrómetro de masas (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Canadá), equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) y una trampa de masa de iones de triple cuadrupolo analizador. La separación cromatográfica se logró con un sistema de gradiente de fase inversa. Además, se adquirió de Phenomenex una columna cromatográfica de 100 × 4,6 mm Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A con cadenas laterales de iso-butilo y con fase estacionaria de protección terminal TMS utilizada con una precolumna de composición similar y se mantuvo a 30 grados. . Se usó un sistema de disolvente binario que comprendía ácido fórmico acuoso al 0,1 por ciento (o/v) como disolvente A y metanol como disolvente B en modo de gradiente durante 19,1 min del tiempo de ejecución. Las condiciones de elución aplicadas fueron las siguientes: 0.0-15.0 min 25-100 por ciento B, 15.0-17.0 min 100 por ciento B, 17.0-17.1 min 100-25 por ciento B, 17.1-19.1 min 25 por ciento B. El caudal de la fase móvil fue de 0,6 ml/min y el volumen de inyección fue de 10 μL. El eluyente se controló mediante un espectrómetro de masas de iones por electropulverización (ESI-MS) en modo de iones negativos y se escaneó desde m/z 20 hasta 1000 Da. Para el análisis de cuantificación, el detector MS de triple cuadrupolo estaba trabajando en modo de escaneo de monitoreo de reacción múltiple (MRM). Las condiciones óptimas del analizador de masas y la selección de iones de producto para compuestos individuales se determinaron experimentalmente. Para este propósito, las soluciones estándar de los compuestos investigados (1 ng/mL) en la composición de la fase móvil se introdujeron utilizando una bomba de infusión que operaba con un suministro de muestra constante. Después de asegurarse de que se seleccionó el ion precursor correcto, se optimizaron el potencial de desagrupamiento (DP), el potencial de entrada (EP), el potencial de salida de la celda de colisión (CXP) y la energía de colisión (CE) para cada transición MRM (Tabla S1). Se monitorearon dos transiciones de MRM, una para cuantificación y otra para confirmación. Los parámetros de MS se establecieron de la siguiente manera: temperatura capilar de 600 C, gas de cortina a 35 psi, gas nebulizador a 60 psi y gas de secado a 50 psi. Se aplicó voltaje de fuente de modo de ionización negativa -4500 V para la determinación de compuestos bioactivos. Se utilizó nitrógeno como gas de cortina y de colisión. El análisis de datos se procesó con el software Analyst 1.5.1. La identificación de los compuestos seleccionados se realizó por masa molecular y fragmento de entradas de aniones de cada compuesto individual y se confirmó por fragmentación MS2. Se determinaron las identidades de nueve compuestos junto con su fórmula química, iones moleculares desprotonados y los iones de fragmento característicos para cada pico individual. Se cuantificaron seis compuestos en función de la curva de calibración generada utilizando las áreas de los picos de las transiciones MRM más intensas de los estándares analíticos. La linealidad de la respuesta del detector para los compuestos cuantificados se demostró mediante la inyección de estándares de calibración en ocho niveles de concentración que van desde 0,01 ug/mL hasta 2 ug/mL. Las curvas de calibración fueron lineales con los coeficientes de correlación (R) superiores a 0,99. En caso de que las muestras no cayeran en el rango lineal del detector CMS, las muestras se diluyeron.

Se compraron estándares analíticos de ácido quínico, ácido gálico, ácido cafeico, ácidos cafeoilquínicos (CQA, dos isómeros: 3- y 5-CQA) y quercetina de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. ). Todos los estándares utilizados fueron de grado analítico (2 Mayor o igual al 99 por ciento de pureza).

Las soluciones madre estándar se prepararon pesando con precisión y disolviendo 20 mg de cada estándar en 10 ml de metanol de grado LC-MS para obtener una concentración de 2 mg/ml. Diluciones en serie de 2.{{10}} ug/ml, 1,5 ug/ml, 1,0 ug/ml, 0,5 ug/ml,0 Luego se prepararon 0,1 ug/mL, 0,05 ug/mL, 0,02 ug/mL y 0,01 ug/mL usando solución de metanol de grado LC-MS. El límite de cuantificación (LOQ) se definió como 0,01 ug/ml.

El ensayo LC-MS/MS se realizó por triplicado. Los datos obtenidos se presentaron como medias ± desviaciones estándar.

3.3. Determinación de propiedades antioxidantes

3.3.1.ABTS· más ensayo de barrido

Primero, la solución de ABTS se preparó mezclando 19,5 mg de ABTS y 3,3 mg de persulfato de potasio con 7 ml de tampón de fosfato (pH=7,4) y se disolvió durante 16 h en la oscuridad. Luego, la solución se diluyó hasta la absorbancia a un nivel de aproximadamente 1.0. Las absorbancias se midieron a la longitud de onda 入=734 nm. A continuación, se mezclaron 20 mL de extractos de KTE, PGE, PRE, CTE y GGE (10,100,250,500 ug/mL) con 980 mL de solución diluida de ABTSe ​​plus y luego se incubaron durante 10 min en oscuridad. En el siguiente paso, se midió la absorbancia de las muestras preparadas a 入=734 nm utilizando un espectrofotómetro UV/VIS Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se usó agua destilada como blanco. El ABTS más el barrido se calculó a partir de la Ecuación (1):

donde: As—absorbancia de la muestra; Ac: absorbancia de la muestra de control. Las mediciones se realizaron por triplicado para cada muestra extraída. El procedimiento fue descrito por Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2.Ensayo de captación de radicales DPPH

La capacidad de los extractos para capturar radicales libres se llevó a cabo utilizando el método descrito por Brand-Williams et al. [84]. Se basa en el uso del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo （DPPH）. Primero, se mezclaron 33 μL de soluciones acuosas de extractos a concentraciones de 100 ug/mL con 167 μL de solución de metanol de DPPH (4 mM) y se transfirieron a una placa de pozo 96-, luego se mezclaron mediante agitación. Posteriormente, se midió la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 517 nm. Las mediciones se realizaron cada 5 min durante 30 min en un espectrofotómetro UV-VIS Filter Max入=5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se realizaron tres réplicas independientes para cada extracto. Se usó agua con una solución de DPPH como control. La capacidad antioxidante se expresó como porcentaje de inhibición de DPPH usando la Ecuación (2):

donde: As—absorbancia de la muestra; Ac: absorbancia de la muestra de control. Las mediciones se realizaron por triplicado para cada muestra extraída.

3.3.3.Detección de niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Para determinar la capacidad de los extractos analizados para generar la producción intracelular de especies reactivas de oxígeno en células HaCaT y BJ, se utilizó un colorante fluorogénico H, DCFDA. Este compuesto tiene la capacidad de ingresar a las células por difusión pasiva, donde es desacetilado por esterasas intracelulares a un compuesto no fluorescente. Si las especies reactivas de oxígeno están presentes en la célula, este compuesto se transforma en DCF altamente fluorescente. Para determinar el nivel intracelular de ROS en HaCaT y BJ, las células se sembraron en 96-placas de pocillos. Luego, las células se cultivaron en una incubadora durante 24 h. El medio DMEM se eliminó y se reemplazó con H2DCFDA 10 μM (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) disuelto en medio DMEM sin suero. Las células HaCaT y BJ se incubaron en H, DCFDA durante 45 min y luego se incubaron con los extractos en concentraciones∶ de 100, 250 y 500 ug/mL. Las células tratadas con peróxido de hidrógeno (H2O2) 1 mM se usaron como controles positivos. Las muestras de control fueron células no tratadas con los extractos probados. La fluorescencia DCF se midió cada 90 min utilizando un lector de microplacas FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) a una excitación máxima de 485 nm y espectros de emisión de 530 nm [85].

3.4. Evaluación de la inhibición de las metalopeptidasas de la matriz

3.4.1.Determinación de la actividad antielastasa

Para determinar la posibilidad de inhibir la metaloproteinasa de matriz, la elastasa de neutrófilos (NE), se aplicó un kit fluorométrico (Abcam, ab118971). La prueba se realizó de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit y con el procedimiento descrito por Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Los análisis se realizaron en una placa de pocillos 96-estándar con un fondo plano transparente. Para el análisis se utilizaron extractos vegetales en concentración de 100 y 250 ug/mL. Inicialmente, se prepararon soluciones de enzima NE, un sustrato NE y un control inhibidor (SPCK) de acuerdo con las instrucciones. Se añadió solución de NE diluida a todos los pocillos y, a continuación, se añadieron las muestras de prueba, el control de inhibidor y el control de enzima (tampón de ensayo) a los pocillos posteriores. Posteriormente, las muestras se mezclaron e incubaron a 37 grados durante 5 min. Mientras tanto, se preparó una mezcla de reacción mezclando el tampón de ensayo y el sustrato NE. La mezcla se añadió a cada pocillo y se mezcló completamente. La fluorescencia se midió inmediatamente a la longitud de onda de excitación 入=400 nm y la emisión 入=505 nm utilizando un lector de microplacas (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) muestras se calculó a partir de la Ecuación (3):

El resultado final fue la media aritmética de tres mediciones independientes.

3.4.2. Determinación de la Actividad Anti-Colagenasa

Para evaluar la capacidad de los extractos obtenidos para inhibir la actividad colagenasa, se aplicó un kit fluorométrico (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab211108). La prueba se realizó de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit y con el procedimiento descrito por Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Los análisis se realizaron en una placa de pocillos 96-estándar con un fondo plano transparente. Para el análisis se utilizaron extractos vegetales en concentración de 100 y 250 ug/mL. Primero, la colagenasa (COL) se disolvió en un tampón de análisis de colagenasa (CAB). Luego, las muestras analizadas se agregaron a COL y CAB. Las muestras de control del inhibidor se prepararon mezclando el inhibidor de colagenasa (1,10-fenantrolina (80 mM) con colagenasa y tampón CAB. Los pocillos de control de enzimas se prepararon mezclando COL diluido con CAB. El tampón CAB se usó como control de fondo. Luego, las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Se preparó una mezcla de reacción mezclando el sustrato de colagenasa con CAB. La mezcla de reacción preparada de esta manera se agregó a todas las muestras analizadas y se mezcló completamente. Posteriormente, se midió la fluorescencia a un longitud de onda de excitación de 490 nm y emisión de 520 nm La medición se realizó en modo cinético durante 60 min a 37 C. La capacidad de inhibir la actividad COL de los extractos obtenidos se calculó mediante la Ecuación (4):

3.5. Determinación de propiedades antiinflamatorias

3.5.1. Inhibición de la desnaturalización de proteínas

La actividad inhibidora de proteinasa de extractos de PRE, PGE, KTE, CTE y GGE se realizó de acuerdo con el método de Sakat et al. [87], que fue modificado por Gunathilake et al. [88]. Brevemente, la solución de reacción (2 ml) constaba de 1 ml de tripsina al 1 por ciento en tampón Tris-HCl 2{{10}} mM (pH 7,4) y 1 ml de muestra de prueba ({{17} }.02 mL extracto 0.980 mL agua). La solución se incubó (37 grados durante 5 min), y luego se añadió 1 ml de caseína al 0,8 por ciento (p/v) y la mezcla se incubó adicionalmente durante 20 min. Al final de la incubación, se añadieron 2 mL de ácido perclórico al 70 por ciento para completar la reacción. La mezcla se centrifugó y la absorbancia del sobrenadante se midió a 210 nm frente al tampón como blanco. La solución tampón de fosfato se usó como control. El porcentaje de inhibición de la desnaturalización de proteínas se calculó utilizando la siguiente fórmula:

donde A1= absorción de la muestra de control y A2= absorción de la muestra de prueba.

3.5.2. Inhibición de la actividad de la lipoxigenasa

La capacidad de los extractos obtenidos para inhibir la actividad de la lipoxigenasa se determinó utilizando el método descrito por Sarvesvaran et al. 【89】. En primer lugar, se mezclaron 10 μL de extractos de plantas en diferentes concentraciones (100, 250 y 500 ug/mL) en una 96-placa de pocillos con 160 μL de PBS 100 mM y 20 μL de solución de lipooxigenasa de soja (167 U/ ml）. Las muestras se incubaron a 25 grados durante 10 min y luego de este tiempo se agregaron 10 μL de ácido linoleico de sodio para iniciar la reacción. Luego, la absorbancia de las muestras se midió a 234 nm durante un período de 3 min cada minuto utilizando un lector de microplacas FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se utilizó diclofenaco como control positivo. El porcentaje de inhibición de la actividad de la lipoxigenasa se calculó a partir de la Ecuación (6):

donde: As es la absorbancia de la muestra analizada, Ac es la absorbancia del control negativo.

El resultado final fue la media aritmética de tres mediciones independientes.

3.6. Análisis de citotoxicidad

3.6.1. Cultivo de células

En este estudio, se utilizaron dos líneas celulares de piel: queratinocitos humanos normales (HaCaT) y fibroblastos (BJ). Los HaCaT se obtuvieron de CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Alemania) y BJ de la American Type Culture Collection ( Manassas, Virginia, EE. UU.). Las células se cultivaron en medio Eagle de modificación de Dulbecco (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, EE. UU.) con piruvato de sodio, L-glutamina y alto contenido de glucosa (4,5 g/l). El medio también se enriqueció con suero fetal bovino al 10 por ciento (Gibco, Waltham, MA, EE. UU.) y al 1 por ciento con antibióticos (100 U/mL de penicilina y 1000 ug/mL de estreptomicina, Gibco) para prevenir la contaminación microbiana. Las células se cultivaron en una incubadora a 37 grados en una atmósfera humidificada de 95 por ciento de aire y 5 por ciento de dióxido de carbono.

3.6.2. Ensayo azul de Alamar

Una vez que las células cultivadas (HaCaT y BJ) alcanzaron la confluencia deseada, se aspiró el medio DMEM en los frascos de cultivo. Las células unidas al fondo se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril. La capa de células se separó con tripsina y luego las células se colocaron en un medio DMEM nuevo. Las células se sembraron en 96-placas de fondo plano (VWR, Radnor, PE, EE. UU.) y después de unirlas al fondo de las placas, las células se trataron con extractos (100, 250 y 500 ug/mL). Las células se incubaron durante 24 h.

La prueba de citotoxicidad se realizó con el ensayo Alamar Blue (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Países Bajos). Después de la incubación, se añadió a los pocillos una solución de resazurina a una concentración de 60 uM, luego las placas se colocaron en una incubadora a 37 grados durante 2 h. Después de este tiempo, se ha medido la fluorescencia (入=570nm). Cada concentración de extracto se realizó en tres repeticiones.

3.6.3. Ensayo de captación de rojo neutro

El ensayo de captación de rojo neutro es la segunda prueba utilizada para determinar la citotoxicidad de PRE, PGE, KTE, CTE y GGE. En primer lugar,96-las placas de fondo plano se prepararon como se describe en la sección anterior. Después de 24 h de exposición de las células a los extractos, se aspiraron y se reemplazaron con colorante rojo neutro (40 ug/mL) y se incubaron durante 2 h. Pasado este tiempo, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. En el siguiente paso, se agregó tampón decolorante (150 μL) a los pocillos. Luego, se determinó la captación de rojo neutro dve midiendo la densidad óptica (DO) a 540 nm. Cada concentración de extracto se realizó en tres repeticiones.

3.7. Determinación del Factor de Protección Solar (In Vitro)

El factor de protección solar (FPS) se determinó midiendo la absorbancia de una solución acuosa de extractos en concentraciones de 10 ug/mL y 50 ug/mL, en el rango de longitud de onda de 290 a 320 nm a intervalos de 5-nm. A partir de los resultados obtenidos, se calculó el SPF a partir de la Ecuación de Mansur [90]: donde∶ EE（λ）—espectro de efecto eritematoso, I（入）—espectro de intensidad solar, ABS（入）—absorbancia del producto de protección solar, CF— factor de corrección（=10）, E（N）×I（λ）—se usaron los valores determinados por Sayre [91].

3.8. Mediciones de pérdida de agua transepidérmica (TEWL) y de hidratación de la piel

Las mediciones de TEWL y de hidratación de la piel se realizaron con una sonda TEWAmeter TM 300 y una sonda Corneometer CM 825 conectada a un adaptador MPA (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Alemania）. Cinco voluntarios participaron en el estudio. En su antebrazo piel, se marcaron seis áreas (2 × 2 cm de tamaño), se aplicó una cantidad de 0,2 mL de los extractos de plantas probados en cinco lugares, el sexto lugar fue el control (no tratado con ninguna muestra). Después de 60 y 360 min , se tomó el nivel de hidratación y las medidas de TEWL, el resultado final fue la media aritmética (de cada voluntario) de cinco medidas independientes (hidratación de la piel) y 20 medidas (TEWL).

3.9.Preparación de cosméticos modelo (desmaquilladores) que contienen extractos

Se preparó un cosmético modelo (desmaquillador). Todos los componentes utilizados cumplían con los requisitos de EcoCert y COSMOS. La formulación se muestra en la Tabla 7.

El producto se elaboró ​​mezclando los ingredientes (del ítem 1 al ítem 6) a temperatura ambiente hasta obtener un líquido homogéneo. En el último paso, se ajustó el pH de la formulación. El desmaquillador se dividió en porciones. Se añadió una cantidad del 1 por ciento de las soluciones madre del extracto a cada porción y se mezcló completamente.

3.10.Determinación de los parámetros de color de extractos y cosméticos (desmaquilladores) que contienen extractos

Se ensayaron muestras de extractos y cosméticos con extractos a temperatura ambiente, 48 h después de su preparación. Se utilizó un CHROMA METER CR-400(Konica Minolta, Sensing Inc., Tokio, Japón) para evaluar los parámetros de color (coordenadas CIELAB). El sistema CIELAB fue definido por la Comisión Internacional de Iluminación en 1978. Se basa en tres atributos de color: L*, a*,b, donde L* es una variable de brillo proporcional al valor en el sistema Munsell, y a* y b* son coordenadas cromáticas. Las coordenadas a* y b* indican posiciones en los ejes rojo/verde y amarillo/azul, respectivamente ( más a=rojo, -a=verde; más b=amarillo, - b =azul).

Con base en los datos obtenidos: L*, a* y b*, se calcularon los siguientes parámetros de color: croma (C*) y matiz (h). Se utilizaron las siguientes ecuaciones:

4. Conclusiones

Sobre la base de los resultados obtenidos, se puede concluir que los extractos de plantas probados muestran varias características positivas, gracias a las cuales pueden usarse en la producción de cosméticos como su ingrediente seguro y bioactivo. Se ha demostrado que estas plantas son una rica fuente de polifenoles, lo que les confiere propiedades antioxidantes. PRE mostró la mejor capacidad para eliminar los radicales libres, lo que probablemente se deba a que contiene la mayor cantidad de polifenoles en comparación con otras plantas. PGE y PRE mostraron la mejor capacidad para reducir la producción de ROS en las células. Además, las plantas no muestran ninguna actividad citotóxica. Todos los extractos probados mostraron un efecto inhibidor sobre las enzimas elastasa y colagenasa, siendo P. granatum y GGE los que tuvieron el mayor efecto inhibidor. Esto puede indicar que estas plantas se pueden utilizar en cosmética como sustancias que retardan los procesos de envejecimiento. Además, los resultados obtenidos indican que estas plantas tienen propiedades antiinflamatorias. En este caso, CTE y KTE parecían ser los mejores. KTE y PGE mostraron un efecto protector contra la radiación UV, incluso en bajas concentraciones. A concentraciones más altas, todas las plantas tenían un efecto protector UV. Además, las plantas tuvieron un efecto positivo en la hidratación de la piel y redujeron la pérdida de agua transepidérmica. Los extractos de PRE, KTE y CTE pueden usarse como colorantes efectivos en productos cosméticos. El líquido modelo para desmaquillar que contiene los extractos mencionados anteriormente se caracterizó por un color intenso y estable en el tiempo. El color de los cosméticos con extractos de PGE y GGE solo puede ser notado por observadores experimentados, y no difieren significativamente de la muestra cosmética en blanco, sin la adición del extracto. Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos, se puede concluir que Papaver rhoeas, Clitoria ternatea y Carthamus tinctorius pueden utilizarse con éxito como fuentes de tintes amarillo, naranja, azul y púrpura en la producción de cosméticos que serán seguros de usar y, además, tendrá un efecto positivo en la piel.

Este artículo está extraído de Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules