El conjugado dendrímero-tesaglitazar induce un cambio fenotípico de la microglía y mejora la fagocitosis de -amiloide† Parte 1

Cambiar la microglía de un estado "proinflamatorio" que exacerba la enfermedad a un fenotipo neuroprotector y "antiinflamatorio" es una estrategia prometedora para abordar múltiples enfermedades neurodegenerativas.

La microglía es un tipo de célula del sistema nervioso central que es la principal responsable de mantener la salud y el funcionamiento de las neuronas. Pueden secretar una variedad de factores de crecimiento y factores neurotróficos y pueden mantener la actividad metabólica normal de las neuronas eliminando los materiales de desecho alrededor de las neuronas. Estudios de los últimos años han demostrado que la microglía está estrechamente relacionada con la memoria. Echémosle un vistazo juntos.

En primer lugar, la microglía puede estimular las neuronas y promover su activación, mejorando así la memoria. Al liberar una serie de neurotransmisores, como el glutamato y la alanina, la microglía puede promover la transmisión de señales entre neuronas y puede mejorar la resonancia de la señal de las neuronas gliales entre las membranas presinápticas, promoviendo aún más la excitabilidad neuronal y la formación de memoria.

En segundo lugar, la microglía también puede eliminar los desechos alrededor de las neuronas, mantener la actividad metabólica normal de las neuronas y reducir la mortalidad neuronal, promoviendo así la mejora de la memoria. Cuando se acumula demasiada basura alrededor de las neuronas, afectará la actividad metabólica normal de las neuronas, lo que provocará la muerte neuronal y un funcionamiento debilitado, reduciendo así el rendimiento de la memoria. La microglía puede mantener el entorno metabólico normal de las neuronas y reducir la mortalidad neuronal al engullir y descomponer los desechos circundantes, mejorando así la memoria.

En resumen, la microglía está estrechamente relacionada con la memoria. Al promover la excitación de las neuronas y eliminar los desechos circundantes, la microglía puede mejorar aún más la memoria y mantener nuestro cerebro sano y activo. Debemos prestar atención a proteger la salud de la microglía para lograr una mejor memoria. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche es un material medicinal tradicional chino con muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de Cistanche proviene de los diversos ingredientes activos que contiene, incluidos ácido tánico, polisacáridos, glucósidos flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de diversas maneras.

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La microglía proinflamatoria contribuye a la progresión de la enfermedad al liberar sustancias neurotóxicas y acelerar la acumulación de proteínas patógenas. Se ha demostrado que tanto PPAR como los agonistas de PPAR cambian la microglía de un fenotipo proinflamatorio ("similar a M1-") a un fenotipo alternativamente activado ("similar a M2-"). Estas estrategias se han explorado en ensayos clínicos para enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer y Parkinson, pero probablemente han fracasado debido a su mala penetración en la barrera hematoencefálica (BHE).

Se ha demostrado que los dendrímeros de poliamidoamina terminados en hidroxilo (sin la unión de ningún ligando dirigido) cruzan la BHE deteriorada en el sitio de la neuroinflamación y se acumulan en la microglía activada.

Por lo tanto, la conjugación de dendrímero de un PPAR/agonista dual puede permitir el cambio fenotípico dirigido de la microglía activada. Aquí presentamos la síntesis y caracterización de un nuevo conjugado dendrímero-PPAR/agonista dual (D-tesaglitazar).

In vitro, D-tesaglitazar induce un cambio de fenotipo 'M1 a M2', disminuye la secreción de especies reactivas de oxígeno, aumenta la expresión de genes para la fagocitosis y la degradación enzimática de proteínas patógenas (por ejemplo, -amiloide, -sinucleína) y aumenta la fagocitosis -amiloide.

Estos resultados respaldan un mayor desarrollo de D-tesaglitazar hacia la traducción para múltiples enfermedades neurodegenerativas, especialmente la enfermedad de Alzheimer y Parkinson.

Introducción

Sólo en los Estados Unidos, actualmente hay más de 5,3 millones de personas con la enfermedad de Alzheimer (EA) y 1 millón de personas con la enfermedad de Parkinson (EP).1 Como el aumento de la edad es el mayor factor de riesgo para muchas enfermedades neurodegenerativas, la prevalencia y el costo del tratamiento de estas enfermedades seguirá aumentando a medida que la población siga envejeciendo.

Además, la falta de éxito reciente en el desarrollo de nuevos fármacos para tratar estas enfermedades ha puesto de relieve la necesidad de desarrollar terapias innovadoras.2,3 Estos fracasos clínicos resaltan las dificultades en el desarrollo de un fármaco, incluida la administración de una concentración suficientemente alta del fármaco al cerebro para que sea eficaz sin causando efectos secundarios adversos.

Las enfermedades neurodegenerativas como la EA y la EP comparten tres componentes neuropatológicos principales: neuroinflamación, acumulación de proteínas patógenas y muerte neuronal.4–7 En las personas enfermas, la célula inmunitaria innata del cerebro (la microglia) fagocita constantemente las proteínas mal plegadas (p. ej., -amiloide, -sinucleína). ) que causan la muerte neuronal a medida que se producen, lo que impide que se formen los agregados característicos.

Sin embargo, en las personas que eventualmente desarrollan enfermedades neurodegenerativas, la microglía ya no elimina estas proteínas de manera efectiva y cambia a un fenotipo proinflamatorio que exacerba la enfermedad (generalmente designado como M1).

Si bien la clasificación predominantemente proinflamatoria/antiinflamatoria (M1/M2) de la activación microglial es una simplificación excesiva del espectro de polarización de los macrófagos, todavía se utiliza como una nomenclatura amplia para describir el fenotipo dominante de la microglía en la neuroinflamación y la respuesta a la terapia.

La microglía tipo M1- libera especies reactivas de oxígeno y otros mediadores inflamatorios que inducen la muerte neuronal y exacerban la patología de la enfermedad al aumentar la producción de proteínas patógenas (por ejemplo, -amiloide, -sinucleína).

Además, los principales factores de riesgo genéticos para desarrollar EA (TREM2 y APOE) se expresan en niveles elevados en la microglía, y se ha demostrado que la vía TREM2/APOE causa un cambio en el fenotipo amicroglial en la EA, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la esclerosis múltiple. modelos animales.8

Estos hallazgos demuestran aún más el papel de la microglía en la patología de múltiples enfermedades neurodegenerativas humanas. Un enfoque para manipular el fenotipo de la microglía permitiría a los investigadores comprender su papel en las enfermedades neurodegenerativas, además de ser potencialmente una terapéutica eficaz.

Se ha propuesto cambiar la microglia de un fenotipo M1 a un fenotipo antiinflamatorio y neuroprotector (M2) como estrategia terapéutica para tratar múltiples enfermedades neurodegenerativas. Se ha demostrado que dos agonistas de PPAR actualmente aprobados por la FDA, rosiglitazona y pioglitazona, medicamentos para la diabetes tipo II, inducen un Cambio de fenotipo M1 a M2 en macrófagos y microglia in vitro e in vivo.

9,10 Se ha demostrado que los agonistas de PPAR reducen la secreción inducida por LPS de especies reactivas de oxígeno al reducir la actividad de NF-κB al inducir la degradación y exportación de NF-κB desde el núcleo, así como la transrepresión dependiente de ligando.11

Además, los estudios epidemiológicos han demostrado que los pacientes con diabetes que toman rosiglitazona o pioglitazona tienen un riesgo reducido de desarrollar EA y EP.12 Posteriormente, se investigaron rosiglitazona y pioglitazona a través de ensayos clínicos de fase III para la EA, pero fracasaron.13

Una posible explicación del fracaso de los ensayos clínicos antes mencionados es el deficiente transporte de estos fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BHE), limitando así el número de fármacos que llegaron al cerebro de los pacientes inscritos en estos ensayos clínicos.14

De hecho, se estima que la BHE impide que alrededor del 98% de todos los fármacos de molécula pequeña lleguen al cerebro, y sólo una fracción del fármaco que ingresa al cerebro llega a la microglía.15

Además, PPAR es otro receptor nuclear de la familia PPAR. Exhibe un papel en la homeostasis de los lípidos y regula la inflamación, y también se ha demostrado que los agonistas de PPAR exhiben efectos antiinflamatorios en la microglía.

Los estudios clínicos que utilizan neuroimagen, análisis de tejido post mortem y biomarcadores del LCR han proporcionado evidencia de que la BBB está alterada en la EA y la EP, así como en otras enfermedades neurodegenerativas.

Se ha demostrado que los dendrímeros de poliamidoamina terminada en hidroxilo (G4-PAMAM-OH) de 17.ª generación evitan intrínsecamente la BHE deteriorada y se acumulan en la microglía activada sin necesidad de ligandos dirigidos, después de la administración sistémica en múltiples modelos diferentes de enfermedades de neuroinflamación. , incluso en roedores, conejos, perros y primates no humanos.18–28 Es significativo que G4-PAMAM-OH se puede administrar sistémicamente y cruzar la BHE en modelos de enfermedad con alteración leve de la BHE, como el síndrome de Rett.29

Además, el grado de absorción de G4-PAMAM-OH en el cerebro es directamente proporcional a la gravedad de la enfermedad en un modelo de parálisis cerebral en conejos.30 Los dendrímeros terminados en hidroxilo tienen la ventaja de administrarse de forma no invasiva en comparación con la administración local altamente invasiva a través de el cráneo requirió en estudios previos con otras nanopartículas como poli-εcaprolactona y PEG, dendrímeros PAMAM cargados negativamente, puntos cuánticos y nanoformulaciones compuestas de polietilenimina (PEI) y sulfato de dextrano.31–35

Además, estos dendrímeros hidroxilo PAMAM están en una posición ideal para la traducción debido a su escalabilidad y su perfil de seguridad in vivo bien tolerado.36–38 Debido a los datos positivos de eficacia preclínica, un (G4-PAMAM-OH)-N- El conjugado de acetilcisteína se está evaluando actualmente en ensayos clínicos iniciales para la adrenoleucodistrofia cerebral infantil (NCT03500627) y la inflamación asociada a la enfermedad grave por coronavirus de 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

Estudiamos un conjugado dendrímero-fármaco de tesaglitazar(Tesa) unido al dendrímero PAMAM terminado en hidroxilo de generación-4. Tesaglitazar es un potente agonista dual de PPAR que combina los efectos beneficiosos de PPAR y de los agonistas de PPAR. Contiene un grupo funcional de ácido carboxílico para la conjugación covalente al dendrímero y su posterior liberación.

Se han desarrollado y probado clínicamente guitarras adicionales, pero se eligió Tesa debido a su mayor relación de actividad PPAR a PPAR, estructura química relativamente simple y perfil de seguridad.39–43

Tesa ya alcanzó la fase III de ensayos clínicos para diabetes tipo 2 en los Estados Unidos de América, pero fracasó debido a la toxicidad dependiente de la dosis, que puede prevenirse disminuyendo la dosis necesaria de administración mediante la administración controlada de dendrímero.39,40,44 Dado que Tesa es un PPAR/agonista dual, su administración dirigida a la microglía activada en el sitio de la neuroinflamación podría ser muy beneficiosa.

En este documento, demostramos la síntesis y caracterización de un conjugado dendrímero-tesaglitazar (D-Tesa) y demostramos la capacidad de este compuesto para inducir un cambio de fenotipo 'M1 a M2' en la microglía y mejorar la fagocitosis del -amiloide marcado con fluorescencia.

Materiales y métodos

Materiales

1-[3-(Dimetilamino)propil]-3-metioduro de etilcarbodiimida (EDC), 4(dimetilamino)piridina (DMAP), CuSO4·5H2O, ascorbato de sodio, ácido hexinoico y albúmina sérica bovina (BSA) se adquirieron en Sigma Aldrich US y se utilizaron tal como se recibieron (St Louis, MO).

Tesaglitazar se obtuvo de AstaTech Inc. (Bristol, PA). El dendrímero PAMAM con núcleo de etilendiamina (generación 4 con 64 grupos terminales hidroxilo) se recibió de Dendritech Inc. (Midland, MI) como una solución en metanol.

El dendrímero se almacenó en metanol a 4 grados y el metanol se evaporó antes de su uso. Se adquirió una membrana de diálisis con un límite de peso molecular (MWCO) de 1 kDa de Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, Nueva Jersey).

Todos los demás disolventes se utilizaron tal como se recibieron en sus formas anhidras. Todas las reacciones, excepto las reacciones de clic de cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre (I) (CuAAC), se llevaron a cabo en condiciones anhidras en un medio orgánico con material de vidrio secado en horno bajo nitrógeno inerte. atmósfera.

Para el cultivo celular: el medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS), penicilina-estreptomicina (P/S), 0.05 % de tripsina-EDTA y el reactivo MTT se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). , EE.UU).

El reactivo de Griess se obtuvo de Promega (Madison, WI) y el TNF-ELISA se obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN). El metanol de calidad analítica se adquirió de Sigma-Aldrich. El azul tripán se obtuvo de Corning (Manassas, VA, EE. UU.).

Procedimientos de síntesis de conjugados D-Tesa.
La monoazida de tetraetilenglicol (2) se sintetizó utilizando un protocolo publicado anteriormente.45

Síntesis y purificación de Tesa-TEG-azida (3).
Se disolvió Tesa (950 mg, 2,32 mmol) en 10 ml de dimetilformamida (DMF). A esta solución agitada se añadió gota a gota monoazida de tetrametilenglicol (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) en DMF (1 ml). Después se añadieron DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) y EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) a la mezcla de reacción y la reacción se agitó bajo purga de nitrógeno a temperatura ambiente durante 24 horas.

La reacción se controló mediante cromatografía en capa fina y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La mezcla de reacción se diluyó con 100 ml de diclorometano (DCM) y la mezcla de reacción bruta se transfirió a un embudo de decantación y la capa orgánica se lavó posteriormente tres veces con una solución saturada de bicarbonato de sodio, seguido de una solución saturada de cloruro de amonio y finalmente con salmuera.

Luego se secó la capa orgánica con sulfato de sodio anhidro. Luego se eliminó el disolvente de la capa orgánica usando un evaporador rotatorio y la solución se redisolvió en 3 ml de DCM y se absorbió en gel de sílice para purificarla con un sistema de cromatografía CombiFlash® usando un método de gradiente con acetato de etilo/hexano como disolventes para producir 3as transparentes. -aceite amarillo.

El producto puro deseado se eluye con aproximadamente 3{71}}–40 % de acetato de etilo. (Rendimiento: 70%). RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,27 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7,15(d, J=1.9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8.6 Hz,2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}}.8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7.8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8.7 , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6. 7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H), 1,08 (t, J=7 ,0 Hz, 3H).ESI-MS: C28H39N3O10S teórico: 609,24, obtenido (M+ 1):610,13.

Síntesis y purificación de D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) a una solución agitada de G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) en 20 ml de DMF anhidra. A esta mezcla se le añadieron DMAP (430 mg, 3,52 mmol) y EDC (1 g, 5,28 mmol).

La mezcla de reacción se agitó bajo purga de nitrógeno durante 24 horas a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se transfirió a un tubo de diálisis de 1000 MWCO. Se realizó diálisis con DMF durante 24 horas y el DMF se cambió aproximadamente cada seis horas.

Luego se realizó diálisis con agua desionizada (DI) durante 24 horas, cambiando el agua aproximadamente cada seis horas. Por último, el contenido del tubo de diálisis resultante se liofilizó durante 48 horas, produciendo un polvo blanco y esponjoso. (Rendimiento: 61%). RMN 1H (500 MHz, DMSO) δ 8,10–7,67 (m, dendrímero amida interna H), 4,72 (s, superficie del dendrímero OH), 4,01 (t,éster –CH2), 3,32 (m, dendrímero –CH2), 3,06 (m, dendrímero y conector –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrímero –CH2), 2,56–1,89(m, dendrímero y enlazador –CH2), 1,78–1,61 (m, enlazador –CH2). Síntesis y purificación de D-Tesa (6).

Se añadió Tesa-TEG-azida (3.177,8 mg, 0.3{{10}}3 mmol) a una mezcla agitada de D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) en 5 ml de una mezcla 1:1 de tetrahidrofurano (THF) y agua con 0,5 ml de DMF en un vial de 20 ml apto para reactor de microondas. Para la reacción de clic de CuAAC, se añadieron a la mezcla de reacción sulfato de cobre pentahidrato (11,6 mg, 0,0467 mmol) y (+)-lascorbato de sodio (9,3 mg, 0,0467 mmol).

Se selló el vial y luego se colocó el recipiente de reacción en un reactor de microondas Biotage® Initiator y se hizo reaccionar bajo radiación de microondas de 20 W con agitación durante 8 horas a 50 grados. La mezcla de reacción se transfirió a un tubo de diálisis de MWCO de 1000 y se realizó diálisis con DMF durante 24 horas, reemplazándose el DMF por disolvente nuevo aproximadamente cada 4 horas.

Luego, el contenido del tubo de diálisis se transfirió a un tubo Falcon y se añadió una cantidad equivalente de agua desionizada. Además, se agregaron 200 µl de solución de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético al contenido del tubo Falcon.

Luego se colocó esta mezcla en un nuevo tubo de diálisis de 1000 MWCO y se realizó la diálisis durante 12 horas en 1000 ml de agua DI con solución de EDTA añadida, seguido de la diálisis con agua durante 12 horas.

Luego la mezcla se liofilizó durante 48 horas y dio como resultado un polvo blanco esponjoso. (Rendimiento: 64 %.) RMN 1H (500 MHz, DMSO) δ 8,2–7,6 (m, dendrímero internalamida H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, enlazadorH), 3,96 (dd, Tesa y enlazador H), 3,70 (m, Tesa y enlazador H) ,3,58–3,14 (m, dendrímero –CH2), 3,14–2,86 (m, dendrímero–CH2), 2,87–2,49 (m, dendrímero y conector –CH2), 2,25 (m, dendrímero –CH2) , 1,82–1,67 (m, enlazador –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Técnicas de caracterización

Resonancia magnética nuclear (RMN). Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker de 500 MHz a temperatura ambiente. Los desplazamientos químicos de protones (δ) se informan en ppm.

Se utilizó 1H NMR para determinar el número de moléculas de Tesa unidas a cada molécula de D-Tesa mediante el método de integración de protones, comparando los picos de los protones de amida internos del dendrímero en δ 7,6–8,2 ppm con los protones aromáticos de Tesa en δ 7,36–6,76 ppm y los protones metílicos de Tesa en la región alifática. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Se utilizó HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) equipado con una bomba binaria 1525, un desgasificador en línea AF, un muestreador automático 717 plus, un detector de matriz de fotodiodos 2998 y un detector de fluorescencia múltiple 2475 interconectado con el software Waters Empower.

Se utilizó una columna de fase inversa Symmetry C18 (Tosoh, Japón) que tenía un tamaño de partícula de 5 µm, 25 cm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno. Los compuestos se controlaron a 210 nm y 254 nm utilizando detectores PDA.

El disolvente A era agua de calidad HPLC con 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) y el disolvente B era acetonitrilo (ACN) con 5% de agua y 0.1% de TFA. El método utilizado comenzó en 1{ {7}}0 : 0 (ACN: agua), disminuyó a 10: 90 (agua: ACN) en 5 minutos, permaneció en esa polaridad durante 15 minutos y volvió a 100 : 0 (ACN: agua) en 5 minutos. El caudal se mantuvo a 1 ml min-1. Espectroscopia de masas.

ESI-MS se realizó en un espectrómetro de masas BrukermicroTOF-II usando acetonitrilo/agua (9:1) como sistema disolvente. Los iones moleculares como picos protonados [M + nH]n+ o aductos [M + nX]n+ (X=Na, K o NH4) se utilizaron para confirmar la fórmula empírica.

Dispersión dinámica de la luz y potencial ζ. Se utilizó un Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, Reino Unido) equipado con un láser He-Ne de 50 mW (633 nm) para determinar el tamaño de las partículas y la distribución del potencial ζ. D-Tesa se disolvió en agua DI hasta una concentración de 0.2 mg ml-1 para DLS y en cloruro de sodio 10 mM hasta una concentración de 0,1 mg ml-1 para potencial ζ.

Las mediciones se realizaron a 25 grados, utilizando un ángulo de dispersión de 173 grados como se describió anteriormente.27,46 Estudio de liberación del fármaco. D-Tesa se disolvió a una concentración de 1 mg ml-1 en solución tampón fosfato (pH 7,4) para imitar las condiciones plasmáticas o en solución de citrato de sodio (pH 5,5) para imitar las condiciones lisosomales.

Se añadieron esterasas de hígado porcino (de Sigma Aldrich) a la solución de citrato de sodio al inicio del estudio de liberación y se repusieron aproximadamente cada 3 días durante el estudio.

Cada vial contenía 15 ml de muestra y se agitaron continuamente a 37 grados durante la duración del experimento. En diferentes momentos, se recogieron muestras duplicadas de 200 µl de cada pH y posteriormente se extinguió la actividad esterasa añadiendo 200 µl de metanol. Las muestras de puntos de tiempo de hora cero sirvieron como control.

Las muestras se almacenaron a -80 grados para evitar aún más cualquier hidrólisis. Las muestras se analizaron adicionalmente mediante HPLC y se calculó el área bajo la curva (a 210 nm) para el pico del fármaco libre. El área bajo la curva se correlacionó con la cantidad de fármaco liberado utilizando una curva de calibración en la que se procesaron concentraciones conocidas de Tesa libre en la HPLC a 210 nm.

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