Potencial despigmentante de extractos de líquenes evaluado por pruebas in vitro e in vivo Parte 2

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común que se conoce como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorioy promoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de la cistancheglucósidos. La melanina en la piel humana es producida por la oxidación de tirosina catalizada portirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo tantoinhibiendo la producción de melanina.

Además, la cistanche también tiene la función de promover la producción de colágeno, lo que puede aumentar la elasticidad y el brillo de la piel y ayudar a reparar las células dañadas de la piel. CistancheGlucósidos de feniletanoltienen un efecto de regulación negativa significativo sobre la actividad de la tirosinasa, y se ha demostrado que el efecto sobre la tirosinasa es una inhibición competitiva y reversible, lo que puede proporcionar una base científica para desarrollar y utilizar los ingredientes blanqueadores en Cistanche. Por lo tanto, la cistanche tiene un papel clave enblanqueamiento de la piel. Puede inhibir la producción de melanina para reducir la decoloración y la opacidad; y promover la producción de colágeno para mejorar la elasticidad y el brillo de la piel. Debido al reconocimiento generalizado de estos efectos de la cistanche, muchas pielesblanqueoLos productos han comenzado a infundir ingredientes a base de hierbas como Cistanche para satisfacer la demanda de los consumidores, aumentando así el valor comercial de Cistanche en productos para blanquear la piel. En resumen, el papel de la cistanche en el blanqueamiento de la piel es crucial. Su efecto antioxidante y su efecto productor de colágeno pueden reducir la decoloración y la falta de brillo, mejorar la elasticidad y el brillo de la piel y, por lo tanto, lograr un efecto blanqueador. Además, la amplia aplicación de Cistanche en productos para blanquear la piel demuestra que no se puede subestimar su papel en el valor comercial.

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Detección de inhibición de tirosinasa por bioautografía TLC

El perfil TLC permitió mostrar las principales sustancias contenidas en cada extracto. La identificación de estas sustancias no es objetivo de este trabajo, pero, como ejemplo, es evidente la mancha de ácido vulpínico (amarilla bajo luz visible) en el extracto metanólico de L. vulpina (Huneck & Yoshimura, 1996) (Fig. 2). Los datos de bioautografía revelaron que varios compuestos ejercen efectos inhibidores sobre la actividad de la tirosinasa. En particular, la actividad inhibitoria del extracto de cloroformo-metanol de C. islandica se distribuyó entre diferentes bandas que cubrían una amplia gama de polaridad (Fig. 2A). Por el contrario, la actividad inhibidora de tirosinasa del extracto de metanol de L. vulpina se concentra en una banda que migra cerca de la gran banda amarilla correspondiente al ácido vulpínico (Fig. 2B).

Efectos despigmentantes del extracto de liquen en las células MeWO

La línea celular de melanoma humano MeWo se utilizó como modelo in vitro para explorar los efectos despigmentantes del liquen. Como primer paso, las células se sometieron a un ensayo de viabilidad celular tras la exposición durante 48 h a concentraciones crecientes de extractos de cloroformo-metanol de L. vulpina metanol y C. islandica. Las curvas de dosis-respuesta de la viabilidad celular permitieron derivar valores IC50 de 88 µg/ml (IC del 95 % [68–113 µg/ml]) para L. vulpina y de 264 µg/ml (IC del 95 % [213–328 µg/ml] ) para C. islandica. Los valores umbral de IC05 fueron 19 µg/ml (IC del 95 % [9–40 µg/ml]) y 51 µg/ml (IC del 95 % [31–85 µg/ml]), respectivamente.

Posteriormente, el ensayo de melanina realizado en células MeWo, después de 72 h de exposición a diferentes concentraciones de extracto de liquen, mostró una fuerte reducción con respecto a los controles inducidos por ambos extractos. En estos experimentos, se usó arbutina (8 mM) como control positivo, reduciendo el contenido de melanina de las células a aproximadamente el 50 por ciento de los controles. El extracto de metanol de L. vulpina indujo una reducción de melanina similar a la de la arbutina, que ya se producía a una concentración tan baja como 10 µg/ml (Fig. 3). Esta concentración es inferior al umbral de efectos citotóxicos medido para este extracto, lo que permite descartar la posibilidad de efectos nocivos específicos sobre las células. También se observó un efecto similar sobre el contenido de melanina de las células para el extracto de cloroformo-metanol de C. islandica, pero solo a una concentración de 50 µg/ml (Fig. 3). Sin embargo, también la concentración efectiva de este extracto fue inferior al umbral para los efectos citotóxicos.

Evaluación basada en fenotipos de los efectos despigmentantes de extractos de líquenes usando pez cebra

Se utilizaron modelos de pez cebra para corroborar in vivo los efectos de la inhibición de la melanogénesis por parte de C. islandica y L. vulpina. Para definir la concentración óptima a utilizar, los primeros embriones se sometieron a un ensayo de toxicidad tras la exposición durante 48 h a concentraciones crecientes de L. vulpina metanol y extractos de cloroformo-metanol de C. islandica.

Posteriormente, observamos que, cuando se trataron con dosis subtóxicas de C. islandica y L. vulpina, las larvas de pez cebra tuvieron una reducción en la pigmentación (Figs. 4 y 5). El extracto de L. vulpina mostró una mayor actividad inhibidora que C. islandica, como lo indican los datos del análisis de imágenes. Las curvas de regresión logística arrojaron valores de CI50 de 44 µg/ml (42–47 µg/ml) para el extracto de cloroformo-metanol de C. islandica y de 30 µg/ml (25–36 µg/ml) para el extracto de metanol de L. vulpina (Fig. 6). Finalmente, la actividad despigmentante de los extractos de C. islandica y L. vulpina también se evaluó en los embriones de pez cebra mediante el ensayo de melanina (Información complementaria).

DISCUSIÓN

Nuestro estudio destacó un complejo de efectos despigmentantes in vitro e in vivo debido a líquenes específicos y solventes de extracción. La estrategia de elegir extracciones separadas con una variedad de polaridades de solventes, en lugar de una extracción sucesiva con solventes de polaridades crecientes, fue dictada por el aspecto pionero de la investigación. El estudio tenía como objetivo revelar especies de líquenes ampliamente disponibles que pudieran ser explotadas por sus efectos despigmentantes, con un conocimiento muy limitado sobre la posible presencia de principios activos y sus interacciones. Por lo tanto, adoptamos un método de fraccionamiento del extracto que puede involucrar cierta superposición de composición entre las fracciones pero maximiza su rendimiento despigmentante, posiblemente también debido a los efectos sinérgicos.

En cuanto a la inhibición de la tirosinasa en experimentos sin células, nuestros resultados confirman los datos de Higuchi et al. (1993), mostrando tasas de inhibición de tirosinasa de 40,4 por ciento para L. vulpina y 13,8 por ciento para C. islandica, respecto a nuestro 86,2 por ciento y 42,6 por ciento, respectivamente, posiblemente debido al uso de líquenes cultivados y diferentes extracción solvente. Mostramos la mayor actividad para el extracto de metanol de L. vulpina, seguido por los extractos de cloroformo-metanol de C. islandica. Por lo tanto, estos extractos se utilizaron para explorar la actividad antimelanogénica de las células de melanoma y las larvas de pez cebra. Los datos obtenidos de estas pruebas confirmaron los de los experimentos sin células y, en todos los casos, el extracto de metanol de L. vulpina indujo el efecto más fuerte.

Además, el ensayo de bioautografía indica que diferentes sustancias contenidas en estos líquenes ejercen una inhibición de la tirosinasa. Aunque no realizamos una caracterización completa de los extractos, conocemos por la literatura las principales sustancias liquénicas que caracterizan a estos líquenes: L. vulpina contiene aranorina y ácido vulpínico, mientras que C. islandica contiene ácido lichesterínico, protolichesterínico y fumarprotocetrárico (Culberson, 1969) . Sin embargo, la información sobre las actividades antitirosinasa de las sustancias liquénicas en la literatura es relativamente pobre, mientras que solo en unos pocos casos fue posible aclarar los mecanismos de inhibición. Recientemente, Brandão et al. (2017) aisló ácido fumarprotocetrárico del liquen Cladonia verticilado y mostró una inhibición no competitiva de tipo mixto sobre la actividad de la tirosinasa que aumentó con el aumento de la concentración, a 0,6 mM el ácido inhibía la actividad de la tirosinasa en un 39,8 por ciento.

Un elemento que dificulta la comparación entre diferentes especies de líquenes es la alta variabilidad de la composición química, que también está sujeta a la variación de los parámetros ambientales, el hábitat y las características microclimáticas (p. ej., disponibilidad de agua y luz) (Matteucci et al. , 2017). Estas diferencias pueden ser la base de diferencias considerables en la actividad biológica de los fitocomplejos de líquenes en los que la composición no se ha caracterizado cuantitativamente. Por lo tanto, es necesario seguir trabajando para aislar y cuantificar los compuestos activos de los extractos para definir mejor los componentes con actividad antitirosinasa. Hasta el momento, varios trabajos han investigado la posible actividad antitirosinasa de compuestos de liquen (p. ej., Kwong et al., 2020; Honda et al., 2016; Lopes, Coelho & Honda, 2018). Por ejemplo, Kim & Cho (2007) determinaron que los extractos metanólicos de Usnea longissima y Usnea esculent afectaban la formación de melanina independientemente de su acción antioxidante. En cuanto a su estructura fenólica, es probable que los diferentes constituyentes sean potentes inhibidores de la tirosinasa, con una IC50 mucho más baja que la del extracto completo.

En conclusión, nuestro estudio proporciona evidencia de los efectos despigmentantes de extractos de líquenes específicos, que van desde la inhibición de la tirosinasa en experimentos libres de células hasta efectos despigmentantes in vitro en células cultivadas e in vivo en larvas de pez cebra. Estos datos indican que los extractos de líquenes de L. vulpina y C. islandica son candidatos potenciales para desarrollar productos farmacéuticos y cosméticos para blanquear la piel. Además, los datos también sugieren que L. vulpina podría ser una buena fuente para el aislamiento de compuestos con fuertes propiedades despigmentantes. Los objetivos futuros en esta dirección serán la caracterización química de los extractos de líquenes y la evaluación de la actividad de sus constituyentes más prometedores.

INFORMACIÓN ADICIONAL Y DECLARACIONES

Fondos

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Génova (FRA2018). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Divulgaciones de subvenciones

Los autores divulgaron la siguiente información sobre la subvención: Universidad de Génova: FRA2018.

Conflicto de intereses

Paolo Giordani es editor académico de PeerJ.

Contribuciones de autor

Ética Animal

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Disponibilidad de datos

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Las mediciones sin procesar de la inhibición de la tirosinasa están disponibles en un archivo complementario.

Información suplementaria

La información complementaria para este artículo se puede encontrar en línea.

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