Cistanchetambién tiene la función depromover la producción de colágeno, que puede aumentar la elasticidad y el brillo de la piel y ayudarreparar las células dañadas de la piel. CistancheGlucósidos de feniletanoltienen un efecto de regulación negativa significativo sobre la actividad de la tirosinasa, y se ha demostrado que el efecto sobre la tirosinasa es una inhibición competitiva y reversible, lo que puede proporcionar una base científica para desarrollar y utilizar los ingredientes blanqueadores en Cistanche. Por lo tanto, la cistanche tiene un papel clave en la piel.blanqueo. Puedeinhibir la producción de melaninapara reducir la decoloración y la falta de brillo; y promover la producción de colágeno para mejorar la elasticidad y el brillo de la piel. Debido al reconocimiento generalizado de estos efectos de la cistanche, muchos productos para blanquear la piel han comenzado a infundir ingredientes herbales como la cistanche para satisfacer la demanda de los consumidores, aumentando así el valor comercial de la cistanche en los productos para blanquear la piel. En resumen, el papel de la cistanche en el blanqueamiento de la piel es crucial. Esantioxidanteefecto yefecto productor de colágenopuede reducir la decoloración y la falta de brillo, mejorar la elasticidad y el brillo de la piel y, por lo tanto, lograr un efecto blanqueador. Además, la amplia aplicación de Cistanche en productos para blanquear la piel demuestra que no se puede subestimar su papel en el valor comercial.

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La tirosinasa es la enzima limitante de la tasa de producción de melanina y, en consecuencia, es el objetivo más destacado para inhibir la hiperpigmentación. Se han identificado numerosos inhibidores de la tirosinasa, pero la mayoría de ellos carecen de eficacia clínica porque se identificaron utilizando la tirosinasa de hongo como diana. Por lo tanto, usamos tirosinasa humana recombinante para seleccionar una biblioteca de 50,000 compuestos y comparamos los éxitos de detección activos con ingredientes blanqueadores bien conocidos. La hidroquinona y su derivado, la arbutina, solo inhibieron débilmente la tirosinasa humana con una concentración inhibitoria media máxima (IC50) en el rango milimolar, y el ácido kójico mostró una eficacia débil (IC50 > 500 mmol/L). Los inhibidores más potentes de la tirosinasa humana identificados en este examen fueron derivados de resorcinol-tiazol, especialmente el recientemente identificado Thiamidol (Beiersdorf AG, Hamburgo, Alemania) (isobutil amido tiazolil resorcinol), que tenía una IC50 de 1,1 mmol/L. Por el contrario, el tiamidol solo inhibió débilmente la tirosinasa de hongo (IC50 =108 mmol/L). En cultivos de melanocitos, el tiamidol inhibió de manera fuerte pero reversible la producción de melanina (IC50 =0.9 mmol/L), mientras que la hidroquinona inhibió irreversiblemente la melanogénesis (IC 50 = 16.3 mmol/L). Clínicamente, el tiamidol redujo visiblemente la apariencia de las manchas de la edad en 4 semanas, y después de 12 semanas, algunas manchas de la edad eran indistinguibles de la piel adyacente normal. El potencial completo del tiamidol para reducir la hiperpigmentación de la piel humana debe explorarse en estudios futuros.

INTRODUCCIÓN

El melasma, los lentigos actínicos y seniles y la hiperpigmentación posinflamatoria son problemas estéticos importantes por los que muchos pacientes buscan atención médica. Generalmente, estos trastornos afectan con mayor frecuencia y severidad a las poblaciones de tez más oscura (Stratigos y Katsambas, 2004). Muchos productos tópicos están disponibles para tratar los trastornos hiperpigmentados y contienen diversos ingredientes activos para reducir la producción y/o distribución de melanina. Aunque la hiperpigmentación de la piel puede reducirse mediante varios mecanismos (Briganti et al., 2003), la tirosinasa, la enzima limitante de la producción de melanina, es el objetivo obvio de los inhibidores de la hiperpigmentación (Kanteev et al., 2015; Lee et al., 2014; Ramsden y Riley, 2014). Muchas sustancias han sido descritas en la literatura como inhibidores de la tirosinasa, pero la mayoría carecen de eficacia clínica y solo unos pocos compuestos se utilizan actualmente en productos dermatológicos tópicos (Chang, 2009; Kim y Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002). ). Entre ellos, el ácido kójico, la hidroquinona y la arbutina son los más comunes (Solano et al., 2006).

La eficiencia clínica insatisfactoria de los inhibidores de tirosinasa que se usan actualmente es grande porque esos compuestos se probaron usando solo tirosinasa aislada del hongo Agaricus bisporus (mTyr) (Espin et al., 2000; García-Molina et al., 2005), que es el único tirosinasa activa fácilmente disponible comercialmente. Las actividades catalíticas y las especificidades de sustrato de mTyr son significativamente diferentes de las de la enzima de mamíferos (Hearing et al., 1980). Recientemente se resolvieron las estructuras tridimensionales de varias tirosinasas, entre ellas las estructuras de mTyr (Ismaya et al., 2011) y de dos enzimas bacterianas de Streptomyces castaneoglobisporus (Matoba et al., 2006) y Bacillus megaterium (Sendovski et al. , 2011). Por el contrario, se dispone de muy poca información cinética o estructural para la tirosinasa humana (hTyr), principalmente debido a las dificultades sustanciales para obtener cantidades suficientes de hTyr de fuentes naturales o por expresión heteróloga. hTyr se ha expresado transitoriamente en varias líneas de células animales (Olivares et al., 2002; Schweikardt et al., 2007; Tripathi et al., 1992; Wendt, 2006), pero los rendimientos siempre fueron demasiado bajos para una caracterización detallada de los resultados. preparaciones hTyr. Más recientemente, varios grupos han desarrollado sistemas de expresión más eficientes para hTyr (Cordes et al., 2013; Fogal et al., 2015; Lai et al., 2016), pero los datos sobre la estructura tridimensional de hTyr o los datos cinéticos de Aún faltaban inhibidores de hTyr.

RESULTADOS

Inhibición de hTyr

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1200 mmol/L (Figura 2a).

Un análisis cinético detallado de la inhibición de hTyr por Tiamidol produjo un tipo de inhibición estrictamente competitiva con una constante de inhibición (Ki) de 0.25 mmol/L (Figura 2b, Tabla 1). Este valor está de acuerdo con el valor IC50 estimado a partir de las curvas dosis-respuesta (1,1 mmol/L) (cf. Figura 2a) que, para la inhibición competitiva, debería ser unas 3 veces superior a la Ki. Los valores de Ki para 4-butilresorcinol (9 mmol/L), 4-hexilresorcinol (39 mmol/L) y 4-feniletilresorcinol (24 mmol/L) también fueron marcadamente más altos que los Valor Ki de Tiamidol (Tabla 1). Estos datos ilustran que el resto tiazolil amida de Tiamidol transmite una inhibición mucho mejor de hTyr que las cadenas laterales de hidrocarburo presentes en otros tres derivados de resorcinol (4-butil-, 4-hexil- y {{ 21}}fenil etil resorcinol). Como se señaló, la eficacia es claramente diferente en mTyr, donde el 4-butilresorcinol, el 4-hexilresorcinol y el 4-feniletilresorcinol, e incluso el ácido kójico, son superiores al tiamidol en la inhibición de la enzima (Tabla 1). Por lo tanto, el tiamidol no se habría identificado como positivo en una prueba de detección utilizando mTyr, y la eficacia del 4-feniletilresorcinol se habría sobrestimado enormemente.

García-Jiménez et al. (2016) informaron recientemente que mTyr oxida lentamente ciertos resorcinoles, siempre que la metforma predominante de la enzima se convierta previamente en la forma oxi o desoxi mediante aditivos como H2O2 y ascorbato y que la reacción sea sostenida por o-difenoles. . Por lo tanto, utilizamos un análisis cuantitativo de cromatografía líquida de alto rendimiento (Ito y Wakamatsu, 2015) para determinar si el tiamidol también podría ser un sustrato de hTyr. En nuestras condiciones de ensayo normales (es decir, en ausencia de los aditivos mencionados por Garcia-Jimenez et al., 2016), no se produjo oxidación detectable de tiamidol dentro de varias horas de incubación con hTyr, mientras que el rododendro se oxidó fácilmente dentro de ese período de tiempo. (ver la figura complementaria S1 en línea). Por lo tanto, asumimos que la reacción descrita por García-Jiménez et al. no es relevante para Tiamidol y hTyr en condiciones fisiológicas.

Inhibición de la producción de melanina

Luego probamos los posibles efectos inhibitorios de estos compuestos utilizando un modelo tridimensional para la piel humana. Como se observó con hTyr purificada, la arbutina mostró una eficacia insignificante en la inhibición de la producción de melanina en modelos de piel MelanoDerm (MatTek Corporation, Ashland, MA) (IC50 > 4,000 mmol/L) (Figura 2c) . El ácido kójico inhibió la producción de melanina con una IC50 de w400 mmol/L, mostrando una curva dosis-respuesta sorprendentemente empinada, con concentraciones por debajo de 200 mmol/L que solo inhibían levemente la producción de melanina (es decir, en un 5 por ciento a 150 mmol/L). El rododendro mostró solo efectos marginales sobre la melanogénesis, con una IC50 aparente para la inhibición de w1200 mmol/L. La hidroquinona inhibió la producción de melanina en modelos de piel MelanoDerm con una IC50 de 15 mmol/L, lo que sugiere que tiene un mecanismo diferente a la inhibición de la tirosinasa. 4-El butilresorcinol inhibió la síntesis de melanina con una IC50 de 13,5 mmol/L. Una vez más, el tiamidol fue, con diferencia, el inhibidor más potente de la producción de melanina en los modelos de piel MelanoDerm, con una IC50 de 0,9 mmol/L, y en cultivos monocapa, el tiamidol redujo visiblemente la formación de melanina (Figura 3a).

A continuación, se probaron la hidroquinona y el tiamidol en cultivos de monocapa de melanocitos a largo plazo para comprobar la posible reversibilidad de la inhibición. Aunque 1 mmol/L de tiamidol redujo la producción de melanina a menos del 60 por ciento después de 2 semanas, 1 mmol/L de hidroquinona redujo la producción de melanina solo a aproximadamente el 85 por ciento (Figura 3b). Sin embargo, tras seguir cultivando sin los compuestos activos, los melanocitos que habían sido inhibidos por el tiamidol reiniciaron rápidamente su producción de melanina, alcanzando los niveles previos al tratamiento en 1 semana. Por el contrario, las células tratadas con hidroquinona no recuperaron su capacidad total de producción de melanina dentro del período de cultivo de 2-semanas, y la producción de melanina continuó al 85 % de los niveles previos al tratamiento.

Modelado molecular

Los posibles modos de unión de tiamidol a hTyr se examinaron mediante estudios de acoplamiento virtual. La figura 4a muestra el sitio activo del modelo de homología de hTyr en la forma met, con un ligando de tiamidol acoplado en una conformación de energía más baja. El centro de di-cobre con el puente de oxígeno es visible a la izquierda. Solo se muestran los residuos de aminoácidos inmediatamente adyacentes al inhibidor unido. (La numeración de residuos incluye el péptido señal). La superficie interna del bolsillo de unión está coloreada de acuerdo con la hidrofobicidad en una escala que va del azul para hidrofílico al marrón para hidrofóbico. Aunque el entorno del centro de di-cobre es claramente hidrofílico, las cadenas laterales de I368, V377 y F347 forman una subbolsa fuertemente hidrofóbica. En la orientación espacial que se muestra, el 1-grupo hidroxi del anillo aromático del ligando establece amplios contactos con el centro de di-cobre, y el 3-grupo hidroxi participa en enlaces de hidrógeno con la cadena lateral de S380 y el carbonilo principal de M374. El anillo de tiazolilo se mantiene en su lugar mediante interacciones hidrofóbicas con el bolsillo no polar (Figura 4b), formado por cadenas laterales de aminoácidos, la mayoría de los cuales difieren entre mTyr y hTyr (Figura 4c).

Se obtuvieron resultados comparables cuando el tiamidol se acopló a la estructura de rayos X recientemente publicada de la TRP1 estructuralmente similar, una enzima melanogénica que contiene Zn2+ de función aún desconocida en humanos (Ghanem y Fabrice, 2011; Lai et al., 2017), lo que sugiere que la enzima TYRP1 también es inhibida por el tiamidol (consulte la Figura complementaria S2 en línea).

Estudios clínicos

Luego se examinó la eficacia in vivo de Thiamidol en estudios clínicos en los que sujetos de edad avanzada trataron las manchas de la edad en la piel dos veces al día con una fórmula que contenía {{0}}.2 por ciento de Thiamidol o con el vehículo solo como control. Ya después de 4 semanas de tratamiento, las manchas de la edad tratadas eran significativamente más claras que las manchas de la edad de control no tratadas (Figura 5a). La mejora continuó durante todo el período de tratamiento y, después de 12 semanas, algunas de las manchas de la edad eran indistinguibles de la piel circundante normalmente pigmentada (Figura 5b). Las fotografías EpiFlash (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) mostraron una mejora visible en la apariencia de las manchas de la edad, y las manchas de la edad de control no tratadas permanecieron sin cambios (no se muestra). Un estudio de seguimiento mostró que las concentraciones de tiamidol tan bajas como 0.1 por ciento redujeron efectivamente la visibilidad de las manchas de la edad (consulte la Figura complementaria S3 en línea).

DISCUSIÓN

La forma más segura y eficaz de tratar la hiperpigmentación cutánea es reducir la producción de melanina mediante la inhibición de la actividad de la tirosinasa. Sin embargo, la mayoría de los inhibidores de tirosinasa descritos en la literatura carecen de eficacia clínica cuando se incorporan a productos tópicos. Casi todos se probaron solo contra mTyr (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005) y, por lo tanto, aunque efectivos contra mTyr, resultaron ser malos inhibidores de hTyr. La mTyr comercialmente disponible no es una preparación homogénea, sino una mezcla de varias isoenzimas de tirosinasa y pequeñas cantidades de actividades enzimáticas adicionales que pueden afectar los estudios de inhibición de manera impredecible (Pretzler et al., 2017). Las isoenzimas AbPPO3 y AbPPO4, los componentes principales de la mTyr comercialmente disponible, tienen secuencias de aminoácidos en la región del sitio activo que difieren significativamente de la hTyr (Figura 4c). Ambas isoenzimas mTyr contienen bucles adicionales entre Asn371 (uno de los sitios de glicosilación de hTyr) y Gly372. Varios de los residuos que interactúan con tiamidol en hTyr (cf. Figura 4b) no se conservan en mTyr, por ejemplo, Ile368, Ser375 y Ser380. Phe207 se conserva estructuralmente en mTyr, mientras que Phe347 no lo está. Debido a que incluso pequeños cambios en las interacciones enzima-ligando pueden tener efectos dramáticos en las afinidades de unión, los diversos perfiles de inhibición de hTyr y mTyr (resumidos en la Tabla 1) no fueron una sorpresa.

El objetivo principal de este estudio fue comparar los efectos de arbutina, hidroquinona y ácido kójico con varios derivados de resorcinol sobre la función catalítica de hTyr y sobre la producción de melanina in vivo. A excepción del Tiamidol, todas las sustancias ensayadas se han descrito como inhibidores de la tirosinasa (Kim et al., 2012); sin embargo, sus actividades inhibitorias reportadas son extremadamente divergentes. En la literatura médica, la hidroquinona se considera el criterio estándar para el tratamiento de la hiperpigmentación de la piel, aunque existen serias preocupaciones con respecto a su seguridad. La hidroquinona está prohibida en la Unión Europea para su uso en cosméticos, pero todavía se vende en los Estados Unidos como medicamento de venta libre en formulaciones que contienen hasta un 2 por ciento de hidroquinona. Recientemente, la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (2006) expresó su preocupación por la hidroquinona; sin embargo, aún está pendiente un fallo final. Los valores IC50 publicados para la inhibición de mTyr por hidroquinona cubren un rango de 1,1 mmol/L (Kang et al., 2003) a 680 mmol/L (Abu Ubeid et al., 2009). En nuestro análisis, la hidroquinona fue notablemente ineficaz contra hTyr, ya que la inhibió solo levemente, alcanzando solo el 50 por ciento de inhibición a aproximadamente 4,000 mmol/L. Aunque la hidroquinona se ha considerado un inhibidor de la tirosinasa desde principios de la década de 1990 (Palumbo et al., 1991), nuestros resultados sugieren que sus propiedades citotóxicas son más importantes, no solo por sus efectos adversos sobre los melanocitos sino también por su eficacia como inhibidor de la melanogénesis. (Jimbow et al., 1974; Penney et al., 1984; Smith et al., 1988). Esta opinión está respaldada no solo por nuestros resultados con hTyr y el hecho de que la hidroquinona redujo significativamente la producción de melanina en modelos de piel, sino también por nuestros experimentos con cultivos de melanocitos. Aquí, la hidroquinona redujo la producción de melanina, pero las células tratadas no recuperaron la capacidad total para producir melanina después de la eliminación del activo.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmol/L) para la arbutina con hTyr purificado y el modelo de piel MelanoDerm. Se han publicado datos sobre la eficacia tanto de la a-arbutina como de la b-arbutina (Garcia-Jimenez et al., 2017). Sin embargo, ambos compuestos son profármacos de hidroquinona, y su actividad biológica depende de la liberación de hidroquinona de la molécula (Briganti et al., 2003). El Comité Científico de Productos de Consumo de la Unión Europea (2008) publicó una opinión crítica sobre la arbutina. Dada la liberación de hidroquinona de la molécula, se considera que el uso de arbutina en productos cosméticos no es seguro.

Los valores de IC50 publicados para la inhibición de la tirosinasa por el ácido kójico oscilan entre 6 mmol/L (Curto et al., 1999) y más de 100 mmol/L (Jeon et al., 2005). Como inhibidor de hTyr, el ácido kójico es mucho menos eficaz, con una IC50 de aproximadamente 500 mmol/L. El ácido kójico exhibe un tipo mixto de inhibición, con un Ki de 145 mmol/L, lo que indica que se une a la forma desoxi de la tirosinasa (Sun et al., 2014). Cuando se usa para tratar el modelo MelanoDerm, el ácido kójico muestra una curva de respuesta a la dosis excepcionalmente pronunciada, con una inhibición relativa que aumenta del 5 % a 150 mmol/L a más del 75 % de inhibición a 900 mmol/L (consulte la Figura 2c). Este hecho puede ser la razón principal de la eficacia muy limitada del ácido kójico in vivo. Con respecto a la seguridad del ácido kójico, el Comité Científico Europeo sobre Seguridad del Consumidor (2012) ahora considera que el ácido kójico en concentraciones de hasta el 1,0 por ciento es seguro para los productos cosméticos cuando se aplica a la piel sana, una opinión compartida por el Panel de expertos en revisión de ingredientes cosméticos ( Burnett et al., 2010).

El rododendro recibió el estatus de cuasi-fármaco en Japón en 2008 y se usó como ingrediente blanqueador en productos cosméticos. Se suponía que era un inhibidor competitivo de la tirosinasa. Sin embargo, en 2013, los productos que contenían rododendro se retiraron del mercado en 10 países asiáticos cuando cerca de 20,000 consumidores desarrollaron leucodermia después de usar los productos. Se demostró que el rododendro no solo es un inhibidor sino también un sustrato tanto de hTyr (Ito et al., 2014a) como de mTyr (Ito et al., 2014b). La acumulación dependiente de tirosinasa del estrés del retículo endoplásmico y/o la activación de la vía apoptótica pueden contribuir a la citotoxicidad de los melanocitos del rododendro (Sasaki et al., 2014).

El motivo de resorcinol 4-sustituido se conoce desde hace algún tiempo como un resto químico eficaz que inhibe la tirosinasa (Khatib et al., 2005). Muchos compuestos naturales que han sido identificados como agentes blanqueadores, principalmente flavonoides, contienen este motivo (Shimizu et al., 2000, 2011). Debido a que la biodisponibilidad de los flavonoides es generalmente baja, nuestro objetivo fue identificar derivados de resorcinol con mejor efectividad y biodisponibilidad. 4-El butilresorcinol ya se había identificado como un inhibidor de la tirosinasa humana y de ratón (Kim et al., 2005; Kolbe et al., 2013) y de la actividad oxidasa del ácido dihidroxiindol carboxílico de la TYRP1 de ratón (Katagiri et al. , 2001), y está disponible comercialmente para el tratamiento médico y cosmético de la hiperpigmentación (Bohnsack et al., 2012; Jimenez and Garcia-Carmona, 1997; Kim et al., 2005). Sin embargo, todavía faltaban datos cinéticos detallados del 4-butilresorcinol. En el ensayo de hTyr, encontramos un tipo de inhibición estrictamente competitivo por 4-butil resorcinol con un Ki de 9,1 mmol/L, que está en excelente concordancia con el valor IC50 determinado (Tabla 1).

En nuestros experimentos in vitro, el tiamidol, con un IC50 de 1,1 mmol/L en el ensayo de la enzima hTyr y de 0,9 mmol/L en el modelo de piel MelanoDerm, fue con diferencia la más eficaz de todas las sustancias probadas. Otros experimentos confirmaron que el tiamidol es un inhibidor estrictamente competitivo (Figura 2b) y no un sustrato para la tirosinasa (consulte la Figura complementaria S1) y, por lo tanto, el tiamidol no se convierte en una quinona tóxica y potencialmente inductora de leucodermia. Por lo tanto, Thiamidol fue seleccionado para estudios clínicos para evaluar su eficacia in vivo. Un estudio de Thiamidol usando un aplicador puntual mostró una mejora continua en la apariencia de las manchas de la edad durante todo el período de tratamiento de 12-semanas, alcanzando significación estadística a las 4 semanas. Estos resultados muestran una fuerte eficacia reductora de la pigmentación del producto de prueba Thiamidol y un claro beneficio clínico en el tratamiento de la hiperpigmentación de la piel.

MATERIALES Y MÉTODOS

tirosinasa humana

Una forma truncada de hTyr marcada con His (hTyr-DHis) que comprende el dominio catalítico de hTyr se expresó en células HEK 293 y se purificó mediante cromatografía de afinidad con metales en Ni2+-Sepharose (GE Healthcare, Munich, Alemania) como se describe en otro lugar ( Cordes et al., 2013). La preparación resultante tenía las mismas propiedades catalíticas que la hTyr de tipo salvaje.

Fuentes de inhibidores

De la biblioteca de compuestos de Evotec (Evotec, Hamburgo, Alemania), se seleccionaron 50,000 compuestos, que cubren un amplio espacio químico, para realizar un HTS para los inhibidores de hTyr, evaluados mediante el ensayo Tyr descrito en la siguiente sección. Luego se sintetizaron derivados de compuestos líderes prometedores para una mayor optimización. Los otros inhibidores se compraron de varios proveedores (consulte los Materiales complementarios en línea para obtener más detalles).

Ensayo de tirosina y procedimiento HTS

Los detalles completos de la actividad de la L-dopa oxidasa y los procedimientos de detección de HTS utilizados se pueden encontrar en los Materiales complementarios.

Modelado molecular

El acoplamiento in silico se basó en un nuevo modelo de homología de hTyr, descrito en otra parte (Mann et al., 2017). Las simulaciones se realizaron utilizando Molegro Virtual Docker (Molegro, Aarhus, Dinamarca). Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA) se utilizó para el análisis y la presentación de datos visuales. Las secuencias se tomaron de la base de datos UniProt (UniProt Consortium, 2017).

Ensayos de modelo de piel

Los detalles completos de los tejidos MelanoDerm utilizados como modelo de piel y la cantidad n de su contenido de melanina se pueden encontrar en los Materiales complementarios.

Cultivos de melanocitos

Los detalles completos de los cultivos de melanocitos y la cuantificación de su contenido de melanina se pueden encontrar en los Materiales complementarios.

Estudios clínicos

Se realizaron dos estudios aleatorizados in vivo (ciego para los productos de prueba, abiertos para el control no tratado). Un estudio inscribió a 18 sujetos femeninos (56-71 años de edad), y 17 sujetos completaron el estudio. El segundo estudio se realizó con 19 sujetos (18 mujeres, 1 hombre; 58e7{{10}} años de edad), y los 19 sujetos completaron el estudio. Cada sujeto aplicó dos formulaciones diferentes dos veces al día a las manchas de la edad en sus antebrazos volar usando un aplicador de manchas. Las formulaciones diferían solo en el ingrediente activo: 0,2 por ciento de tiamidol versus vehículo en el primer estudio y 0,1 por ciento de tiamidol versus vehículo en el segundo estudio. Se trató una mancha de la edad por sujeto con una fórmula que contenía el ingrediente activo y una mancha de control se trató solo con el vehículo. La pigmentación de las manchas de la edad se analizó como se describe en los Materiales complementarios. Los estudios in vivo se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la versión actual de la Declaración de Helsinki y las directrices de la Conferencia Internacional sobre Armonización de Buenas Prácticas Clínicas. Todos los participantes en estos estudios dieron su consentimiento informado por escrito. Además, los estudios fueron aprobados y aprobados por la junta de revisión institucional de Beiersdorf AG (Hamburgo, Alemania).

CONFLICTO DE INTERESES

MATERIAL SUPLEMENTARIO

El material complementario está vinculado a la versión en línea del documento.

REFERENCIAS

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