Determinación de echinacósido en extracto acuoso de Cistanche Herba mediante HPLC

Abstracto:

Objetivo Se estableció un método de HPLC para ladeterminación de equinacósidoen elextracto acuoso de Cistancheherba.

Métodos El equinacósido se determinó mediante HPLC. La separación se realizó en la columna Inertsil ODS-SP C18 con una fase móvil compuesta por acetonitrilo (A) y 0.solución de ácido fosfórico al 4% (B), mediante elución en gradiente. La longitud de onda de detección se estableció en 333 nm y la temperatura de la columna fue de 30 grados. El caudal fue de 1,0 ml·min-1 y el volumen de inyección fue de 10 μl. Resultados La relación lineal del equinacósido dentro del rango de concentración de 44.939 7-539.276 4 ug·mL- 1 fue buena (r=0.999 8). Las recuperaciones fueron del 94,59%-105.31% (RSD= 2.93%,n=9). El contenido de equinacósido en extractos acuosos de Cistanche herba fue de 15.527,7.347,12.267 mg·g-1. Conclusión El método HPLC establecido con buena repetibilidad es preciso, simple y factible. Es adecuado para la determinación de echinacósido en el extracto acuoso de Cistanche herba.

Palabras clave:HPLC;extracto acuoso de Cistanche herba; echinacósido; determinación del contenido

Cistanche deserticola es un tónico de la medicina tradicional china comúnmente utilizado en la práctica clínica y se conoce como "ginseng del desierto" [1]. La Cistanche deserticola registrada en la edición de 2015 de la Farmacopea China es el tallo carnoso seco con hojas escamosas de Cistanche deserticola YC Ma o Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Es cálido, dulce y salado y regresa a los meridianos del riñón y del intestino grueso. Tiene los efectos de nutrir el yang del riñón, reponer la esencia y la sangre, e hidratar los intestinos y ser laxantes [2]. "La Materia Médica de Shen Nong", dice que puede "tonificar el medio, nutrir los cinco órganos internos, fortalecer el yin y nutrir la esencia". Cistanche deserticola contiene principalmente glucósidos feniletanoides, iridoides y sus glucósidos, lignanos y sus glucósidos, polisacáridos, compuestos éster y alcaloides [3]. Los glucósidos de feniletanol son los principales ingredientes activos de Cistanche deserticola. Entre ellos, el echinacósido y el verbascósido figuran en Cistanche deserticola en la Farmacopea China.

Componentes indicativos para la identificación y determinación de contenido. Los estudios farmacológicos [4] muestran que Cistanche deserticola tiene diversos efectos farmacológicos como laxante, protector del hígado, antiosteoporosis, antioxidante, antienvejecimiento y antifatiga. El extracto acuoso de Cistanche deserticola puede promover la expresión del gen de la proteína morfogenética ósea 2 en osteoblastos de rata, la fosfatasa ácida resistente a tartrato, la osteocalcina en el suero de ratones ovariectomizados y los genes Smad1, mad5, factor de crecimiento transformante, etc. en la médula ósea. , tiene efectos anti-osteoporosis [5-6].

La equinácea puede promover la proliferación de osteoblastos y promover la diferenciación de células madre mesenquimales de médula ósea cultivadas in vitro en osteoblastos [7-9]. En los últimos años, ha habido muchos informes de investigación sobre la determinación del contenido de echinacósido y verbascósido en el extracto etanólico de Cistanche deserticola y sus preparaciones compuestas [10-12], pero hay pocos informes sobre la determinación del contenido de los componentes índice en Cistanche deserticola. extracto acuoso. En este estudio, se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para determinar el contenido de equinácea en el extracto acuoso de Cistanche deserticola.

1 material

1.1 Instrumentos

LC-20AT cromatografía líquida de alto rendimiento, SPD-20A detector, SIL-20A muestreador automático, CTO-10Horno de columna ASvp, estación de trabajo de cromatografía líquida en solución LC, Shimadzu Corporation of Japón; Balanza analítica electrónica MES125P-OCE-DU, Sartorius Company, Alemania; Bomba de vacío multiusos de agua circulante SHZ-D (Ⅲ), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Sistema de circulación de enfriamiento del evaporador rotativo RC2B SO25, evaporador rotativo RV 10 D S96, IKA Company, Alemania; DK-S26

Baño de agua eléctrico a temperatura constante, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Máquina de agua ultrapura serie UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Materiales y reactivos medicinales

El material medicinal Cistanche deserticola se compró en Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., número de lote: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, el principal farmacéutico tradicional chino del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Guangzhou, lo identificó. como el tallo carnoso seco con hojas escamosas de Cistanche deserticola YCMa. La muestra se almacena en la Sala de Pruebas de Medicamentos del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Guangzhou; Sustancia de referencia de glucósido de equinácea, contenido del 89,7 %, Instituto de Control de Alimentos y Medicamentos de China, número de lote: 111670-

201706; el acetonitrilo es cromatográficamente puro (Merck, Alemania); el metanol y el ácido fosfórico son analíticamente puros (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); El agua es agua ultrapura.

2 Métodos y resultados

2.1 Preparación de extracto acuoso de Cistanche deserticola

Tome el polvo grueso del material medicinal Cistanche deserticola, agregue 10 veces la cantidad de agua destilada, caliente y refluya para la extracción dos veces, 1 hora cada vez, filtre, combine el filtrado y concentre el filtrado con un evaporador rotatorio. hasta un contenido de fármaco bruto de 0,100 g·mL-1 y guárdelo a 4 grados para su uso posterior.

2.2 Condiciones cromatográficas e idoneidad del sistema.

Columna cromatográfica: columna Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); fase móvil: acetonitrilo (A)-0.Solución de ácido fosfórico al 4% (B), elución en gradiente: 0 ~ 5 min, 17%

A; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17 % A; longitud de onda de detección: 333 nm; temperatura de la columna: 30 grados; caudal: 1,0 ml·min-1;

Volumen de inyección: 10 μL. En estas condiciones cromatográficas, la separación entre los picos de equinacósido y de los componentes adyacentes es superior a 1,5, y el número de placas teóricas basadas en el pico de equinacósido no debe ser inferior a 4,000. El cromatograma se muestra en la Figura 1.

2.3 Preparación de la solución

2.3.1 Solución de sustancia de referencia Pese una cantidad adecuada de sustancia de referencia de equinacósido, pésela con precisión, colóquela en un matraz volumétrico de 10 ml, agregue metanol para disolverla y prepare una solución de sustancia de referencia que contenga 898,794 ug de equinácea por ml, 4 grados. Guardar para uso posterior.

2.3.2 Solución de prueba

Medir con precisión 2,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evaporar a sequedad al baño maría, agregar metanol para disolver, diluir a volumen en un matraz aforado de 10 mL, agitar bien y filtrar con Se obtiene una membrana microporosa de 0,22 μm.

2.4 Investigación de relaciones lineales

Mida con precisión {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2,50, 3.00 ml de la solución de referencia según el punto 2.3.1, colóquelo en un matraz volumétrico de 5 ml, agregue metanol para completar el volumen y agite bien para obtener un gradiente de concentración de 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 solución de referencia, filtrada a través de una membrana microporosa de 0,22 μm. Mida de acuerdo con las condiciones cromatográficas del punto 2.2 y registre el área del pico. Realice una regresión lineal con la concentración másica de la sustancia de referencia como abscisa (X, ug·mL-1) y el área del pico como ordenada (Y), y se obtiene la ecuación de regresión: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Los resultados muestran que la equinácea tiene una buena relación lineal dentro del rango de concentración de 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Prueba de precisión

Tome 539,276 4 ug·mL- 1 solución de referencia, inyéctela y mida 6 veces continuamente de acuerdo con las condiciones cromatográficas indicadas en 2.2, y registre el área del pico. Los resultados mostraron que la RSD del área del pico de echinacósido fue del 1,81 %, lo que indica una buena precisión del instrumento.

2.6 Prueba de estabilidad

Medir con precisión 2,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evaporar a sequedad al baño maría, agregar metanol para disolver, diluir a un matraz aforado de 10 mL, agitar bien, filtrar con un {{ 7}}.Membrana microporosa de 22 μm, seguir las condiciones cromatográficas del punto 2.2 y colocar en 0 y 2 respectivamente. , Medición de inyección a las 4, 8, 12, 24 h, registre el área del pico. Los resultados mostraron que la RSD del área del pico de echinacósido fue del 1,16 %, lo que indica que la solución de prueba tenía buena estabilidad dentro de las 24 horas.

2.7 Prueba de repetibilidad

Mida con precisión 2,0 ml de extracto acuoso de Cistanche deserticola y prepare 6 soluciones de prueba en paralelo según el método descrito en 2.3.2. Inyectar muestras para medir de acuerdo con las condiciones cromatográficas indicadas en 2.2 y registrar el área del pico. Los resultados mostraron que la RSD de laechinacósidoLa concentración en masa fue del 1,28%, lo que indica una buena repetibilidad del método.

2.8 Prueba de recuperación de muestras

Mida con precisión 9 porciones de 1,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, agregue 0.8, 1,0 y 1,2 mL de solución de referencia (1,552 mg·mL{{11). }}) respectivamente, evaporar a sequedad en baño maría, agregar metanol para disolver y ajustar a un matraz aforado de 10 mL; Agite bien y filtre a través de una membrana microporosa de 0,22 μm para preparar soluciones de prueba de concentración alta, media y baja. Preparar 3 copias de cada concentración en paralelo. Medir según las condiciones cromatográficas del punto 2.2. Registre el área del pico y calcule la recuperación de la muestra. Tasa. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

2.9 Determinación del contenido de la muestra.

Medir con precisión 3 porciones de 2,0 mL de extracto acuoso de Cistanche deserticola, evaporar a sequedad al baño maría, agregar metanol para disolver, diluir a un matraz aforado de 10 mL, agitar bien, filtrar con una membrana microporosa de 0,22 μm y medir según las condiciones cromatográficas indicadas en 2.2. Registre el área del pico y calcule el contenido de equinácea. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 1 Resultados de las pruebas de recuperación de equinacósido

Tabla 2 Resultados de la determinación del contenido de equinacósido en extracto acuoso de Cistanche herba