Desarrollo De Aceite Enriquecido Con Polifenoles Extraídos De Aguas Residuales De Almazara Parte 1

Abstracto:La extracción de aceite de oliva produce importantes aguas residuales de almazara (OMW). La composición de OMW varía según el tipo de aceituna, el grado de madurez del fruto y el método de extracción (sistema tradicional de un prensado o sistemas continuos basados ​​en la centrifugación de la pulpa de la aceituna). En los países productores de aceitunas, el OMW es importante para el medio ambiente y la economía y también es una fuente de bajo costo de compuestos polifenólicos con altas propiedades antioxidantes. Las propiedades del aceite de oliva, como sus efectos antiaterogénico, antiinflamatorio, antienvejecimiento y modulador inmunológico, se han atribuido a sus polifenoles. En este estudio, se utilizó el método de extracción del punto de nube (CPE) para recuperar compuestos polifenólicos de OMW. La fase micelar total de las tres recuperaciones fue del 24,2 por ciento y los polifenoles totales (después de la sonicación) fueron 504 mg GAE/Kg. Además, la adición de polifenoles recuperados de OMW mejoró el aceite de oliva y prolongó su vida útil sin cambiar sus propiedades organolépticas. Hubo un cambio del 42,2 % en los polifenoles después de un enriquecimiento del 0,5 % de las dispersiones micelares. Por lo tanto, se sugiere que el método CPE podría conducir a una mejor gestión de residuos en la industria del aceite de oliva y mejorar la calidad nutricional de los productos alimenticios.

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Palabras clave: antioxidantes; extracción de puntos de nube; industria de alimentos; enriquecimiento; aguas residuales de almazara; aceite de oliva; polifenoles; recuperación

1. Introducción

La demanda de aceite de oliva está aumentando continuamente en todo el mundo. En el área mediterránea, que es la mayor zona productora de aceitunas del mundo, se genera una gran cantidad de aguas residuales agroindustriales a partir de la industria de procesamiento de aceitunas [1,2]. Los residuos de aguas residuales de almazara (OMW) se componen de residuos sólidos, que consisten en pulpa de aceituna, así como residuos líquidos, que consisten en vegetales y agua adicional generada durante la decantación. OMW tiene un color marrón oscuro (que puede volverse negro) y un aroma distintivo y potente que recuerda a las aceitunas [3]. Los subproductos de la almazara tienen importancia ambiental y económica en los países productores de aceitunas. OMW crea altos niveles de contaminantes debido a su alta carga orgánica y un alto contenido de sustancias polifenólicas fitotóxicas y antibacterianas, que resisten la degradación biológica [4]. El tratamiento y disposición de OMW se está convirtiendo en un serio problema ambiental. Por lo tanto, los países productores de aceite de oliva se han enfrentado a un serio desafío para encontrar una solución ecológica y económicamente viable para el manejo y eliminación de OMW.

Una tecnología innovadora y respetuosa con el medio ambiente para la extracción de sustancias bioactivas, en particular de los alimentos, es la extracción del punto de nube (CPE). Es una técnica en la que los componentes químicos o biológicos se extraen utilizando tensioactivos no iónicos que, cuando se calientan a (o por encima de) una temperatura crítica, tienden a separarse de la solución a granel y crean nubes [5]. Los tensioactivos se emplean específicamente como extractantes durante el proceso CPE. En las circunstancias adecuadas, la extracción tiene lugar a una temperatura por debajo del punto de enturbiamiento, cuando el tensioactivo se vuelve turbio (es decir, menos soluble que la muestra inicial o incluso insoluble), lo que lleva a la separación de dos fases: la fase acuosa y el tensioactivo. -fase rica. Debido a los procesos de enturbiamiento, la técnica conduce a una preconcentración de analitos (como los polifenoles) en la fase rica en tensioactivos [6]. Además, se ha demostrado que los compuestos solubilizados por la micela estaban protegidos de la oxidación [7].

Los compuestos polifenólicos, azúcares y ácidos orgánicos constituyen la mayoría de OMW. OMW también tiene recursos ricos como el potasio y otros nutrientes minerales, que pueden utilizarse nuevamente como fertilizante [8]. Sin embargo, OMW podría ser una fuente natural de antioxidantes debido a su alto contenido de compuestos polifenólicos. Los polifenoles del aceite de oliva tienen propiedades nutricionales potencialmente beneficiosas por sus actividades antioxidantes y biológicas, como antialérgicas, antiinflamatorias, anticancerígenas y antihipertensivas [9,10]. El bajo potencial redox de los polifenoles, que les permite actuar como agentes reductores donando hidrógeno o electrones y eliminando radicales libres, es la base de su actividad antioxidante [7].

Los productores de aceite tienen como objetivo producir productos alimenticios que mantengan su valor nutricional y vida útil durante un período de tiempo prolongado. Estos factores hacen que la suplementación con antioxidantes sea una técnica común para reducir la oxidación de lípidos en la producción de alimentos [11]. Para prevenir la oxidación en alimentos que contienen grasas y aceites, se han empleado como aditivos alimentarios antioxidantes sintéticos, incluidos el hidroxitolueno butilado (BHT), la hidroquinona terc-butílica (TBHQ) y el hidroxianisol butilado (BHA). Sin embargo, se reveló que estos antioxidantes químicos se han relacionado con una variedad de riesgos para la salud, incluidos el cáncer y la carcinogénesis [12].

Investigaciones recientes han demostrado que los antioxidantes naturales pueden prevenir la oxidación del aceite comestible [11–13]. El enriquecimiento del aceite de oliva con sustancias polifenólicas puede aumentar la vida útil del aceite de oliva sin afectar sus características organolépticas. Sin embargo, el equilibrio antioxidante/prooxidante depende de muchos factores, particularmente la dosis (p. ej., la concentración) y el tiempo (p. ej., la duración del almacenamiento), y es un proceso muy delicado que puede cambiarse fácilmente [14]. En consecuencia, la recuperación de compuestos polifenólicos no solo brinda una oportunidad económica, sino que también reduce la carga ambiental de las aguas residuales.

Los objetivos de este estudio fueron, en primer lugar, recuperar las sustancias polifenólicas de OMW con la aplicación del método CPE y, en segundo lugar, enriquecer el aceite de oliva con las sustancias polifenólicas recuperadas. La estabilidad de los polifenoles es un parámetro importante en este enriquecimiento. Se estudiaron emulsionantes, como la lecitina, para este fin.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

En esta investigación se empleó una muestra de aguas residuales de almazara (Olea europaea var. Koroneiki) de la región de Preveza (Epiro, Grecia). La muestra OMW fue recolectada específicamente por la industria del aceite de oliva, congelada y entregada a nuestro laboratorio el mismo día. Se utilizó aceite de oliva procedente de un mercado local de Karditsa (Tesalia, Grecia) como matriz para la muestra de control, compuesta por aceites de oliva vírgenes y refinados.

2.2. reactivos

The 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH• ) and α-tocopherol were purchased from Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany). Sodium chloride, citric acid, lecithin of soya (>97 por ciento), éter dietílico e isooctano se obtuvieron de Carlo Erba (Milán, Italia). El carbonato de sodio anhidro y el hidróxido de sodio eran de Penta (Praga, República Checa). El etanol absoluto, el metanol, el reactivo de Folin-Ciocalteu y el monohidrato de ácido gálico fueron de Panreac (Barcelona, ​​España). El ciclohexano y el n-hexano eran de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). El agua desionizada utilizada en los experimentos se produjo utilizando una columna desionizadora.

2.3. Extracción de polifenoles de OMW

Se utilizó un método llamado extracción del punto de nube (CPE). El método CPE se basa en la idea de que cuando la concentración de un tensioactivo en una solución supera la de la dispersión micelar crítica, puede generar dispersiones micelares [6]. La Figura 1 muestra los pasos experimentales del método CPE. Primero, la muestra tuvo que ser descongelada antes de poder separar los sólidos utilizando una centrífuga (Digien 20-R, Orto Alresa, Madrid, España) durante 10 min a 4500 rpm. Después de recoger el sobrenadante, se añadió ácido cítrico (50 por ciento) para llevar el nivel de pH a 3,5. Toda la muestra se dividió en tres porciones, a cada una de las cuales se le añadió lecitina como tensioactivo en concentraciones del 1 %, 3 % y 5 %, respectivamente, junto con un 30 % de sal. Para la agitación se utilizó un agitador magnético intenso. Después de 20 min, la solución se centrifugó durante 5 min a 4500 rpm. La fase micelar superior (surfactante) (SP) y la fase acuosa inferior (agua) (WP) se examinaron por separado. En este punto se produjo la primera recuperación de las dispersiones polifenólicas. Con la fase acuosa que contenía los analitos no extraídos, se realizó el método CPE dos veces más en las mismas condiciones (2ª y 3ª recuperación). Foods 2023, 12, x PARA REVISIÓN POR PARES 3 de 13 El etanol absoluto, el metanol, el reactivo de Folin-Ciocalteu y el monohidrato de ácido gálico fueron de Panreac (Barcelona, ​​España). El ciclohexano y el n‐hexano eran de Sigma‐Aldrich (Steinheim, Alemania). El agua desionizada utilizada en los experimentos se produjo utilizando una columna desionizadora

2.4. Determinación del rendimiento del método CPE

2.4.1. Contenido total de polifenoles

Según Chatzilazarou et al. [15], se utilizó el método de Folin-Ciocalteu para determinar fotométricamente el contenido de polifenoles totales (TPC). Brevemente, se agregaron 0.5 g de dispersiones micelares y 0.5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu a un matraz volumétrico de 25-mL. Después de 3 min, se añadió 1 ml de Na2CO3 (35 por ciento, p/p). Se utilizó agua desionizada para llenar los matraces hasta el nivel de volumen necesario, y luego se mantuvieron en la oscuridad durante 60 min. Se usó un espectrofotómetro Shimadzu UV-1700 UV/Vis (Kyoto, Japón) para medir la absorción a 750 nm. Se usaron soluciones estándar (1–10 mg/L) para crear una curva de ácido gálico estándar. El TPC se expresó como mg equivalentes de ácido gálico (GAE) por Kg de dispersiones micelares.

El método DPPH de Katsoyannos et al. [16], con algunas modificaciones, se utilizó para evaluar la actividad de captación de radicales de los polifenoles extraídos en la fase de tensioactivo, así como los que aún estaban presentes en la muestra después del tratamiento con CPE (fase acuosa). En resumen, se añadió 1 mL, 0.1 mM de solución metanólica de DPPH a 4 mL de la solución de muestra (500, 1000 y 2000 mg/L). La mezcla se agitó completamente antes de dejarla reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min mientras se medía la absorbancia a 517 nm. La fórmula utilizada para determinar el porcentaje de inhibición fue: porcentaje de inhibición=100 × (Acontrol − Amuestra)/Acontrol, donde Acontrol y Amuestra son las absorbancias. A partir de las actividades de eliminación (porcentaje) frente a las concentraciones de la curva de muestra correspondiente, se determinó la IC50.

2.5. Enriquecimiento del Aceite de Oliva con Dispersiones Micelares

Usando una sonda ultrasónica (Misonix Sonicator S3000, Qsonica, LLC, Newtown, CT, EE. ciclos), se investigó la reducción del tamaño micelar. Se utilizó el método CPE para recuperar las dispersiones micelares, que luego se añadieron al aceite de oliva para mejorarlo. Para el enriquecimiento se emplearon concentraciones de 0,5, 1 y 5 por ciento.

2.6. Análisis de calidad del aceite de oliva enriquecido

De acuerdo con el Reglamento de la Comisión (EEC) No. 2568/91 [17], se desarrolló el método para determinar los ácidos grasos libres (FFA) en el aceite de oliva.

2.6.2. Índice de refracción 

Se utilizó un refractómetro (refractómetro Quartz/Digital Abbe, Medline Scientific Limited, Oxon, Reino Unido) para medir el índice de refracción de la muestra. El instrumento se calibró con agua destilada, que tenía un índice de refracción de 1,3333 a 20 ◦C.

2.6.3. Colorimetría

Se utilizó el colorímetro para determinar el color de las muestras de aceite de oliva (Lovibond CAM-System 500, The Tintometer Ltd., Amesbury, UK). Para determinar el color CIELAB, se colocó una muestra (25 mL) en un vaso de precipitados de 50 mL y se colocó en el colorímetro. Se definió un índice psicométrico de luminosidad, L*, y coordenadas de crominancia, a* y b*. Además, la fórmula para calcular el croma, o C*, era la siguiente: C*=[(a*)2 más (b*)2 ] 1/2 .

2.6.4. Investigación Espectrofotométrica en el Ultravioleta

Utilizando un espectrofotómetro, el método de investigación espectrofotométrica ultravioleta se llevó a cabo siguiendo el Reglamento de Ejecución n.º 299/2013 de la Comisión [18].

2.6.5. Método Rancimat

Según Lalas et al. [19], se utilizó el método Rancimat para probar la estabilidad a la oxidación de las muestras de aceite de oliva. Más específicamente, los recipientes de reacción del Rancimat 743 (Metrhom LTD, Herisau, Suiza) se llenaron con alrededor de 3 g de cada aceite de oliva. Los parámetros elegidos fueron una temperatura de 90 ◦C y un caudal de aire de 15 L/h. El punto en el que la tasa de oxidación cambia rápidamente y produce un fuerte punto de inflexión en la curva de oxidación se conoce como tiempo de inducción y está representado por el valor del índice de estabilidad del aceite de oliva. Este fue el período de inducción (PI), que se proporcionó en horas. Además, esta fórmula se utilizó para calcular el factor de protección (PF): PF=(IP con antioxidante)/(IP sin antioxidante). La inhibición de la oxidación de lípidos está indicada por un factor de protección mayor que uno, y la actividad antioxidante mejora por un valor de PF más alto.

2.6.6. Calorimetría diferencial de barrido

La calorimetría diferencial de barrido (DSC) mide las temperaturas y los flujos de calor asociados con las transiciones en los materiales en función del tiempo y la temperatura. Estas medidas incluyen datos tanto cuantitativos como cualitativos sobre cambios físicos y químicos que involucran procesos endotérmicos o exotérmicos, así como alteraciones en la capacidad calorífica. DSC se utilizó en esta investigación para evaluar la estabilidad oxidativa del aceite [20]. Se utilizó una bandeja especial de aluminio para pesar 5 mg ± 0,5 mg de aceite. También se agregó una bandeja en blanco (referencia). El flujo de oxígeno fue de 20 ml/min y las condiciones oxidativas se programaron en Diamond DSC (PerkinElmer Inc., Shelton, CT, EE. UU.). La muestra y la referencia se colocaron en el DSC y el termograma se inició a 40 ◦C durante 1 min, seguido de 300 ◦C a una velocidad de 10 ◦C/min. La temperatura de inicio del pico de oxidación (Tmax) determina la temperatura de inicio de la oxidación.

2.6.7. Extracción de Compuestos Polifenólicos de los Aceites de Oliva Enriquecidos

La extracción de polifenoles de los aceites de oliva se realizó según lo descrito por Kalantzakis et al. [21]. Se disolvieron muestras de aceite de oliva (1 g) en 2 ml de n-hexano y 2 ml de una solución de metanol/agua 60:40 (v/v). La solución final se centrifugó a 4500 rpm durante 5 min después de una agitación vigorosa. La fracción soluble en metanol/agua (polar) de las muestras de aceite de oliva se obtuvo y utilizó tal cual.

2.6.8. Contenido total de polifenoles

Como se mencionó anteriormente, el contenido de polifenoles totales (TPC) se determinó mediante el método de Folin-Ciocalteu. El TPC se expresó en mg equivalentes de ácido gálico (GAE) por Kg de aceite de oliva.

2.6.9. Actividad de eliminación de radicales

El método DPPH, como se mencionó anteriormente, se utilizó para evaluar la actividad de eliminación de radicales de los polifenoles extraídos de las muestras de aceite de oliva. La capacidad de captación del radical DPPH se expresó como porcentaje de inhibición y la IC50 se calculó a partir de las actividades de captación (porcentaje) frente a las concentraciones de la curva de muestra correspondiente.

2.7. Análisis estadístico

Los resultados se dan para la media y la desviación estándar (DE) de tres ensayos contemporáneos. Usando el paquete de software estadístico IBM SPSS Statistics (Versión 26) (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.), se realizó un ANOVA de una vía para determinar si había diferencias estadísticamente significativas entre los valores medios. Se utilizó un nivel significativo de p < 0.05.

3. Resultados y discusión

3.1. Recuperación de Polifenoles

Se realizó una fase acuosa de concentración de lecitina, donde se empleó el mismo procedimiento para recuperar los polifenoles. Debido a la baja concentración de lecitina del 1 por ciento, no se produjo micela de tensioactivo. Por otro lado, cuando había una alta concentración de lecitina al 5 por ciento, esto reducía su solubilidad en agua y daba como resultado la formación de dos fases. Tanto la temperatura de equilibrio (45 ◦C) como el contenido de sal (30 por ciento) fueron constantes (tercera recuperación). La fase micelar total de las tres recuperaciones se expresa utilizando la columna Total SP (Figura 2).

Además, se utilizaron procedimientos de sonicación (75 por ciento de energía eléctrica durante 60, 75 y 90 min con un ciclo de pulso de 0,5) con una sonda ultrasónica para examinar la reducción del tamaño de las micelas. Finalmente, se añadió al aceite un 0,5 por ciento de las dispersiones de polifenoles recuperadas por el método CPE para mejorarlo. Este resultado puede ser explicado por Víctor-Ortega et al. [22], quienes encontraron que la solubilización de compuestos fenólicos en micelas de surfactante se saturaba a concentraciones más altas de surfactante y la retención de polifenoles disminuía. Además, según Sliwa y Sliwa [23], cuando la concentración de surfactante está por debajo de la concentración micelar crítica (CMC), la solubilidad de la sustancia activa es baja.

En Katsoyannos et al. [24], cuando se aplicó un 6 por ciento de surfactante Triton X-114, la técnica CPE en OMW (después de la eliminación de compuestos grasos) produjo recuperaciones superiores al 60 por ciento. En otro estudio, Gortzi et al. [25], mostró que utilizando CPE simple y posterior, la recuperación total de fenol de OMW con varias concentraciones de Genapol X-080 (2, 5 y 20 por ciento, v/v) alcanzó hasta el 89,5 por ciento. Además, Katsoyannos et al. [16], utilizó un CPE de dos pasos con 5 por ciento más 5 por ciento de Tween 80 para recuperar hasta el 94,4 por ciento de los fenoles totales de la OMW. Finalmente, en Alibade et al. [6], la lecitina se utilizó como tensioactivo, mientras que el CPE se utilizó para recuperar compuestos fenólicos de los residuos de lodos de vino (WSL). Las fases ricas en surfactantes mostraron una fuerte actividad antioxidante. Sus hallazgos muestran que CPE y lecitina se pueden utilizar para separar con éxito los polifenoles de WSL.

3.2. Enriquecimiento de Aceite de Oliva con Polifenoles de Aguas Residuales de Aceite de Oliva

Se observó una alteración en las propiedades organolépticas de las dispersiones micelares después de 0.5 por ciento p/v de enriquecimiento (turbidez). Esta modificación condujo a la selección final de un enriquecimiento de lecitina al 3 por ciento. Para obtener mejores resultados, se combinó la primera recuperación con la segunda y la tercera. Además, la sonicación resultó exitosa en la reducción de las dispersiones micelares. El sistema petrolero respondió negativamente a cantidades de 1 por ciento y 5 por ciento. Después de algunas horas de enriquecimiento, se observó el precipitado en las muestras de aceite.

La muestra inicial se sometió al método CPE, lo que provocó que la concentración de polifenoles descendiera de 3448 mg a 346 mg GAE/Kg (Figura 3). A nivel molecular, la reducción en el número de puentes de hidrógeno entre los polifenoles y el agua permitió la incorporación de polifenoles a la micela a expensas de su solubilización [26]. Luego, las micelas se trataron con sonicación y metanol para extraer los polifenoles, aumentando el contenido de polifenoles a 1562 mg GAE/Kg. La concentración final de polifenoles fue de 504 mg GAE/Kg (después de la sonicación), lo que demuestra que una disminución en la dispersión micelar resulta en una caída en la concentración de polifenoles totales [27]. Además, el tiempo ultrasónico prolongado hace que las partículas se disuelvan en el solvente, lo que reduce el valor de TPC [28].

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