5.2. Análisis de aceites esenciales

El aislamiento de los aceites esenciales por hidrodestilación se realizó en un aparato tipo Clevenger durante 3 h [64].

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y puede eliminar las especies reactivas de oxígeno, prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Los análisis de los aceites se llevaron a cabo mediante cromatografía de gases (GC) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS). Los análisis de GC se realizaron utilizando un cromatógrafo de gases (Agilent 7890A, Palo Alto, CA, EE. UU.), equipado con un 30 m × 0.25 mm d.i. espesor de película HP-5 columna capilar (Agilent J&W, Santa Clara, CA, EE. UU.). Se utilizó el siguiente programa de temperatura: de 60 ◦C a 246 ◦C a razón de 3 ◦C min−1 y luego se mantuvo a 246 ◦C durante 20 min (tiempo total de análisis 82 min). Otras condiciones de operación fueron las siguientes: gas portador helio (pureza mayor o igual al 99,9999 por ciento —Air Liquide, Milán, Italia); caudal, 1,0 mL.min−1; temperatura del inyector, 250 ◦C; temperatura del detector, 300 ◦C. La inyección de 1 µL de muestra diluida (1:100 en n-hexano, p/p) se realizó con una relación de división de 1:20, usando un muestreador automático (Agilent, Modelo 7683B, Santa Clara, CA, EE. UU.).

Los análisis de GC-MS se llevaron a cabo utilizando un cromatógrafo de gases (Agilent 6890N, Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con un 30 m × 0,25 mm de d.i. con un espesor de película estacionario de 0,25 µm HP{ Columna capilar de {7}}ms (Agilent J&W, Santa Clara, CA, EE. UU.) acoplada con un detector selectivo de masas que tiene un dispositivo de ionización de electrones, EI y un analizador de cuadrupolo (Agilent 5973, Santa Clara, CA, EE. UU.). El programa de temperatura y las condiciones de operación cromatográficas (excepto el detector) fueron las mismas utilizadas para GC-FID. Las condiciones de MS fueron las siguientes: temperatura de la línea de transferencia de MS 240 ◦C; EI temperatura de la fuente de iones, 200 ◦C con energía de ionización de 70 eV; temperatura del cuadrupolo 150 ◦C; velocidad de escaneo, 3.2 escaneos.s−1 en el rango de escaneo m/z, (30 a 480). Para el manejo y procesamiento de cromatogramas y espectros de masas se utilizó el software MSD ChemStation (Agilent, rev. E.01.00.237, Santa Clara, CA, USA). Los compuestos se identificaron mediante la comparación de sus espectros de masas con los de la biblioteca de datos NIST02 del sistema GC/MS y las bibliotecas Adams [32,33]. Los resultados se confirmaron aún más mediante la comparación con el orden de elución del compuesto con sus índices de retención en las fases semipolares informados en la literatura [32]. Los índices de retención de los componentes se determinaron en relación con los tiempos de retención de una serie de n-alcanos (dos mezclas estándar C8-C20 y C21-C40) con interpolación lineal [65]. El porcentaje de componentes individuales se calculó en función de las áreas de los picos de GC sin corrección del factor de respuesta FID. Los resultados se muestran como el porcentaje de picos individuales ± desviación estándar de dos corridas cromatográficas independientes.

5.3. Actividad antifúngica

Se evaluó la actividad antifúngica del aceite esencial de S. cacaliifolia frente a hongos filamentosos y levaduras. Tres cepas clínicas de dermatofitos aisladas de uñas y piel (Epidermophyton floccosum FF9, Trichophyton mentagrophytes FF7 y Microsporum canis FF1), y cuatro cepas tipo dermatofitos de la Colección Española de Cultivos Tipo (T. mentagrophytes var. interdigital CECT 2958, T. rubrum CECT 2794, T. verrucosum CECT 2992 y M. gypseum CECT 2908), una cepa tipo Cryptococcus neoformans (C. neoformans YPO186), dos cepas clínicas de Candida aisladas de casos recurrentes de vulvovaginal (C. krusei LF33, C. guillermondii MAT23) y tres cepas tipo Candida (C. albicans ATCC 10231, C. tropicalis YPO128 y C. paraphimosis ATCC 90018). Todas las cepas se almacenaron en caldo de dextrosa Sabouraud con 20 % de glicerol a -80 ◦C y se subcultivaron en agar dextrosa Sabouraud (SDA) o agar papa dextrosa (PDA) antes de cada prueba, para garantizar condiciones óptimas de crecimiento y pureza.

Se utilizó un método de caldo de microdilución para determinar las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) y la concentración letal mínima (MLC) del aceite de acuerdo con el protocolo de referencia M38-A2 [66] del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) o M27-A3 [67] para hongos filamentosos y levaduras, respectivamente. La MIC fue la concentración más baja en la que no se observó crecimiento en los tubos de ensayo inoculados, mientras que la MLC fue la concentración más baja en la que no se observó crecimiento después de la inoculación en SDA de todos los tubos negativos. También se incluyeron un control negativo (medio no inoculado) y positivo (medio inoculado con DMSO al 1 por ciento).

5.4. Actividad antiinflamatoria

RAW 264.7, una línea celular de macrófagos leucémicos de ratón obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC TIB-71), se cultivó como informó anteriormente nuestro grupo [22].

La producción de NO se midió cuantificando la acumulación de nitritos en los sobrenadantes de cultivo, utilizando el reactivo de Griess [68]. Las células (00,6 × 106 células/pocillo) se cultivaron en 48-placas de cultivo de pocillos. Después de una estabilización durante la noche, los macrófagos se pretrataron durante 1 h con el aceite esencial (0.08–1.25 µL/mL) diluido en DMSO y luego activado con 50 ng/mL de LPS para 24 horas Se realizaron controles positivos (macrófagos estimulados por LPS) y negativos (macrófagos no tratados). Después de este período de incubación, volúmenes iguales de sobrenadantes de cultivo y reactivo de Griess [1:1 de diclorhidrato de N-(1-naftil) etilendiamina al 0,1 por ciento (p/v) y sulfanilamida al 1 por ciento (p/v) que contiene 5 por ciento ( p/v) H3PO4] se mezclaron y se incubaron durante 30 min, en la oscuridad. La absorbancia a 550 nm se registró en un lector de placas automatizado (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) y la concentración de nitrito se determinó a partir de una curva estándar de nitrito de sodio. Nuestro grupo ya demostró que el DMSO a la concentración máxima utilizada (0,4 por ciento) carece de efectos antiinflamatorios y de citotoxicidad (datos no mostrados).

RAW 264.7 (1,2 × 106 células/pocillo) se cultivó en 6-placas de pocillos y se dejó estabilizar durante 12 h. A continuación, las células se incubaron con el aceite esencial (0,64 µL/mL) durante 1 h seguido de activación con LPS (50 ng/mL) durante 24 h. Se consideraron un control negativo (células no tratadas) y un control positivo (células tratadas solo con LPS). Los lisados ​​​​celulares se prepararon como se describió previamente por Zuzarte et al. [22].

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Western para medir los niveles de proteína de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa{{0}} (COX-2). Las proteínas se separaron por electroforesis en SDS-poliacrilamida al 10 por ciento (v/v), a 130 V durante 1,5 h, y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (previamente activadas con metanol) a 400 mA durante 3 h. Después de bloquear las IgG no específicas con leche al 5 % (p/v) en TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con anticuerpos específicos contra iNOS (1:500; R & D Systems) o COX{{15} } (1:5000; Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante la noche, a 4 ◦C. A continuación, las membranas se lavaron durante 30 min con TBS-T (10 min, 3 veces) y se incubaron a temperatura ambiente, durante 1 h, con anticuerpos secundarios (1:40,000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX , EE. UU.) conjugado con peroxidasa de rábano picante. Los inmunocomplejos se detectaron utilizando un escáner de quimioluminiscencia (Image Quant LAS 500, GE, Boston, MA, EE. UU.). Las membranas se probaron con un anticuerpo antitubulina (1:20 000; Sigma) para garantizar que se cargara una cantidad equivalente de proteína. La cuantificación de proteínas se realizó utilizando ImageLab versión 6.1.0 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE. UU.).

5.5. Migración celular

NIH 3T3, una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (ATCC CRL-1658), se cultivó como se describió previamente en nuestro grupo [69].

5.5.2. Ensayo de migración celular

La migración celular se llevó a cabo utilizando el ensayo de herida por rasguño según lo informado por Martinotti y colegas [70] con ligeras modificaciones. Brevemente, se sembraron fibroblastos NIH 3T3 a 2,5 × 105 células/ml en 12-placas de pocillos. Después de 24 h de crecimiento, se realizó un raspado en la monocapa celular con una punta de pipeta de 20–200 µL. Las células separadas se eliminaron lavando las células con PBS estéril 1x. Se añadió DMEM con suero al 2 por ciento a todas las placas, en presencia o ausencia del aceite esencial. Usando un microscopio de contrato de fase, se adquirieron imágenes 0, 12 y 18 h después del rasguño, y se midió el área de la herida usando el software ImageJ/Fiji. Los resultados presentados se obtuvieron utilizando la siguiente ecuación

5.6. Viabilidad celular

El efecto de diferentes concentraciones del aceite esencial sobre la viabilidad tanto de los macrófagos como de los fibroblastos se llevó a cabo mediante el ensayo de reducción de resazurina. Brevemente, se sembraron macrófagos ({{0}}.6 × 106 células/ml) o fibroblastos (1,25 × 105 células/ml) en 48-placas de pocillos. Después de una estabilización durante la noche, se agregaron diferentes concentraciones del aceite esencial (0.08–1.25 µL/mL) diluido en DMSO durante 24 h. Al final del experimento, se retiró el medio y se añadió medio fresco que contenía resazurina (1:10) durante 1 h o 4 h, para macrófagos y fibroblastos, respectivamente. La absorbancia a 570 nm con un filtro de referencia de 620 nm se registró en un lector de placas automatizado (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). La viabilidad celular se determinó usando la siguiente ecuación:

donde AbsExp es la absorbancia (diferencia entre 570 y 620 nm) en las diferentes condiciones experimentales y AbsCT es la absorbancia en las células de control (sin aceite esencial).

5.7. Senescencia inducida por etopósido 

La senescencia se evaluó usando un kit de tinción de beta-galactosidasa disponible comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante (Cell Signaling Technology). Brevemente, se sembraron 2,5 × 104 fibroblastos en 12-placas de pocillos y se permitió su adherencia durante la noche. A continuación, se indujo la senescencia incubando las células con etopósido 12,5 µM durante 24 h. Se eliminó el etopósido y las células se lavaron con PBS 1x. A continuación, se permitió que las células se recuperaran durante 72 h en DMEM en ausencia o presencia de aceite esencial de S. cacaliifolia, y se evaluaron diariamente los cambios en la morfología. Después de 72 h, las células se fijaron durante 15 min con solución fijadora 1x (proporcionada en el kit comercial), seguido de lavados con PBS, y se incubaron durante la noche con una solución de tinción de beta-galactosidasa en una incubadora seca a 37 ◦C sin suministro de CO2. Se observaron diferentes campos bajo un microscopio para el desarrollo del color azul y se fotografiaron para el análisis de imágenes (8 imágenes por condición). Una tinción de color azul distinta era indicativa de actividad de beta-galactosidasa. El análisis cuantitativo se llevó a cabo utilizando ImageJ y se calculó el porcentaje de células senescentes con respecto al total de células.

5.8. Análisis estadístico

Los resultados se presentan como valores medios ± SEM (error estándar de la media) de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. La importancia estadística para los ensayos antiinflamatorios, de viabilidad celular y de senescencia se determinó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post-hoc de Dunnett utilizando GraphPad Prism versión 9.3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Para los ensayos de migración celular, la significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sydák. Se consideró que un valor de p < 0.05 representaba diferencias significativas.

Contribuciones de autor:Conceptualización, LS y AM; validación, AS, MJG, MTC y SP; análisis formal, JMA-S., MJG, AP y DF; investigación, JMA-S., AM y AP; recursos, AM, EC, MTC y LS; curación de datos, AP; redacción—preparación del borrador original, JMA-S., AP y AM; redacción: revisión y edición, MTC, LS y AM; visualización, JMA-S.; supervisión, LS y AM; administración de proyectos, LS; adquisición de fondos, LS y MTC Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Este trabajo fue financiado por COMPETE 2020—Programa Operativo de Competitividad e Internacionalización y fondos nacionales portugueses a través de FCT—Fundação para a Ciência ea Tecnologia, en el marco de los proyectos UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020 y LA/P/0058/2020.

Declaración de disponibilidad de datos:Los datos estarán disponibles a pedido.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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