Los ratones knockout para diamina oxidasa no son hipersensibles a la histamina administrada por vía oral o subcutánea

Abstracto

1. Objetivo

Evaluar la contribución de la diamino oxidasa endógena (DAO) en la inactivación de la histamina exógena, encontrar una cepa de ratón con mayor sensibilidad a la histamina y probar la eficacia de rhDAO en un modelo de desafío con histamina.

2. Métodos

Los ratones knockout para diamino oxidasa (KO) fueron desafiados con histamina administrada por vía oral y subcutánea en combinación con el bloqueador -adrenérgico propranolol, con los dos inhibidores de la histamina-N-metiltransferasa (HNMT) metopreno y tacrina, con ácido fólico para simular la lesión renal aguda y tratados con DAO humana recombinante. La temperatura corporal central se midió usando un microchip implantado por vía subcutánea y los niveles plasmáticos de histamina se cuantificaron usando un ensayo homogéneo de fluorescencia de resolución temporal.

3. Resultados

La temperatura corporal central y los niveles de histamina en plasma no fueron significativamente diferentes entre los ratones de tipo salvaje (WT) y DAO KO después del desafío con histamina oral y subcutánea con y sin lesión renal aguda o administración de inhibidores HNMT. El tratamiento con DAO humana recombinante redujo el área media bajo la curva (AUC) de la pérdida de temperatura corporal central en un 63 % (p=00,002) y la puntuación clínica en un 88 % (p<0.001). The AUC of the histamine concentration was reduced by 81%.

4. Conclusiones

La inactivación de la histamina exógena no está impulsada por la degradación enzimática y la filtración renal. El tratamiento con DAO humana recombinante redujo fuertemente la pérdida de temperatura corporal central inducida por histamina y las concentraciones de histamina y evitó el desarrollo de síntomas clínicos graves.

Palabras clave

Amina oxidasa (que contiene cobre) · Histamina N-metiltransferasa · Insuficiencia renal aguda · Metabolismo · Tacrina · Metoprina · Temperatura corporal

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Introducción

Más del 95 por ciento de toda la histamina en humanos se almacena en mastocitos y basófilos. Lo mismo es probable que sea cierto para muchos mamíferos. En humanos, las densidades de mastocitos son más altas en el tracto gastrointestinal, la piel y los pulmones [1] y, en consecuencia, estos órganos muestran síntomas inducidos por histamina en enfermedades con una clara participación de la activación de mastocitos. Las concentraciones intersticiales locales de histamina después de la desgranulación aguda pueden alcanzar 10–1000 µMs [2, 3, ver Recursos en línea]. En humanos, al igual que en perros y cerdos, las concentraciones plasmáticas normales de histamina están por debajo de 1 ng/ml (9 nM) y los síntomas comienzan a desarrollarse a unos pocos nanogramos por mililitro [4–7]. La hipotensión significativa con aumento de la frecuencia cardíaca se puede medir a partir de 5 ng/ml y cuando los niveles superan los 10 ng/ml, el desarrollo de broncoespasmo, arritmias cardíacas, hipotensión grave y espasmo coronario puede conducir a una disfunción multisistémica potencialmente mortal [8, 9]. La histamina no solo está implicada en la vasodilatación, los aumentos de la permeabilidad vascular, la hipoxia y el desarrollo de edema vascular, sino que también demuestra una implicación proinflamatoria que influye en el sistema inmunitario adaptativo mediante el reclutamiento, la maduración y la activación de células efectoras inmunitarias. Además, desempeña un papel en el sistema inmunitario innato al interactuar con las células dendríticas, las células asesinas naturales y los granulocitos [10, 11].

Las concentraciones basales de histamina en ratones y ratas están entre 20 y 100 ng/ml cuando se miden con métodos confiables y, por lo tanto, son muchas veces más altas que las encontradas en humanos [6, 7]. No está claro si estos altos niveles de histamina juegan algún papel fisiológico. Los roedores son notoriamente resistentes a la histamina con dosis letales del 50 por ciento (LD50) en diferentes cepas de ratones de 3000–4000 y 400–500 mg/kg después de la administración oral e intravenosa, respectivamente [12, 13]. La concentración máxima de histamina en plasma después de la administración en bolo de 400 mg/kg en un ratón de 20 g sería de aproximadamente 8 mg/ml suponiendo un volumen de plasma de 1 ml. Cuando se indujo la anafilaxia en humanos a través de una provocación controlada con una picadura de avispa, las concentraciones de histamina de 140 ng/ml se asociaron con una hipotensión grave potencialmente mortal [14]. ¿Cómo se metaboliza e inactiva la histamina?

La histamina muestra un 13 por ciento de unión media a proteínas plasmáticas y se filtra libremente en los riñones [15]. En teoría, la tasa de filtración glomerular (TFG) puede contribuir entre un 15 y un 20 por ciento a la vida media de 3 a 4 minutos que se encuentra en voluntarios sanos [5, consulte Recursos en línea]. Con una TFG normal de 100 ml/min y un volumen plasmático de 3000 ml, la vida media de la histamina sería de 20 min. En ratones, una TFG normal de 10 µl/min/g daría como resultado una vida media de histamina de 3 min [16, consulte Recursos en línea]. No obstante, la histamina muestra una alta tasa de extracción en el riñón, superando las tasas basadas en la TFG, y esta extracción se atribuye a la captación y reabsorción en las células tubulares proximales a través del transportador de cationes orgánicos 2 (OCT2), seguida de la inactivación enzimática [17, véase abajo]. En humanos, menos del 1 por ciento de la histamina radiactiva inyectada se encontró en la orina dentro de las primeras 6 horas [18]. La baja tasa de excreción de histamina en humanos, que también se observa en perros y gatos, ha sido confirmada por otros [19]. En tejidos de ratones y ratas, más del 50 por ciento de la radiactividad inyectada se encuentra en los riñones y menos del 2 por ciento como histamina 30 minutos después de la administración intravenosa [20]. Los riñones también fueron el órgano con mayor radiactividad después de la administración de altas dosis de histamina en ratas [21]. El transportador OCT2 se expresa mucho en riñones humanos y de roedores y podría ser responsable tanto de la extracción de histamina del compartimiento plasmático como de la reabsorción de histamina en el filtrado de orina primario en las células tubulares proximales [22, véase más adelante].

El transporte rápido de histamina extracelular desde el líquido intersticial después de la liberación de los mastocitos o el plasma a otros compartimentos alejados de las células endoteliales sería otra posibilidad para inactivar la histamina. Esto podría inhibir la inducción de hipotensión grave y fuga vascular mediada por la señalización de la óxido nítrico sintasa (NOS) endotelial y la unión a los receptores de histamina [23–25]. Sin embargo, no se dispone de datos en animales in vivo que estudien las tasas de transporte de histamina desde la circulación sistémica hacia las células endoteliales o parenquimatosas. En varios estudios in vitro, la histamina se transporta bidireccionalmente utilizando OCT2 y OCT3 de baja afinidad y alta capacidad [22, 26, 27]. La histamina es un excelente sustrato para el transportador OCT2 y OCT3 de rata, mostrando una mayor eficiencia de transporte en comparación con las proteínas OCT humanas equivalentes [26].

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Cuando se utilizan concentraciones bajas de histamina radiactiva en ratones, la metilación a través de la histamina-N-metiltransferasa (HNMT) parece ser la ruta principal de inactivación. Sin embargo, desafiar a los ratones con dosis más altas de histamina cambia el metabolismo a ácido imidazol acético (IMAA) y conjugados de ribósido, y solo se detecta una pequeña cantidad de derivados metilados [28–30]. Las concentraciones basales de histamina sérica cinco veces mayores en los ratones knock-out HNMT respaldan estos datos [31]. El ácido imidazolacético se genera a través de la oxidación de histamina por la diamino oxidasa (DAO) que libera acetaldehído de imidazol, que se convierte en IMAA y derivados ribósidos, principalmente en el hígado. La oxidación de la histamina a través de la DAO parece desempeñar un papel más importante en el catabolismo de la histamina después de la provocación oral en ratones, lo que no sorprende si se tiene en cuenta que en los ratones la expresión de la DAO es alta solo en el tracto gastrointestinal [30]. Cuando se realiza un desafío oral con histamina en humanos, la desaminación oxidativa a través de DAO es la vía catabólica dominante con IMAA como el principal metabolito urinario [18].

La diamina oxidasa es una amina oxidasa que contiene cobre y una de las dos enzimas capaces de inactivar la histamina [32]. En tejidos seleccionados, principalmente el intestino delgado y las células tubulares proximales del riñón, la DAO se localiza en estructuras granulares intracelulares mal definidas y se une extracelularmente a proteoglicanos de sulfato de heparán, mientras que la HNMT está presente solo en el citoplasma [33, 34]. La expresión de HNMT está muy extendida en todo el cuerpo, y se encuentran niveles más altos en el sistema nervioso central, la vejiga, el corazón, los riñones, el hígado, los pulmones y el tejido adiposo.

Después de la inhibición de la DAO con aminoguanidina, las ovejas mostraron síntomas clínicos extensos de toxicidad por histamina después de la provocación oral con histamina en comparación con los controles sin pretratamiento con aminoguanidina [35]. Un experimento similar en cerdos resultó en morbilidad y mortalidad severas en animales pretratados con aminoguanidina y posteriormente desafiados con histamina oral [36]. Las concentraciones medianas de histamina en plasma aumentaron 20- veces en cerdos con inhibición de la DAO. El tratamiento de ratas con aminoguanidina seguido de provocación oral con histamina aumentó la IMAA urinaria y redujo la concentración de histamina en aproximadamente cinco veces [37]. Estos datos indicaron que la DAO juega un papel crucial en la degradación de la histamina exógena administrada por vía oral.

En ratones, el tratamiento con aminoguanidina aumentó considerablemente las concentraciones de histamina en el intestino después de la provocación intravenosa con histamina [30]. Sin embargo, la aminoguanidina no es un inhibidor específico de la DAO, sino que también bloquea las tres enzimas NOS y parece bloquear el transporte de histamina en sangre a los tejidos [38, 39]. La administración de burimamida, un antagonista del receptor 2 de histamina, mostró efectos perjudiciales con aumento de la mortalidad en un modelo de shock circulatorio en ratas. Sin embargo, al mismo tiempo, se publicó que la burimamida es un potente inhibidor de la DAO [40, 41]. En perros, la burimamida provocó un aumento de 17-veces en la concentración media de histamina en plasma y una fuerte reducción en la presión arterial media [42]. Se creía que el efecto se debía a la posible activación de los mastocitos.

De manera similar, el papel de HNMT se estudió utilizando metilhistamina como inhibidor de HNMT, pero la metilhistamina también es un sustrato excelente para DAO [43]. La amodiaquina y la quinacrina son potentes inhibidores de la HNMT [44–46], pero también inhiben la DAO con una concentración inhibidora del 50 % (IC50) de aproximadamente 500 nM [47, datos no publicados]. Por lo tanto, los datos derivados del uso de inhibidores, que a menudo se usan en concentraciones altas, deben interpretarse con precaución, ya que es probable que se produzcan efectos fuera del objetivo conocidos y desconocidos que pueden distorsionar significativamente la relevancia fisiológica de los estudios in vivo.

Los estudios metabólicos podrían proporcionar alguna indicación de la importancia de las dos enzimas en la degradación de la histamina, pero el catabolismo de la histamina podría desvincularse de los efectos fisiológicos o fisiopatológicos. Las concentraciones compartimentales de histamina podrían ser críticas y el metabolismo podría estar aguas abajo.

Por lo tanto, decidimos utilizar el ratón knock-out (KO) de DAO para estudiar el papel de DAO en la degradación de la histamina exógena. Un segundo objetivo clave fue desarrollar un modelo de ratón con mayor sensibilidad a la histamina que nos permitiera estudiar mejor el papel de la histamina en varias cepas mutantes genéticas y probar la eficacia de la DAO humana recombinante en un modelo de desafío con histamina.

Cápsulas de Cistanche

material y métodos

modelos animales

Los experimentos se realizaron con ratones KO C57BL6/J Aoc1tm1b(EUCOMM)Hmgu (DAO) de 10–18-semanas de edad y compañeros de camada de tipo salvaje (WT). Los embriones heterocigotos fueron proporcionados por el Archivo Europeo de Mutantes de Ratones, Munich, Alemania, y se implantaron en ratones C57BL6/N pseudopreñados. Los ratones heterocigotos C57BL6/J descendientes se confirmaron mediante PCR (ver Recursos en línea) y luego se usaron para criar ratones DAO KO en la División de Investigación Biomédica de la Universidad Médica de Viena, mediante el protocolo animal GZ 66.009/{ {14}}WF/V/3b/2016. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo GZ 66.009/0258- V/3b/2019. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Educación, Ciencia e Investigación de Austria. Los animales se mantuvieron en un ciclo día-noche de 12:12 h a 22 °C con agua y alimento ad libitum. Para mediciones de temperatura no invasivas, se implantó un transpondedor (IPTT-300, BioMedic Data Systems Inc., EE. UU.) por vía subcutánea 2 semanas antes del experimento usando anestesia breve con isoflurano. El transpondedor mide la temperatura tres veces en un segundo y la media de estas mediciones se registra desde el exterior de la jaula mediante un lector. Este valor medio se utiliza luego para otros cálculos. Estos transpondedores subcutáneos se utilizan para evitar la manipulación excesiva de los animales y para evitar lesiones por la inserción repetida de sondas de temperatura rectal [48]. En varias especies animales, incluidos los roedores, se ha demostrado que la administración de histamina reduce la temperatura corporal y se considera la lectura más avanzada de los efectos de la histamina [49, 50]. Durante el período de observación, un veterinario experimentado evaluó los síntomas clínicos de acuerdo con una puntuación de hipersensibilidad publicada [51]. La puntuación varió de 0 (sin síntomas) a 1 (frotar y rascarse la cabeza y la nariz), 2 (actividad reducida con aumento de la frecuencia respiratoria y/o actividad reducida, hinchazón alrededor de la boca y los ojos), 3 (respiración dificultosa, cianosis alrededor de la cola y boca, sibilancias) y 4 (sin actividad después de pinchazos o temblores y convulsiones). Una puntuación de 5 denota muerte. Todos los experimentos de desafío se iniciaron entre las 9:00 y las 11:00 a. m. para evitar variaciones dependientes de la hora del día [52].

Montaje experimental general

Todas las sustancias se aplicaron en un volumen de 5 ml/kg. Propranolol (P0884, Sigma-Aldrich, Austria) se disolvió en solución salina y se aplicó por vía intraperitoneal (ip) a una concentración de 2 mg/kg 20 min antes de la provocación con histamina para aumentar la sensibilidad a la histamina [53]. Se disolvió diclorhidrato de histamina (H7250, Sigma-Aldrich, Austria) en H2O doblemente destilada (dd) y se diluyó adicionalmente en solución salina. Todas las concentraciones de histamina indicadas se refieren a la base de histamina (111,15 Dalton).

1. Administración oral y subcutánea de histamina

Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 60 min en total. Después de 40 min de ayuno, se administró propranolol y 20 min después se aplicó histamina a una concentración de 30 mg/kg por vía oral (po) mediante sonda oral. Para el modelo de exposición subcutánea (sc), los ratones recibieron histamina a una concentración de 50 mg/kg sin propranolol o 5 mg/kg con propranolol. Para la determinación de las concentraciones de histamina en plasma, se anestesió un subconjunto de ratones en diferentes momentos después de la provocación con histamina utilizando 10 mg/kg de xilazina y 100 mg/kg de ketamina. Se recogió plasma con citrato de ratones anestesiados mediante punción cardíaca. Se usaron de uno a cinco ratones por punto de tiempo y genotipo.

2. Inhibición concomitante de la histamina-N-metiltransferasa (HNMT)

Se disolvió metoprina (M338835, Toronto Research Chemicals, Canadá) en ácido láctico al 10 por ciento (L1875, Sigma-Aldrich, Austria), se diluyó más en solución salina y se administró ip a 3 mg/kg 1 h antes de la exposición con 5 mg/kg de histamina. Se disolvió tacrina (A79922, Sigma-Aldrich, Austria) en ddH2O, se diluyó adicionalmente en solución salina y posteriormente se aplicaron 10 mg/kg ip 1 h antes de 25 mg/kg de histamina sc y 2 mg/kg de propranolol. Se usó una concentración de 2 mg/kg de tacrina ip en combinación con 30 mg/kg de histamina po combinada con 2 mg/kg de propranolol.

Cistanche estandarizada

3. Inducción de lesión renal aguda (AKI) antes del desafío con histamina

Folic acid (F7876, Sigma-Aldrich, Austria) was reconstituted in ddH2O, further diluted in saline, and applied i.p. at a concentration of 100 mg/kg 48 h before challenge with 5 mg/kg s.c. histamine and 2 mg/kg propranolol. The degree of acute kidney injury was estimated using plasma creatinine values. As a cut-off for inclusion, a creatinine value of at least threefold above the mean baseline value was used as described [54]. Baseline plasma creatinine concentrations of 0.11 and 0.17 mg/dl were measured in two mice and therefore an inclusion cut-off of>Se seleccionó 42 mg/dl. El plasma de citrato extraído mediante punción cardíaca se utilizó para medir la creatinina utilizando un analizador Cobas (analizador Cobas C311, Roche, Suiza). Para determinar las concentraciones de histamina en plasma en diferentes momentos durante la exposición sc a la histamina con propranolol en la lesión renal aguda, se anestesiaron de dos a cuatro ratones por momento y se recogió plasma con citrato mediante punción cardíaca.

4. Rescate de DAO tras administración de histamina

La (rh)DAO humana recombinante con un motivo de unión a heparina mutado (descrito en Gludovacz et al. [55]) se aplicó por vía intravenosa (iv) a una concentración de 4 mg/kg 40 min antes de la aplicación de 2 mg/kg de propranolol y 60 min antes de la provocación con 5 mg/kg de histamina sc.

Para la determinación de las concentraciones de histamina y DAO en plasma, los ratones se trataron con 4 mg/kg de DAO o tampón iv 60 min antes de la exposición con 5 mg/kg de histamina sc combinada con 2 mg/kg de propranolol. Los ratones fueron anestesiados en diferentes momentos. El plasma de citrato se recogió mediante punción cardíaca de dos a tres ratones por punto de tiempo. Se recogió sangre en citrato de sodio al 3,8 por ciento y una parte se mezcló inmediatamente con aceturato de diminazeno (D7770, Sigma-Aldrich, Austria) dando como resultado una concentración final de 10 µM para inhibir la degradación de histamina por rhDAO.

Análisis de expresión génica

Las muestras de tejido se congelaron por choque en nitrógeno líquido y el ARN total se obtuvo con el kit FavorPrep Tissue Total RNA (FATRK001, Favorgen, Taiwán) después de la homogeneización del tejido con tubos de lisis (Lysing Matrix E, MP Biomedicals, Alemania) en un Precellys 24 (Bertin Instruments, Francia). La transcripción inversa se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc OneScript Plus (G236, ABM Good, Canadá). Para la PCR cuantitativa se utilizó BrightGreen Express 2x Mastermix (MasterMix-EL, ABM Good, Canadá). Los cebadores que abarcan exones para DAO, HNMT e histidina descarboxilasa (HDC) se diseñaron utilizando el software Primer3 (Tabla 1 de recursos en línea). El gen de limpieza RPLP0 se utilizó para la normalización [56].

mancha occidental

Para el análisis de transferencia Western, las muestras de tejido congeladas se lisaron en tampón de fosfato K 20 mM (pH 7,2) utilizando tubos de lisis (tubos Lysing Matrix E, MP Biomedicals, Alemania) en un Precellys 24 (Bertin Instruments, Francia) . La concentración de proteína total se determinó utilizando el kit de ensayo QuantiPro BCA (QPBCA-1KT, Sigma, Austria). Para la electroforesis en gel de poliacrilamida, se separaron 40 µg de proteína total y 40 ng de DAO murina recombinante (proporcionada por EG, Universidad de Recursos Naturales y Ciencias de la Vida, Viena, Austria, usando los métodos descritos en [57]) usando un gel de Tris-glicina al 12 por ciento ( 4561043, Bio-Rad, EE. UU.). Se utilizó un anticuerpo monoclonal ABP1 (sc-515908, Santa Cruz, EE. UU.) para la detección de DAO a una concentración de 0,4 µg/ml, y un anticuerpo monoclonal GAPDH (2118, Cell Signal Technology, EE. UU.) como carga. control a una dilución de 1:2000. El anticuerpo IgG-HRP anti-ratón monoclonal (A2554, Sigma Aldrich, Austria) y el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo (A0545, Sigma Aldrich, Austria) se utilizaron como anticuerpos de detección a una dilución de 1:40.000. Las imágenes se adquirieron utilizando Clarity Max Western ECL Substrate (1705062, BioRad, EE. UU.) en un ChemiDoc Imaging System (17001401, Bio-Rad, EE. UU.).

Cistanche tubulosa

Medición de actividad DAO

La actividad de la diamina oxidasa de diferentes tejidos homogeneizados y la inhibición por metopreno y tacrina se midieron como se describe [58]. Las muestras de tejido congeladas se lisaron en tampón K-fosfato 20 mM (pH 7,2) usando tubos de lisis en un Precellys 24. La concentración de proteína total se determinó usando el kit de ensayo QuantiPro BCA y 500 µg de extractos de proteína total de diferentes tejidos se incubaron durante 120 min con orto-aminobenzaldehído (oABA) y ddH2O o cadaverina (CAD) 200 µM. Delta-1-piperidina, el producto de autociclación de CAD después de la desaminación por DAO, se condensa con oABA formando un fluoróforo, que se puede medir a EX440/30 y EM620/40 nm. Para la determinación de la inhibición de DAO, se preincubó rhDAO con metopreno y tacrina a diferentes concentraciones durante 30 min y se midió como se describe anteriormente.

Para la determinación de la actividad DAO, se mezclaron homogeneizados de tejido con una concentración de proteína de 200 µg/ml con HRP (concentración final 1,2 µg/ml, P6782, Sigma-Aldrich, Austria) y aminoguanidina (concentración final 10 µM, 396494, Sigma-Aldrich , Austria) o tampón K-fosfato (pH 7,2) y se incubó durante 15 min a 37 grados. Se añadió Amplex red™ (concentración final 100 µM, A12222, Thermo Scientific, EE. UU.) y las reacciones se iniciaron mediante la adición de una concentración final de putrescina de 200 µM (51799, Sigma-Aldrich, Austria). Se utilizó tampón de fosfato de potasio (pH 7,2) como control negativo. Las muestras se incubaron a 37 grados y se midieron cada 10 min durante 120 min usando EX550 y EM590 nm. La señal específica de DAO se calculó sustrayendo muestras con aminoguanidina, un inhibidor de DAO potente e irreversible, de muestras con tampón K-fosfato.

Para las mediciones de actividad de DAO en plasma en ratones que recibieron Rhoda iv, se usó un ensayo híbrido usando un anticuerpo monoclonal del clon de línea celular de hibridoma anti-DAO 8/119 proporcionado por el Prof. Quaroni (Universidad de Cornell, Ithaca, NY), y se usó Amplex red™. Se recubrieron placas de fluorescencia negra de alta unión a proteínas (475,515, Thermo Scientific Nunc, Dinamarca) con 100 µl de 5 µg/ml de anti-DAO 8/119 en tampón de carbonato-bicarbonato 50 mM ( C3041, Sigma-Aldrich, Austria), se incubó durante la noche a 4 grados y posteriormente se bloqueó con 120 µl de BSA al 1 % (A4503, Sigma-Aldrich, Austria) durante 50 min a temperatura ambiente. Después de bloquear 100 µl de muestras de plasma y estándares, se agregaron previamente diluidos 1:10 en PBS y se incubaron durante 1 ha temperatura ambiente. Después se añadieron 90 µl de peroxidasa de rábano picante (concentración final de 1,2 µg/ml) y Amplex red™ (concentración final de 100 µM) en PBS con BSA al 0,1 % y las reacciones se iniciaron añadiendo 10 µl de putrescina (concentración final de 200 µM) o PBS. La fluorescencia se midió a 37 grados cada 5 min durante 120 min usando EX550 y EM590 nm. La solución de lavado era Tween-20 al 0,1 por ciento (P1379, Sigma-Aldrich, Austria) en PBS. Se preparó una curva estándar de 3-30 ng/ml de rhDAO en plasma de ratón. Todas las mediciones se realizaron por duplicado.

Mediciones de histamina

Se usó plasma de citrato que contenía diminazeno-aceturato 10 µM (D7770, Sigma-Aldrich, Austria) para medir las concentraciones de histamina usando el kit dinámico de fluorescencia resuelta en el tiempo homogéneo (HTRF) de histamina (62HTMDPET, Cisbio, Francia). El kit se utilizó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se usó una curva estándar de histamina en plasma agrupado de ratones C57Bl/6J para la cuantificación. Todas las concentraciones de histamina se refieren a la base de histamina y todas las mediciones se realizaron por duplicado.

análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism versión 8.4.0. (GraphPad Software Inc. San Diego). La significación estadística de las diferencias en la actividad de la DAO en los homogeneizados de tejido se calculó mediante un ANOVA de medidas repetidas con corrección de Geisser-Greenhouse. El área bajo las curvas (AUC) de las mediciones individuales de la temperatura corporal central y las puntuaciones clínicas durante un experimento se compararon mediante pruebas t no pareadas bilaterales sin la corrección de Welch. Las concentraciones de histamina en plasma entre los grupos se compararon con un ANOVA de dos vías. Para la comparación de las concentraciones de histamina en plasma después del desafío sc entre ratones con diferentes genotipos, con y sin lesión renal aguda y que recibieron DAO o tampón, los datos se agruparon en intervalos para tener en cuenta los valores faltantes en subgrupos individuales (genotipos: 5, 1{{ 14}}, 20, 30, 40, 45, 60 min Insuficiencia renal aguda: 0, 10-15, 20-30, 40-45 y 60 min DAO: 0, 10, 30 y 45 min). Se usó una prueba t no pareada de dos caras para evaluar las diferencias en las concentraciones de creatinina en plasma de ratones tratados con y sin 100 mg/kg de ácido fólico. La significación estadística se definió como p<0.05 in all tests.

extracto de cistanche

Conclusión

Los ratones DAO KO eran esencialmente indistinguibles de los ratones WT usando desafíos exógenos de histamina oral y subcutánea. La participación de HNMT en la inactivación de la histamina que conduce a la reducción de los síntomas, la topología es moderada en el mejor de los casos, pero los resultados de la inhibición farmacológica pueden considerarse preliminares. Los datos que utilizaron la inhibición de HNMT con metopreno mostraron una tendencia hacia la participación de la DAO endógena en la inactivación de la histamina. Los riñones participan en la extracción rápida de histamina de la circulación, pero los ratones knockout para la 509 diamina oxidasa siete veces elevados no son hipersensibles a las concentraciones de histamina administradas por vía oral o subcutánea... 1 3 no se tradujeron en un fenotipo exagerado medido usando la temperatura central pérdida como lectura fenotípica. El uso de DAO humana o de ratón recombinante podría respaldar o ayudar a descartar la participación de la histamina en varios modelos animales con sospecha de desgranulación de mastocitos acompañada de una liberación rápida y masiva de histamina, o con una mayor inducción de la enzima histidina descarboxilasa seguida de la liberación de histamina recién sintetizada. histamina durante horas. Podría valer la pena estudiar la reproducción de un verdadero ratón doble KO con copias inactivas de los genes DAO y HNMT, si es viable. Los ratones KO individuales de DAO o HNMT no muestran fenotipos obvios. [datos no publicados, 31] De manera similar, probar la participación de los dos principales transportadores de histamina, OCT2 y OCT3, en las alteraciones fenotípicas inducidas por histamina podría permitirnos obtener una mejor comprensión de los mecanismos detrás del desarrollo de síntomas mediados por histamina en roedores y en consecuencia, potencialmente también en los seres humanos. A pesar de los importantes esfuerzos de investigación durante más de 100 años desde su descubrimiento, todavía tenemos mucho camino por recorrer antes de obtener una verdadera comprensión del catabolismo de la histamina.

Referencias

1. Boehm T, Ristl R, Joseph S, et al. Trastornos del metaboloma y del lipidoma durante un evento grave de activación de mastocitos en un paciente con mastocitosis sistémica indolente. J Allergy Clin Immunol. 2021. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2021.03.043. 2. Packard KA, Khan MM. Efectos de la histamina en Th1/Th

2 equilibrio de citoquinas. Int Immunopharmacol. 2003;3:909–20. https://doi.org/ 10.1016/S1567-5769(02)00235-7.

3. Hesterberg R, Sattler J, Lorenz W, et al. Contenido de histamina, actividad de diamino oxidasa y actividad de histamina metiltransferasa en tejidos humanos: ¿realidad o ficción? Acciones de los agentes. 1984;14:325–34. https://doi.org/10.1007/BF01973821.

4. Dyer J, Warren K, Merlin S, et al. Medición de histamina en plasma: descripción de un método mejorado y valores normales. J Allergy Clin Immunol. 1982;70:82–7. https://doi.org/10.1016/ 0091-6749(82)90233-0.

5. Pollock I, Murdoch RD, Lessof MH. Histamina plasmática y tolerancia clínica a la histamina infundida en sujetos normales, atópicos y con urticaria. Acciones de los agentes. 1991; 32:359–65. https://doi.org/10. 1007/BF01980899.

6. Liu J, Wang L, Hu W, et al. Desarrollo de un método UHPLC-MS/MS para la determinación de histamina plasmática en varias especies de mamíferos. J Chromatogr B. 2014;971:35–42. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2014.08.043.

7. Xu Y, Kang T, Dou D, et al. La evaluación y optimización del modelo animal para la reacción anafilactoide inducida por inyecciones. Asian Pac J Allergy Immunol. 2015;33:330–8. https://doi.org/ 10.12932/AP0619.33.4.2015.

8. Maintz L, Novak N. Histamina e intolerancia a la histamina. Soy J Clin Nutr. 2007;85:1185–96. https://doi.org/10.1093/ajcn/85.5. 1185.

9. Ginsburg R, Bristow MR, Kantrowitz N, et al. Provocación con histamina del espasmo clínico de la arteria coronaria: implicaciones sobre la patogenia de la angina de pecho variante. Am Heart J. 1981;102:819–22. https://doi.org/10.1016/0002-8703(81) 90030-2.

10. O'Mahony L, Akdis M, Akdis CA. Regulación de la respuesta inmune e inflamación por histamina y receptores de histamina. J Allergy Clin Immunol. 2011;128:1153–62. https://doi. org/10.1016/j.jaci.2011.06.051.

11. Thurmond RL, Gelfand EW, Dunford PJ. El papel de los receptores de histamina H1 y H4 en la inflamación alérgica: la búsqueda de nuevos antihistamínicos. Nat Rev Descubrimiento de drogas. 2008;7:41–53. https://doi.org/10.1038/nrd2465.

12. Pericin C, Thomann P. Comparación de la toxicidad aguda del clioquinol, la histamina y el cloroformo en diferentes cepas de ratones. En: Chambers PL, Günzel P, editores. Mecanismo de acción tóxica sobre algunos órganos diana. Berlín: Springer; 1979. pág. 371–3.

13. Lamanna C, Ross HE. Relación de la dosis tóxica letal con el peso corporal del ratón. Toxicol Appl Pharmacol. 1968; 13:307–15. https://doi.org/10.1016/0041-008X(68)90104-X.

14. Van der Linden P, Hack C, Poortman J, et al. El desafío de la picadura de insecto en 138 pacientes: relación entre la gravedad clínica de la anafilaxia y la activación de los mastocitos. J Allergy Clin Immunol. 1992;90:110–8. https://doi.org/10.1016/S0091-6749(06) 80017-5.

15. Williams WR, esquisto DJ. Desplazamiento in vitro de mediadores vasoactivos de las proteínas plasmáticas: un posible mecanismo para las reacciones pseudoalérgicas a los fármacos bloqueadores neuromusculares. Hermano J Anaesth. 1992;69:508–10. https://doi.org/10.1093/bja/69.5.508.

16. Sasaki Y, Iwama R, Sato T, et al. Estimación de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes utilizando una ecuación simplificada. Physiol Rep. 2014;2:e12135. https://doi.org/10.14814/phy2.12135.

17. Helander CG, Lindell SE, Westling H. La eliminación renal de histamina marcada con C14-de la sangre en el hombre. Scand J Clin Lab Investig. 1965. https://doi.org/10.1080/00365516509083360.

18. Sjaastad O, Sjaastad ÖV. Catabolismo de la histamina 14C administrada por vía oral en el hombre. Acta Pharmacol Toxicol. 1974; 34:33–45. https://doi.org/10.1111/j.1600-0773.1974.tb02011.x.

19. Schayer OR. El metabolismo de la histamina en varias especies. Br J Pharm Chemoth. 1956; 11:472–3. https://doi.org/10.1111/j. 1476-5381.1956.tb00020.x.

20. Snyder SH, Axelord J, Bauer H. El destino de la histamina C14-en tejidos animales. J Pharmacol Exp Ther. 1964; 144: 373–9.

21. Rose B, Browne JSL. La distribución y tasa de desaparición de histamina inyectada por vía intravenosa en la rata. Soy J Physiol. 1938; 124: 412–20. https://doi.org/10.1152/ajplegacy.1938.124.2. 412.

22. Koepsell H, Lips K, Volk C. Transportadores de cationes orgánicos poliespecíficos: estructura, función, roles fisiológicos e implicaciones biofarmacéuticas. Farmacéutica 2007;24:1227–51. https://doi.org/ 10.1007/s11095-007-9254-z.

23. Lantoine F, Iouzalen L, Devynck MA, et al. La producción de óxido nítrico en células endoteliales humanas estimulada por histamina requiere Ca2 más afluencia. Bioquímica 1998;330:695–9. https://doi.org/10.1042/bj3300695.

24. Mikelis CM, Simaan M, Ando K, et al. RhoA y ROCK median la fuga vascular inducida por histamina y el shock anafiláctico. Nat Comun. 2015;6:6725. https://doi.org/10.1038/ncomms7725.

25. Ashina K, Tsubosaka Y, Nakamura T, et al. La histamina induce la hiperpermeabilidad vascular al aumentar el flujo sanguíneo y la alteración de la barrera endotelial in vivo. Más uno. 2015;10:e0132367. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132367.

26. Schömig E, Lazar A, Gründemann D. Transportador extraneuronal de monoaminas y transportadores de cationes orgánicos 1 y 2: una revisión de la eficiencia del transporte. En: Sitte HH, Freissmuth M, editores. Transportadores de neurotransmisores. Berlín: Springer; 2006. pág. 151–80.

27. Ohtsu H. Avances en la investigación de señales de alergia en mastocitos: el papel de la histamina en las enfermedades inmunológicas y cardiovasculares y el sistema de transporte de histamina en la célula. J Pharmacol Sci. 2008;106:347–53. https://doi.org/10.1254/jphs.FM0070294.

28. Karjala SA, Turnquest B, Schayer RW. Metabolitos urinarios de histamina radiactiva. J Biol Chem. 1956; 219:9–12. https://doi. org/10.1016/S0021-9258(18)65762-X.

29. Schayer OR. Catabolismo de cantidades fisiológicas de histamina in vivo. Physiol Rev. 1959;39:116–26. https://doi.org/10.1152/physrev.1959.39.1.116.

30. Reilly MA, Schayer RW. Estudios in vivo sobre el catabolismo de la histamina y su inhibición. Br J Pharmacol. 1970; 38: 478–89. https://doi. org/10.1111/j.1476-5381.1970.tb10590.x.

31. Naganuma F, Nakamura T, Yoshikawa T, et al. La histamina N-metiltransferasa regula la agresión y el ciclo sueño-vigilia. Sci Rep. 2017;7:15899. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16019-8.

32. McGrath AP, Hilmer KM, Collyer CA, et al. Estructura e inhibición de la diamino oxidasa humana. Bioquímica. 2009;48:9810–22. https://doi.org/10.1021/bi9014192.

33. Schwelberger HG. Análisis de tejido y localización subcelular de diamino oxidasa de mamíferos mediante microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal. Infamm Res. 1998;47:60–1. https://doi.org/ 10.1007/s000110050273.

34. Nishibori M, Tahara A, Sawada K, et al. Localización neuronal y vascular de la histamina N-metiltransferasa en el sistema nervioso central bovino. Eur J Neurosci. 2000;12:415–24. https://doi.org/ 10.1046/j.1460-9568.2000.00914.x.

35. Sjaastad ÖV. Potenciación por aminoguanidina de la sensibilidad de los ovinos a la histamina administrada por vía oral. Efecto de la amino-guanidina sobre la excreción urinaria de histamina endógena. Exp fisiol. 1967;52:319–30. https://doi.org/10.1113/expphysiol.1967.sp001 918.

36. Sattler J, Häfner D, Klotter HJ, et al. Histaminas inducidas por alimentos como problema epidemiológico: elevación de la histamina plasmática y alteraciones hemodinámicas tras la administración oral de histamina y bloqueo de la diaminooxidasa (DAO). Acciones de los agentes. 1988; 23:361–5. https://doi.org/10.1007/BF02142588.

37. Bowman MA, Simell OG, Peck AB, et al. Farmacocinética de la administración de aminoguanidina y efectos sobre la frecuencia de diabetes en ratones diabéticos no obesos. J Pharmacol Exp Ther. 1996;279:790–4.

38. Matejovic M, Krouzecky A, Martinkova V, et al. Inhibición selectiva de la sintasa de óxido nítrico inducible durante la bacteriemia porcina hiperdinámica a largo plazo. Choque. 2004; 21:458–65. https://doi. org/10.1097/00024382-200405000-00010.

39. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Sintasas de óxido nítrico: estructura, función e inhibición. Biochem J. 2001;357:593–615. https://doi.org/10.1042/bj3570593.

40. Altura BM, Halevy S. Acciones beneficiosas y perjudiciales de los antagonistas de los receptores de histamina H1- y H2-en el shock circulatorio. PNAS. 1978;75:2941–4. https://doi.org/10.1073/pnas.75.6.2941.

41. Thomas LL, Bochner BS, Liechtenstein LM. Inhibición de la actividad histaminasa derivada de leucocitos polimorfonucleares humanos por antagonistas H-2. Biochem Pharmacol. 1978; 27:2562–5. https://doi.org/10.1016/0006-2952(78)90327-1.

42. Thermann M, Lorenz W, Schmal A, et al. Influencia de los antagonistas de los receptores H1-y H2-en el sistema circulatorio y las concentraciones endógenas de histamina en plasma en perros. Acciones de los agentes. 1977; 7: 97–101. https://doi.org/10.1007/BF01964888.

43. Elmore BO, Bollinger JA, Dooley DM. Diamina oxidasa de riñón humano: expresión heteróloga, purificación y caracterización. J Biol Inorg Chem. 2002;7:565–79. https://doi.org/10. 1007/s00775-001-0331-1.

44. Duch DS, Bowers SW, Nichol CA. Elevación de los niveles de histamina cerebral por inhibidores de diaminopirimidina de histamina N-metil transferasa. Biochem Pharmacol. 1978;27:1507–9. https://doi. org/10.1016/0006-2952(78)90109-0.

45. Horton JR, Sawada K, Nishibori M, et al. Base estructural para la inhibición de la histamina N-metiltransferasa por diversos fármacos. J Mol Biol. 2005;353:334–44. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2005. 08.040.

46. ​​Horton JR, Sawada K, Nishibori M, et al. Dos formas polimórficas de histamina metiltransferasa humana: comparaciones estructurales, térmicas y cinéticas. Estructura. 2001;9:837–49. https://doi.org/10.1016/S0969-2126(01)00643-8.

47. Duch DS, Bacchi CJ, Edelstein MP, et al. Inhibidores del metabolismo de la histamina in vitro e in vivo: correlaciones con la actividad antitripanosómica. Biochem Pharmacol. 1984; 33: 1547–53. https://doi.org/10.1016/0006-2952(84)90426-X.

48. Hox V, Desai A, Bandara G, et al. El estrógeno aumenta la gravedad de la anafilaxia en ratones hembra a través de una mayor expresión de óxido nítrico sintasa endotelial y producción de óxido nítrico. J Allergy Clin Immunol. 2015;135:729-736.e5. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2014.11.003.

49. Packman EW, Rossi GV, Harrisson JWE. El efecto de la histamina y los antihistamínicos sobre la temperatura corporal. J Pharm Pharmacol. 1953;5:301–10. https://doi.org/10.1111/j.2042-7158.1953.tb139 90.x.

50. Morris SC, Perkins C, Potter C, et al. Optimización de la inhibición farmacológica de la anafilaxia mediada por IgE en ratones. J Allergy Clin Immunol. 2021; 149: 671–84. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2021.06.022.

51. Li XM, Serebrisky D, Lee SY, et al. Un modelo murino de anafilaxia del maní: las respuestas de las células T y B a un alérgeno principal del maní imitan las respuestas humanas. J Allergy Clin Immunol. 2000;106:150–8. https://doi.org/10.1067/mai.2000.107395.

52. Hasegawa A, Watanabe M, Osada H, et al. Influencia de los glucocorticoides en las variaciones dependientes de la hora del día en la anafilaxia sistémica mediada por IgE, histamina y factor activador de plaquetas en diferentes cepas de ratones. Biochem Biophys Res Comun. 2018;495:2184–8. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.12.099.

53. Fishel CW, Szentivanyi A, Talmage DW. Sensibilización y desensibilización de ratones a histamina y serotonina por neurohumores. J Immunol. 1962;89:8–18.

54. Sementales LJ, Whitaker RM, Schnellmann RG. Biogénesis mitocondrial suprimida en lesión renal aguda inducida por ácido fólico y fibrosis temprana. Toxicol Lett. 2014;224:326–32. https://doi. org/10.1016/j.toxlet.2013.11.014.

55. Gludovacz E, Schuetzenberger K, Resch M, et al. Las mutaciones del motivo de unión a heparina de la diamina oxidasa humana permiten el desarrollo de un biofarmacéutico degradador de histamina de primera clase. Elife. 2021;10:e68542. https://doi.org/10.7554/eLife. 68542.

56. Eissa N, Kermarrec L, Hussein H, et al. Idoneidad de los genes de referencia para la normalización del ARN mensajero en colitis inducida por 24-ácido dinitrobenceno sulfónico (DNBS) de ratón mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Sci Rep. 2017;7:42427. https://doi.org/10. 1038/srep42427.

57. Gludovacz E, Maresch D, Bonta M, et al. Caracterización de la diamino oxidasa humana recombinante (rhDAO) producida en células de ovario de hámster chino (CHO). J Biotecnología. 2016;227:120–30. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.04.002.

58. Boehm T, Karer M, Gludovacz E, et al. Cuantificación simple, sensible y específica de la actividad de la diamino oxidasa en matrices complejas utilizando fluoróforos recién descubiertos derivados de sustratos naturales. Infamm Res. 2020;69:937–50. https://doi.org/10. 1007/s00011-020-01359-5.

59. Matsumura Y, Tan EM, Vaughan JH. Hipersensibilidad a la histamina y anafilaxia sistémica en ratones con bloqueo beta-adrenérgico farmacológico: protección por nucleótidos. J Allergy Clin Immunol. 1976;58:387–94. https://doi.org/10.1016/0091- 6749(76)90119-6.

60. Hunter AJ, Murray TK, Jones JA, et al. La farmacología colinérgica de tetrahidroaminoacridina in vivo e in vitro. Br J Pharmacol. 1989;98:79–86. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381. 1989.tb16865.x.

61. Rabe M, Schaefer F. Modelos de ratón no transgénicos de enfermedad renal. Nefrona. 2016;133:53–61. https://doi.org/10.1159/00044 5171.

62. Miyamoto Y, Nakano S, Kaneko M, et al. Evaluación clínica de un nuevo inhibidor de proteasa sintético en cirugía a corazón abierto. Efecto sobre la liberación de serotonina e histamina en plasma y la conservación de la sangre. ASAÍO. 1992;38:M395-8. https://doi.org/10.1097/00002480- 199207000-00063.

63. Oncología de carrera: oncología de precisión. https://www.raceoncology. com/. Consultado el 23 de noviembre de 2021

64. Myers JW, Von Hof DD, Kuhn JG, et al. Reacciones anafilactoides asociadas a infusiones de bisantreno. Investigación de nuevas drogas. 1983; 1: 85–8. https://doi.org/10.1007/BF00180195.

65. Reilly MA, Schayer RW. Más estudios sobre el catabolismo de la histamina in vivo. Br J Pharmacol. 1971; 43:349–58.

66. Malinski T, Taha Z, Grunfeld S, et al. Difusión de óxido nítrico en la pared de la aorta monitoreada in situ por microsensores porfirínicos. Biochem Biophys Res Comun. 1993; 193: 1076–82. https://doi. org/10.1006/bbrc.1993.1735.

67. Ginsburg M, Wajda I, Waelsch H. Incorporación de transglutaminasa e histamina in vivo. Biochem Pharmacol. 1963; 12:251–64. https://doi.org/10.1016/0006-2952(63)90148-5.

68. Vowinckel J, Stahlberg S, Paulmann N, et al. La histaminilación de residuos de glutamina es una nueva modificación postraduccional implicada en la señalización de la proteína G. FEBS Lett. 2012;586:3819–24. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2012.09.027.

69. McNally W, Roth M, Young R, et al. Determinación autorradiográfica cuantitativa de cuerpo entero de la distribución tisular de tacrina en ratas después de una dosis intravenosa u oral. Farmacéutica 1989;6:924–32. https://doi.org/10.1023/A:1015933210803.

70. Cumming P, Reiner PB, Vincent SR. Inhibición de la histamina-N-metiltransferasa de cerebro de rata por 9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina (THA). Biochem Pharmacol. 1990;40:1345–50. https://doi.org/10. 1016/0006-2952(90)90402-7.

71. Cavallito JC, Nichol CA, Brenckman WD, et al. Inhibidores liposolubles de la dihidrofolato reductasa. I. Cinética, distribución tisular y extensión del metabolismo de pirimetamina, metopreno y etorfina en ratas, perros y hombres. Eliminación de metab de drogas. 1978;6:329–37.

72. Nishibori M, Oishi R, Itoh Y, et al. La 9-amino-1, 2, 3, 4-tetrahidroacridina es un potente inhibidor de la histamina N-metiltransferasa. Jpn J Pharmacol. 1991;55:539–46. https://doi.org/10.1254/jjp.55. 539.

73. Hough LB, Khandelwal JK, Green JP. Inhibición del metabolismo de la histamina cerebral por metopreno. Biochem Pharmacol. 1986; 35:307–10. https://doi.org/10.1016/0006-2952(86)90530-7.

74. Kaneko H, Koshi S, Hiraoka T, et al. Inhibición de la lesión por reperfusión posisquémica del riñón por la diamina oxidasa. Biochim Biophys Acta. 1998; 1407: 193–9. https://doi.org/10.1016/S0925- 4439(98)00039-8.

75. Koshi S, Inoue M, Obayashi H, et al. Inhibición de la lesión por reperfusión post-isquémica del intestino delgado por la diamina oxidasa. Biochim Biophys Acta. 1991; 1075:231–6. https://doi.org/10.1016/ 0304-4165(91)90271-H.

Matthias Karer1 · Marlene Rager‑Resch1 · Teresa Haider2 · Karin Petroczi1 · Elisabeth Gludovacz3 · Nicole Borth3 · Bernd Jilma1 · Thomas Boehm1

1 Departamento de Farmacología Clínica, Universidad de Medicina de Viena, Waehringer Guertel 18-20, 1090 Viena, Austria

2 Departamento de Neurofisiología, Centro de Investigación del Cerebro, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria

3 Departamento de Biotecnología, Universidad de Recursos Naturales y Ciencias de la Vida, Viena, Austria