Las respuestas dicotómicas a la hipoxia fetal crónica conducen a un fenotipo de envejecimiento predeterminado Ⅰ
Nov 29, 2023
En breve
Utilizando la proteómica ascendente y el riñón como paradigma, presentamos una perspectiva integradora de las respuestas celulares a la hipoxia fetal crónica, descubriendo mecanismos fundamentales de la teoría de la programación fetal de las enfermedades del adulto que son principalmente aplicables a todos los demás órganos del cuerpo. El biomarcador característico de tejido y suero pro.fipromoverá el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para contrarrestar el fenotipo de envejecimiento prematuro que parece estar asociado con la programación fetal deenfermedades crónicas.
Reflejos
• La hipoxia fetal crónica induce cambios generalizados en la expresión de proteínas.
• La replicación y traducción reprimidas limitan la formación de nuevas nefronas.
• Múltiples caminospredeterminar un fenotipo de envejecimientoya durante el desarrollo.
• Sinergia de enFloridadaño inflamatorio, reparación ineficaz y metabolismo alterado.
• Abundancia reducida de proteínas antienvejecimiento.klotho y sirtuin 6 en ratones y humanos.
La restricción del crecimiento intrauterino inducida por hipoxia aumenta el riesgo decardiovascular, renal, y otraenfermedades cronicas en adultos, representando así un importante problema de salud pública. Aún así, no se sabe mucho sobre los mecanismos fetales que predisponen a estos individuos a la enfermedad. Utilizando un modelo de ratón previamente validado de hipoxia fetal y proteómica ascendente, caracterizamos la respuesta del riñón fetal al estrés hipóxico crónico. Los riñones fetales exhiben una respuesta dicotómica a la hipoxia crónica, que comprende, por un lado, adaptaciones celulares que promueven la supervivencia (glucólisis, autofagia y síntesis reducida de ADN y proteínas), pero, por otro lado, procesos que inducen un fenotipo similar a la senescencia (infiltración de células inflamatorias). , daño al ADN y proliferación reducida). Es importante destacar que la hipoxia crónica también reduce la expresión de las proteínas antienvejecimiento klotho y Sirt6, un mecanismo que se conserva evolutivamente entre ratones y humanos. En conjunto, descubrimos que el envejecimiento predeterminado durante el desarrollo fetal es un evento clave enhipoxia crónica, estableciendo una base sólida para la hipótesis de Barker sobre la programación fetal de las enfermedades del adulto. Este fenotipo está asociado con un perfil de biomarcadores característico en muestras de tejido y suero, aprovechable para detectar y abordar el envejecimiento acelerado enenfermedades humanas hipóxicas crónicas.
La teoría de Barker sobre la programación fetal de las enfermedades del adulto (1, 2) afirma que los eventos adversos durante el desarrollo aumentan el riesgo de múltiples enfermedades crónicas en la edad adulta, incluyendohipertensión,diabetes mellitus,enfermedad pulmonar obstructiva, oenfermedad renal crónica(ERC). En nuestra sociedad que envejece constantemente, estos trastornos imponen una enorme carga económica que crece progresivamente debido al creciente número de pacientes que padecen uno o más de estos trastornos. Entre estos,ERCyenfermedad renal en etapa terminal(ESRD) no sólo representan factores de riesgo independientes de morbilidad y mortalidad cardiovascular, sino que también generan costos crecientes para las terapias de reemplazo renal, lo que las convierte en un importante problema de salud pública. Entre las estrategias para enfrentar esta tendencia, la dilucidación de los mecanismos que conectan la teoría de Barker y el desarrollo de la ERC juega un papel crucial. Una explicación plausible para la pérdida gradual de la función renal en la progenie con bajo peso al nacer plantea la hipótesis del establecimiento de un círculo vicioso que gira entre una superficie de filtración renal reducida, una mayor carga de trabajo sobre las nefronas restantes y un mayor daño que nuevamentedisminuye la capacidad de filtración(Brenner's hypothesis) (3). A common finding in intrauterine growth restriction (IUGR) babies is the reduced number of nephrons formed at the end of kidney development (4). Thus, a low nephron number at birth increases the risk for accelerated functional decline and irreversible renal tissue damage (5, 6). Among all possible intrauterine stress factors, chronic hypoxia due to placental insufficiency or pregnancy at high altitude (>2500 m sobre el nivel del mar, que afecta a más del 2% de la población mundial (7, 8)) pertenece a los factores más críticos y clínicamente relevantes para alterar el programa de desarrollo del embrión (9). Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales la hipoxia conduce a RCIU y a trastornos del desarrollo renal aún no se comprenden completamente y justifican una mayor investigación. En este estudio, evaluamos a nivel de proteoma los cambios moleculares en el riñón fetal tras la exposición del embrión de ratón en desarrollo al estrés hipóxico crónico y corroboramos algunos hallazgos clave en muestras de suero hipóxico humano. Proporcionamos evidencia sustancial de una variedad de mecanismos de interacción que, por un lado, permiten la supervivencia de las células en condiciones adversas, pero, por otro lado, promueven un número reducido de nefronas y un fenotipo prematuro similar a la senescencia. Mostramos además queADN específico de genLa hipermetilación pero también la hipometilación del ADN contribuyen a esta respuesta dicotómica a la hipoxia crónica. Por lo tanto, nuestros hallazgos establecen una base sólida para la hipótesis de Barker, revelando una serie de vías que predeterminan unafenotipo de envejecimientoya durante el desarrollo.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Diseño experimental y justificación estadística El objetivo de este estudio exploratorio fue descubrir cambios en el proteoma de riñones fetales completos derivados de fetos con RCIU para profundizar el conocimiento sobre los mecanismos fetales que predisponen a individuos pequeños para edad gestacional a enfermedades crónicas en la edad adulta. El estudio se basó en un perfil proteómico ascendente utilizando un sistema nano-LC acoplado a un espectrómetro de masas orbitrap de alta resolución. Para ello, se utilizaron y analizaron por duplicado en un experimento controlado y ciego seis riñones hipóxicos E18.5 y seis riñones normóxicos E18.5 de machos. Todas las replicaciones tuvieron éxito y ningún hallazgo experimental no pudo replicarse. Los datos proteómicos se analizaron utilizando el software MaxQuant 1.5.2.8 (incluido el motor de búsqueda Andromeda y el paquete de análisis estadístico Perseus) y agrupación de anotaciones funcionales. Para las consecuencias a largo plazo de la hipoxia fetal crónica sobre la función renal, se eligieron al azar cinco crías macho hipóxicas y cinco normóxicas y se analizaron a los 8 meses (se necesitan cinco animales para detectar una reducción del 30% en la TFG en animales fetales hipóxicos, según una variación del 15%, Alfa=0.05, Potencia=0.9). El experimento in vivo concluyó con la evaluación de la fibrosis renal y marcadores séricos después de 15 meses. Para validar algunos de los hallazgos clave de los experimentos con animales, se analizaron muestras de suero humano recolectadas en estudios controlados previos con voluntarios sanos (10). Todos los experimentos in vitro fueron ensayados y cegados con controles apropiados. La prueba estadística y los detalles experimentales se proporcionan en la leyenda de cada figura. Todos los datos se presentan e incluyen todos los valores atípicos.
animales
Se compraron ratones C57BL/6N de Janvier Labs, Francia, y se alojaron a 23 ◦C y entre 50 y 60 % de humedad en jaulas IVC con libre acceso a comida y agua y un ciclo de 12 h día/noche. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley suiza para el bienestar de los animales y fueron aprobados por las autoridades locales (Cantón de Berna BE96/11, BE105/14 y BE105/17). Para el apareamiento programado, se revisó que las hembras en reproducción tuvieran tapones vaginales todas las mañanas y, si estaban presentes, el momento se fijó en el día de gestación (E) 0,5. Las madres grávidas fueron asignadas aleatoriamente a un grupo de control normóxico (N=11) o expuestas a hipoxia constante (N=11) durante 7 días. Para la inducción de la hipoxia, las madres en el día de gestación E11.5 se transfirieron a una caja de guantes hipóxica (Coy Laboratory Products) y el contenido de oxígeno se redujo gradualmente al 10 % en 3 a 4 h. Un ventilador eléctrico dentro de la cámara mantenía una circulación de aire adecuada. El nivel de CO2 se mantuvo bajo quelando el exceso de CO2 en cartuchos llenos de cal sodada (Sigma, 72073) conectados al sistema de circulación de aire. El exceso de humedad se absorbió mediante gel de sílice granulado de color naranja (Sigma, 1.01969), que se cambió todos los días. Nueve madres de cada grupo fueron sacrificadas en E18.5, y se recolectaron, pesaron y prepararon fetos y placentas para análisis posteriores. Se recogió sangre fetal del tronco de fetos E18.5 decapitados. Los riñones fetales se diseccionaron en PBS utilizando un estereoscopio Leica M80. Para los análisis a largo plazo, dos madres fueron retiradas de la hipoxia unas horas antes del nacimiento, y la descendencia masculina se utilizó para la evaluación de la función renal (tasa de filtración glomerular - TFG) a los 8 meses como se describe (11) y para la evaluación de fibrosis renal y niveles séricos de klotho y sirtuina 6 a los 15 meses.
Recuento glomerular
Para la tinción por inmunofluorescencia de montaje completo de riñones E18.5, se aplicó el protocolo de tinción iDisco (12) (https://idisco.info/idisco-protocol/) con pretratamiento con metanol utilizando un anticuerpo antinefrina (R&D AF3159). Se utilizó un tiempo de incubación de n=1 días y un volumen de solución de 1,6 ml para los pasos relevantes. Los riñones se montaron en portaobjetos de cámara de vidrio 8-pocillos (Thermo Fisher, 154534) y se tomaron imágenes inmediatamente utilizando un microscopio digital IMIC (FEI, tipo 4001) con una luz policromada V. fuente, un controlador de cámara Orca-R2 de Hamamatsu (C10600) y software Live Acquisition (FEI, versión 2.6.0.14). Se analizaron imágenes de pila Z de cien micrómetros de riñones E18.5 de montaje completo teñidos con el software de procesamiento de imágenes de código abierto Fiji (ImageJ, versión 2.0.0-rc69/1.52i, https://imagej.net/ Fiyi). En el complemento TrackMate v3.8.0, el detector Downsample LoG se configuró en 80,0 píxeles para el diámetro estimado de la burbuja con un umbral de 16-píxeles y un factor de reducción de resolución 2. Se agregó el número de puntos por fotograma para calcular el número de glomérulos. por riñón. Se eligió una distancia de 100 μm entre cuadros para evitar el doble recuento de glomérulos idénticos en imágenes consecutivas, dado un diámetro glomerular promedio de 80 μm.
Evaluación transcutánea de la filtración glomerular La TFG se determinó en animales conscientes como se describió anteriormente (11). Brevemente, la eliminación plasmática de FITC-sinistrin (Fresenius-Kabi, LI9830076) se mide a través de la piel utilizando diodos emisores de luz con una emisión máxima para FITC a 470 nm y un fotodiodo que detecta la luz fluorescente con una sensibilidad máxima a 525 nm. La disminución de la intensidad de la fluorescencia con el tiempo se convierte luego en TFG.
RT-qPCR El ARN total se aisló utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen 15596026) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración y la calidad del ARN se determinaron con un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific) y se transcribieron 1000 ng en ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara, RR037A). El ADNc se diluyó a 2 ng/ul y la qPCR se realizó con una sonda UPL marcada con FAM (Roche) más los cebadores específicos de genes correspondientes y la mezcla maestra de PCR universal TaqMan Fast (Applied Biosystems, 4352042) en un sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast. (Biosistemas Aplicados). El análisis de los datos se realizó con Microsoft Excel. Se utilizó el método 2 (-ΔCt) para calcular los niveles de expresión relativos para RT-qPCR. Las secuencias de sonda y cebador se enumeran en la Tabla complementaria S1.
Preparación de muestras para análisis LC-MS/MS Se homogeneizaron riñones fetales masculinos aislados (n=3 para cada grupo) en tampón de muestra (urea 7,5 M, tiourea 1,5 M, CHAPS al 4 %, 0.{{ 18}}SDS al 5%, ditiotreitol (DTT) 100 mM) usando una varilla ultrasónica. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un ensayo de Bradford (Bio Rad-Laboratories). Se aplicó un protocolo de digestión en gel como se describió anteriormente (13, 14). En resumen, se cargaron 80 ug de cada muestra en SDS-PAGE, lo que permitió prefraccionar la muestra para reducir la complejidad de la misma. Después de la fijación con 50% de metanol/10% de ácido acético, los geles se lavaron y sensibilizaron con Na2S2O3 al 0,02%. Luego, los geles se tiñeron con AgNO3 al 0,1% durante 10 minutos, se enjuagaron y se revelaron con Na2CO3 al 3%/formaldehído al 0,05%. Luego, cada banda de proteína se cortó en cuatro rodajas y se decoloró. Tras la reducción con DTT y la alquilación con yodoacetamida (IAA), las proteínas se digirieron enzimáticamente usando tripsina/Lys-C (grado MS; Promega Corporation). Después de la digestión, los péptidos se eluyeron, se secaron y se almacenaron a -20 ◦C hasta el análisis LC-MS/MS.
Análisis LC-MS/MS
Como se describió anteriormente (13), las muestras de péptidos se reconstituyeron en 5 ul de ácido fórmico (FA) al 30% que contenía 10 fmol de cada uno de los cuatro péptidos estándar sintéticos y se diluyeron con 40 ul. fase móvil A (97,9% H2O, 2% ACN, 0,1% FA). Péptidos sintéticos [Glu1-Fribrinopéptido B – EGVNDNEEGFFSAR; M28 – TTPAVLDSDGSYFLYSK; HK0 – VLETKSLYVR; HK1 - VLETK(ε-AC)SLYVR] se agregaron a cada muestra como control de calidad interno para monitorear la estabilidad del sistema LC-MS. Luego se inyectaron diez microlitros de esta solución en el sistema nano LC Dionex Ultimate 3000 acoplado a un espectrómetro de masas orbitrap QExactive equipado con una fuente de iones de nanopulverización (Thermo Fisher Scientific). Como paso de preconcentración, los péptidos se cargaron en una precolumna C18 Pepmap100 de 2 cm × 75 μm (Thermo Fisher Scientific) a un caudal de 10 ul/min usando la fase móvil A. Elución de péptidos de la precolumna a un Pepmap100 de 50 cm × 75 μm La columna analítica (Thermo Fisher Scientific) y la separación posterior se lograron a un caudal de 300 nl/min utilizando un gradiente del 8 % al 40 % de fase móvil B (80 % ACN, 19,9 % H2O, 0,1 % FA) durante 235 min. Se logró la detección espectrométrica de masas, realizando escaneos de MS en el rango de m/z 400 a 1400 con una resolución de 70 000 (a m/z =200). Los escaneos MS/MS de los 12 iones más abundantes se lograron mediante fragmentación de HCD con una energía de colisión normalizada del 30 % y se analizaron en la trampa orbital a una resolución de 17.500 (a m/z =200). Todas las muestras fueron analizadas por duplicado. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios PRIDE (15) con el identificador de conjunto de datos PXD018999 y 10.6019/PXD018999.
Identificación de proteínas y sin etiquetas
Cuantificación (LFQ) La identificación de proteínas, la cuantificación sin etiquetas (LFQ), así como los análisis estadísticos, se realizaron utilizando el software MaxQuant 1.5.2.8, incluido el motor de búsqueda Andromeda y el paquete de análisis estadístico Perseus (16, 17), un flujo de trabajo comúnmente utilizado. para el procesamiento y evaluación estadística de datos proteómicos de escopeta. Las proteínas se identificaron utilizando la base de datos UniProt para proteínas mus musculus (versión 170428 con 16.854 entradas, restringida a las entradas revisadas únicamente), una tolerancia de masa peptídica de 25 ppm, una tolerancia de coincidencia MS/MS de 2{{21 }} ppm y como máximo dos escisiones omitidas con tripsina como proteasa. Los criterios de búsqueda incluyeron además la carbamidometilación de cisteínas como modificación fija, la oxidación de metionina y la acetilación de proteínas N-terminal como modificaciones variables, y un mínimo de dos identificaciones de péptidos por proteína, al menos una de ellas única. Además, la coincidencia entre carreras se realizó utilizando una ventana de tiempo de coincidencia de 5 minutos y una ventana de tiempo de alineación de 15-minutos. Tanto para péptidos como para proteínas, se aplicó una tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,01. Para el análisis estadístico, se realizaron comparaciones mutuas entre muestras de riñón normóxico e hipóxico para determinar los grupos de proteínas, que estaban significativamente regulados hacia arriba o hacia abajo tras la hipoxia. Para ello, utilizando el paquete de análisis estadístico Perseus, se calcularon las diferencias de los valores de LFQ. Los cambios en los valores de abundancia de proteínas entre muestras de riñón normóxico e hipóxico se determinaron mediante una prueba t bilateral con p <0,05 y un mínimo de una diferencia de abundancia doble. Todas las proteínas que cumplían estos criterios se consideraron en el presente estudio. Además, para enfatizar los efectos reguladores más sólidos sobre la hipoxia, las proteínas reguladas significativamente con un FDR global<0.05 as determined by a permutation-based method were analyzed.
Anotación funcional y agrupación
La agrupación de anotaciones funcionales se realizó utilizando la base de datos de recursos de ontología genética (18–20) y la plataforma DAVID (21) (//david.ncifcrf.gov). Las redes de proteínas se generaron utilizando la base de datos STRING (22). Los valores de expresión diferencial entre los riñones E18.5 del grupo control normóxico e hipóxico se mapearon con Heatmapper (23) (//www.heatmapper.ca).
Inmunohistoquímica
Se rehidrataron secciones de tejido fijadas con PFA e incluidas en parafina y se bloqueó la peroxidasa endógena incubando los portaobjetos en una solución de H2O2 al 1,5 % (0.0ácido cítrico 2 M, 0.{ {40}}Na2HPO4 6 M) a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad. La recuperación del antígeno se realizó hirviendo en Tris-EDTA (pH 9) o tampón de ácido cítrico durante 20 minutos seguido de un enfriamiento lento a temperatura ambiente. Después de bloquear en BSA al 2% en PBS a temperatura ambiente durante 1 h, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios en solución de bloqueo la noche a la mañana a 4 ◦C (MPO, ab208670; CAV1, ab32577; ambos Abam). Después de tres pasos de lavado en PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo anti-conejo secundario conjugado con HRP (K4003, Dako EnVision+ System de Agilent) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado en PBS, la señal se reveló con DAB (Agilent, K3468). Las secciones se contratiñeron, se deshidrataron y se montaron utilizando medio Eukitt (Sigma, 03989). Para la detección de 8-OHdG (MOG-100P, JaICA) se utilizó el kit de inmunodetección Vector MOM (BMK-2202) según el fabricante. Las imágenes de campo brillante se adquirieron en un microscopio Nikon E600 (objetivo Plan Fluor ELWD 20 × / 0,45) con un controlador de cámara Digital Sight DS-UE y una cámara DS-Ri1 (ambas Nikon) utilizando el software Nikon NIS Elements 4.0.
enzimático
Cuantificación de Lactato Los niveles de lactato en riñones E18.5 se determinaron después de la desproteinación de la muestra con columnas de centrifugación utilizando el kit enzimático MAK064- 1KT (Sigma), según el fabricante.
Estudios humanos
El estudio en seres humanos fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Federal Suizo de Tecnología (EK 2011-N-51) y se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. En resumen, se obtuvo el consentimiento informado de nueve habitantes sanos y no fumadores de las tierras bajas (ocho hombres y una mujer). Estos voluntarios fueron evaluados secuencialmente para múltiples parámetros fisiológicos antes, durante y después de una 4-semana de estancia ininterrumpida a gran altitud, como se informó anteriormente (10).
Cultivo de células
Se aislaron células tubulares proximales primarias (pPTC) de riñones masculinos C57BL/6N de {{0}} a 4- semanas de edad como se describió anteriormente (24). Brevemente, se obtuvieron fragmentos tubulares proximales digiriendo tejido renal cortical con colagenasa y posterior filtración a través de una membrana con un tamaño de poro de 250 μm y 80 μm. Las PTC se cultivaron en DMEM/F12 (Gibco, 21041-025) suplementado con HEPES 15 mM, Napiruvato 0,55 mM, NEAA al 1 % y suplementos de medio de crecimiento de células epiteliales renales (REGM) (Lonza, CC-4127) . Tras la confluencia, los pPTC se dividieron una vez usando una solución Accutase (Sigma, A6964) y se volvieron a sembrar. Para la hipoxia, el cultivo celular se realizó con oxígeno al 1% durante 48 h; Los controles normóxicos se cultivaron con 19% de oxígeno.
ELISA
Los niveles séricos de Klotho o Sirt6 se determinaron utilizando los siguientes kits para muestras de ratón (CSB-E14362m, tecnología Cusabio y OKCD02892, Aviva Systems Biology) y muestras humanas (CSB E17018h y CSB-E13235h; ambas tecnología Cusabio) siguiendo los protocolos proporcionados. Se recogió sangre fetal de ratón del tronco de fetos E18.5 decapitados. Se tomaron muestras de sangre de ratón de animales adultos de la vena safena. Las muestras de suero humano se obtuvieron de un estudio anterior (10).
PCR con bisulfito
El ADN de animales tratados con hipoxia o normoxia E18.5 se extrajo mediante el kit de sangre y tejidos de Qiagen y se convirtió con bisulfito utilizando el kit de bisulfito EpiTect de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron veinte nanogramos de ADN convertido como plantilla en una reacción de PCR con AmpliTaq Gold (Invitrogen). Los siguientes cebadores se diseñaron utilizando MethPrimer 2.0: Klotho, fragmento de 248 pb (−234/+14 de TSS), Kl_BS_F (TAG TTT TAG GAA GGT AAA GGG AGT G) y Kl_BS_R (AAC AAT AAT TAT CCA AAA CAA AC) (25); Mki67, fragmento de 497 pb (~1 kb aguas arriba de TSS), Mki67_BS_F (TTG GAA GAA TAT TGA TTT AGG AA) y Mki67_BS{{20} }R (ACC TAT AAA CTC CCT CTC CAA AAA T). Los productos de PCR se ligaron en un pCR4-TOPO-Vector usando el kit de clonación TOPO TA para secuenciación (Invitrogen) y se transformaron en bacterias DH10. Los clones se enviaron para secuenciación (Microsyth Seqlab GmbH). La inspección, alineación, visualización y estadísticas se realizaron con la herramienta de cuantificación QUMA para el análisis de metilación (26).
Estadísticas
Se realizaron análisis estadísticos y gráficos con GraphPad Prism versión 8 (https://www.graphpad.com). Se evaluó la significancia de dos grupos mediante pruebas t de dos colas no pareadas con o sin corrección de Welch (la corrección de Welch fue para datos distribuidos de manera no normal, la prueba F de varianzas fue estadísticamente significativa, p < 0.05). Se probaron varios grupos utilizando ANOVA RM unidireccional con la corrección de Geisser-Greenhouse y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. valores p<0.05 were assumed significant. Means with standard deviation (SD) are shown.
Datos fuente
Los datos sin procesar para todos los experimentos que no resultan del análisis de espectrometría de masas se pueden encontrar en el archivo de datos de origen S1 de la hoja de cálculo en el conjunto de datos complementarios. Esto incluye los datos subyacentes a las figuras 1A y D – H, 3E y F, 5B, 7D – I, 8 y las figuras S1 y S6 complementarias.
RESULTADOS
Crónico
La hipoxia fetal da como resultado embriones con crecimiento restringido y función renal reducida en crías adultas. Para exponer a las madres apareadas temporalmente a hipoxia constante (10% de oxígeno) durante 7 días (Fig. 1A), se utilizó una cámara hipóxica. De manera similar a nuestro trabajo anterior (27), las presas se adaptaron rápidamente al ambiente hipóxico y, al nacer, el tamaño de la camada y la masa placentaria fueron similares a las gestaciones de control normóxicas (Figura complementaria S1, A – C). Sin embargo, los fetos hipóxicos E18.5 tenían un peso corporal reducido en comparación con los controles normóxicos, cumpliendo con los criterios de RCIU (28) (Fig. 1B y Fig. suplementaria S1D), y un número de nefronas reducido en un 40% (Fig. 1, C y D). Esta reducción no se debió a la degeneración de la nefrona (necrosis o apoptosis) durante el desarrollo intrauterino en condiciones hipóxicas como se informó anteriormente (27). Además, a pesar de un considerable período de crecimiento de recuperación 3 semanas después del nacimiento, que informamos anteriormente (27), la descendencia adulta hipóxica mostró una función renal severamente reducida a los 8 meses (Fig. 1E) y una mayor expresión de marcadores fibróticos a los 15 meses (Fig. . 1, F–H), confirmando así la validez de nuestro enfoque como un modelo RCIU robusto e ilustración de la teoría de Barker sobre la programación fetal de las enfermedades del adulto.
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