La suplementación con arsénico en la dieta induce el estrés oxidativo al suprimir el factor 2 relacionado con el factor nuclear eritroide 2-en el hígado y los riñones de las gallinas ponedoras

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RESUMEN

Este estudio investigó los efectos de la suplementación con arsénico en la dieta sobre el rendimiento de la puesta, la calidad del huevo, la histopatología hepática y renal y el estrés oxidativo en el hígado yriñones de gallinas ponedoras. Además, se exploró la vía de la proteína 1 (Keap1) relacionada con el factor 2 relacionado con el factor 2 (Nrf2)-Kelch-like ECH del factor nuclear eritroide {{0}}para revelar el mecanismo molecular del estrés. Quinientas doce gallinas ponedoras Hyline White de 40-semanas de edad se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos con 8 corrales por grupo y 16 gallinas por corral. Las dosis de arsénico administradas a los 4 grupos fueron 0.95, 20.78, 40.67 y 60.25 mg/kg. Los resultados revelaron que la suplementación con arsénico en la dieta redujo significativamente la producción de huevos por día de gallina (P, 0.05), el peso promedio del huevo (P, 0.05), las unidades Haugh (P, 0.05), la altura de la albúmina (P, 0.05) , y la fuerza de la cáscara de huevo (P, 0,05). La suplementación con arsénico en la dieta también indujo la acumulación de arsénico y daños histopatológicos en el hígado yriñón. De acuerdo, la suplementación con arsénico en la dieta mejoró significativamente la alanina aminotransferasa sérica (P, {{0}}.05), aspartato aminotransferasa (P, 0.05) , nitrógeno ureico en sangre (P, {{10}}.05) y ácido úrico (P, 0.05). Después de la exposición al arsénico, las actividades de superóxido dismutasa (SOD) (P, 0,05), catalasa (P, 0,01), glutatión reductasa (P, 0,05), glutatión peroxidasa (P, 0,05) y el contenido de glutatión (P, 0,05) se redujeron. disminuyó significativamente, mientras que el nivel de malondialdehído aumentó significativamente (P, 0,05) en el hígado y el riñón. Se produjeron correlaciones positivas entre las actividades de las enzimas antioxidantes y la expresión del gen de la enzima antioxidante en el hígado y el riñón, excepto para la expresión del gen de la superóxido dismutasa de manganeso renal y la actividad de la SOD. Además, la expresión hepática y renal del ARNm de Nrf2 se correlacionó positivamente con la expresión del gen antioxidante y negativamente con la expresión del ARNm de Keap1. En resumen, la suplementación con arsénico en la dieta indujo estrés oxidativo al suprimir la vía Nrf2-Keap1 en el hígado y los riñones de las gallinas ponedoras.

Palabras clave:arsénico, gallina ponedora, vía Nrf2-Keap1, estrés oxidativo, riñones

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, se ha descubierto que los peligros ambientales ocurren en concentraciones crecientes. El arsénico es un tóxico altamente metaloide, incluso en una concentración muy baja en los alimentos para aves. Su papel fisiológico en aves está bien definido, ya que es necesario para la síntesis de metabolitos de metionina, incluida la cisteína. Las concentraciones recomendadas de arsénico en el alimento para aves están entre {{0}}.012 y 0.050 mg/kg (Balo s et al., 2019). Sin embargo, una investigación anterior mostró que las concentraciones de arsénico en el alimento para aves de corral probablemente estén más allá de los niveles de tolerancia de los animales cuando el alimento para aves de corral contiene algas marinas, carbonato cúprico, sulfato cúprico pentahidratado, trihidróxido de cloruro de dicobre o carbonato ferroso (Adamse et al., 2017) . Kazie et al. (2013) informaron que existe una alta posibilidad de que el arsénico en los alimentos para aves afecte la salud de los pollos de engorde. Las cantidades excesivas de arsénico en los piensos avícolas y sus efectos toxicológicos en las aves siguen siendo problemas graves. Cuando un exceso de arsénico ingresa a un animal, puede inducir una variedad de efectos adversos para la salud, como inmunotoxicidad, toxicidad respiratoria, toxicidad cardiovascular, hepatotoxicidad, hepatotoxicidad, nefrotoxicidad, neurovirulencia, toxicidad reproductiva y genotoxicidad. Los efectos toxicológicos del arsénico en los órganos viscerales se han documentado principalmente en estudios con mamíferos, lo que sugiere que el arsénico representa un riesgo para las funciones hepática y renal (Waalkes et al., 2004; Mazumder, 2005; Zheng et al., 2014). Sin embargo, los efectos toxicológicos de la exposición al arsénico en la dieta sobre el hígado y el riñón de las gallinas ponedoras aún no están claros. La toxicidad del arsénico en animales está estrechamente relacionada con el estrés oxidativo, que altera el equilibrio pro/antioxidante (Flora, 2011). Cuando el arsénico ingresa a una célula, se une al glutatión intracelular (GSH) o lo oxida, lo que lleva a la generación de radicales libres. Como sabemos, los genes citoprotectores pueden ser regulados por una serie de factores de transcripción intracelulares, incluido el factor nuclear eritroide 2-relacionado con el factor 2 (Nrf2), la proteína activadora 1 y el factor nuclear kappa-B (Kwak et al., 2001). ). El factor de transcripción Nrf2 es una molécula vital que regula los niveles de estrés en las células. En condiciones de reposo, Nrf2 interactúa con la proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (Keap1), que se encuentra principalmente en el citoplasma. Cuando se desencadena el estrés oxidativo, Nrf2 se traslada del citoplasma al núcleo después de separarse de la molécula Keap1 y luego activa las expresiones de genes citoprotectores (Motohashi y Yamamoto, 2004). A partir de entonces, los genes citoprotectores regulan aún más las actividades de las enzimas antioxidantes posteriores, incluida la superóxido dismutasa (SOD), la glutatión reductasa (GR), la glutatión peroxidasa (GSH-Px) y la catalasa (CAT). Un estudio previo ha demostrado que el factor de transcripción Nrf2 participa en el estrés inducido por arsénico en mamíferos (Sinha et al., 2013). Sin embargo, los efectos exactos de la exposición al arsénico sobre los efectos del estrés oxidativo en las gallinas ponedoras siguen siendo esquivos. En el presente estudio, investigamos el efecto de la suplementación con arsénico en la dieta sobre el rendimiento de la puesta, la calidad del huevo, los índices bioquímicos séricos, los cambios histopatológicos hepáticos y renales y el estrés oxidativo en gallinas ponedoras. Además, se exploró la vía Nrf2-Keap1 para identificar el mecanismo molecular en los hígados yriñonesde gallinas ponedoras. Este estudio proporciona algunas ideas sobre la teoría biológica de la toxicidad del exceso de arsénico en la dieta en el hígado yriñónde gallinas ponedoras.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Todos los procedimientos experimentales realizados en animales se implementaron de acuerdo con la Asociación China de Ciencias de Animales de Laboratorio.

Animales, dietas y diseño experimental

Quinientas doce gallinas ponedoras Hyline White de {{0}}semanas de edad con condiciones corporales similares fueron seleccionadas aleatoriamente y separadas en 4 grupos. Cada grupo contenía 8 réplicas de 16 aves. Se añadió arsénico a la dieta basal de maíz y frijol en 4 concentraciones diferentes (0, 20, 40 y 60 mg/kg; en forma de ácido arsanílico) (Tabla complementaria 1). Las concentraciones de arsénico en la alimentación se midieron por espectrometría de absorción atómica de generación de hidruros de acuerdo con la metodología anterior (Dos Passos et al., 2012). Las concentraciones reales de arsénico en los 4 grupos fueron 0,95, 20,78, 40,67 y 60,25 mg/kg. Las aves se mantuvieron en jaulas (60 ! 50 ! 50 cm3) equipadas con 1 comedero y 2 bebederos de niple, y se alojaron 2 gallinas por jaula. Durante todo el período experimental, las gallinas tuvieron libre acceso a alimento y bebida. El experimento completo duró 10 semanas, incluido un período de ajuste de 1-semanas y un período experimental formal de 9-semanas.

Rendimiento de puesta y calidad del huevo

A lo largo de todo el período experimental, se registraron diariamente los índices de rendimiento de la puesta, incluido el consumo de alimento, la producción de huevos por gallina y el peso del huevo (EW). Las determinaciones de consumo de alimento y EW en cada grupo se realizaron utilizando una balanza de peso sensible (XS2002S, Mettler Toledo, Zurich, Suiza). La relación de conversión alimenticia (FCR) se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: FCR 5 consumo de alimento en gramos/masa de huevo en gramos. Se recolectó aleatoriamente un total de 40 huevos de cada grupo para medir los parámetros de calidad del huevo dentro de las 24 h posteriores a la oviposición al final del experimento. Los huevos se pesaron utilizando una báscula sensible (XS2002S, Mettler Toledo). Posteriormente, se determinaron la unidad Haugh, la altura de la albúmina, el color de la yema y la fuerza de la cáscara del huevo mediante un probador de huevos digital (DET6000, Nabel Co. Ltd., Kioto, Japón). El grosor de la cáscara de huevo con la membrana interna se determinó en la región afilada, media y roma del huevo usando un micrómetro de cuadrante.(547-350, Mitutoyo, Kawasaki, Japón), y los valores medios se utilizaron para el análisis estadístico.

Colección de Muestras

Después del experimento de crianza, 32 aves de cada grupo fueron seleccionadas al azar y sacrificadas cortando las venas del cuello. Las muestras de sangre se recogieron en tubos de centrífuga estériles y se transportaron inmediatamente al laboratorio para la medición de los índices bioquímicos séricos. A partir de entonces, las aves fueron disecadas, y el hígado yriñonesfueron retirados de la cavidad abdominal. El hígado yriñónlas muestras se cortaron en 4 partes. Una parte se fijó inmediatamente en paraformaldehído al 4 por ciento para el examen histopatológico. Las otras 3 partes se almacenaron inmediatamente en nitrógeno líquido para una mayor determinación de los parámetros de estrés oxidativo, la deposición de arsénico y la expresión génica.

Ensayo de deposición de arsénico

Después de medir la calidad del huevo, la yema se separó de la albúmina. La acumulación de arsénico en la clara y la yema se midió mediante espectrometría de absorción atómica de generación de hidruros de acuerdo con la metodología anterior (Dos Passos et al., 2012). La acumulación de arsénico en el huevo entero se calculó sumando el contenido de arsénico en la clara y la yema. De manera similar, se utilizó la espectrometría de absorción atómica por generación de hidruros para determinar la acumulación de arsénico en el hígado yriñón de gallinas ponedoras(Dos Passos et al., 2012).

Determinación de índices bioquímicos séricos

Los niveles de proteína total, albúmina, globulina, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) son índices importantes para evaluar la función hepática. Estos parámetros se midieron usando kits de ensayo apropiados (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN), ácido úrico (UA) y creatinina (CT) son índices importantes para evaluar la función renal y se determinaron utilizando kits de detección (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

Cambios histopatológicos

Los tejidos hepáticos y renales fijados en paraformaldehído al 4 por ciento se deshidrataron en etanol al 70, 80, 90, 95 y 100 por ciento y finalmente se incluyeron en parafina. Los tejidos se cortaron en secciones de 6- mm de espesor y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina. A partir de entonces, las observaciones de los cambios histopatológicos en el hígado yriñónLos tejidos fueron realizados por un patólogo bajo un microscopio óptico (Olympus, Melville, NY).

Ensayos de peroxidación lipídica (LPO) y actividad enzimática antioxidante

Las actividades de SOD, CAT, GR y GSH-Px, y los contenidos de malondialdehído (MDA) y GSH en el hígado y el riñón se determinaron mediante kits de análisis apropiados (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Brevemente, el contenido de MDA se midió mediante un método espectrofotométrico basado en la reacción entre el ácido tiobarbitúrico y la MDA (Janero, 1990). La actividad GR y el contenido de GSH se determinaron usando 5,5-ditiobis(2-ácido nitrobenzoico) (Carlberg y Mannervik, 1985; Abegg et al., 2012). La actividad de SOD se determinó de acuerdo con la reacción inhibidora entre la reducción de nitro azul tetrazolio y la xantina oxidasa. La actividad CAT se determinó en base a la formación de un complejo estable de molibdato de amonio y peróxido de hidrógeno (Aebi, 1984). La actividad de GSH-Px se determinó evaluando la reducción de hidroperóxido de t-butilo (Wheeler et al., 1990).

Aislamiento de ARN total y PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se aisló de los tejidos de hígado y riñón con el kit Trizol RNAiso (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se transcribieron inversamente en ADNc utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT (TaKaRa, Dalian, China). Los cebadores directos e inversos para superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD), superóxido dismutasa de cobre-zinc (CuZnSOD), CAT, GR, GSH-Px, Nrf2, Keap1 y el gen de limpieza (b-actina) se muestran en la Tabla complementaria 2. La abundancia de genes se midió mediante un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (ABI 7500, Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones del ciclo fueron 95 C durante 30 s seguido de 35 ciclos de 95 C durante 5 s, 59 C durante 10 s y 72 C durante 30 s. La diferencia de veces en la expresión de ARNm se midió usando el método de cuantificación relativa utilizando eficiencias de PCR en tiempo real y se normalizó al nivel de b-actina, para comparar los cambios relativos de CT entre todos los grupos (Livak y Schmittgen, 2001).

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como la media 6 SE. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional utilizando SPSS versión 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Cuando las diferencias entre los grupos fueron significativas (indicado por P, 0.05), las medias se compararon con la diferencia honestamente significativa de Tukey para comparaciones múltiples post hoc. Las correlaciones de Pearson se analizaron mediante análisis de correlación bivariada (SPSS versión 20.0, SPSS Inc.). Los coeficientes de significación y correlación se representan como "p" y "r", respectivamente.

RESULTADOS

Desempeño de postura y calidad del huevo En comparación con los del grupo de {{0}}.95 mg/kg de arsénico, la producción de huevos por día de gallina y el EW se redujeron significativamente en el grupo de 60.25 mg/ kg grupo arsénico (P, 0.05). Sin embargo, el arsénico en la dieta no afectó el consumo de alimento o FCR (Tabla 1). En comparación con el grupo de arsénico {{20}}.95 mg/kg, la unidad Haugh disminuyó significativamente en el grupo de 40.67 mg/kg (P, 0.05) y 60.25 mg /kg (P, 0,05) grupos arsénico. Además, tanto la altura de la albúmina como la resistencia de la cáscara del huevo se redujeron significativamente en el grupo de arsénico de 20,78 mg/kg en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg (P, 0,05), se estabilizaron en el grupo de arsénico de 40,67 mg/kg y disminuyeron considerablemente en el grupo de arsénico de 60,25 mg/kg. mg/kg grupo arsénico (P, 0,05). El arsénico en la dieta no afectó el color de la yema ni el grosor de la cáscara del huevo (Tabla 1)

Deposición de arsénico

La deposición de arsénico en la albúmina (P, {{0}}.05), la yema (P, 0.05) y el huevo entero (P, 0.05) aumentó significativamente a medida que la dosis de arsénico en la dieta aumentó de 0,95 a 60,25 mg/kg (Tabla 2). De manera similar, a medida que la dosis de arsénico en la dieta aumentó de 0,95 a 60,25 mg/kg, la deposición de arsénico en el hígado (P, 0,05) y el riñón (P, 0,05) aumentó significativamente (Tabla 2)

Análisis de correlación entre la calidad del huevo y la deposición de arsénico en el huevo

La deposición de arsénico en la albúmina se correlacionó negativamente con la unidad Haugh (r {{0}}.622, P, 0.{{10}}1), albúmina altura (r 5 20.878, P, 0.01) y dureza de la cáscara (r 5 20.897, P, 0.{{ 30}}1). Mientras tanto, la deposición de arsénico en la yema también se relacionó negativamente con la unidad Haugh (r 5 20.654, P, 0.01), la altura de la albúmina (r 5 20.893, P, 0.01) y fuerza de la cáscara de huevo (r 5 20.902, P, 0.01). De igual forma, se encontraron relaciones negativas entre la deposición de arsénico en el huevo entero y la unidad Haugh (r 5 20.640, P, 0.01), altura de la albúmina (r 5 20.888, P, 0.01) , y resistencia de la cáscara de huevo (r 5 20.902, P, 0.01) (Tabla 3)

Índices bioquímicos séricos

En comparación con los del grupo de {{0}}.95 mg/kg de arsénico, los niveles de ALT aumentaron significativamente en el grupo de 20.78 mg/ kg (P , 0).{ {16}}5), 40.67 mg/kg (P , 0.05) y 60.25 mg/kg (P , 0.05) grupos de arsénico. Mientras tanto, los niveles de AST en el grupo de 60,25 mg/kg de arsénico aumentaron significativamente en comparación con los del grupo de 0,95 mg/kg de arsénico (P, 0,05). El arsénico en la dieta no afectó los niveles de proteína total o albúmina en suero (Tabla 4).

En comparación con los del grupo de {{0}}.95 mg/kg de arsénico, tanto los niveles de BUN como de AU aumentaron significativamente en el grupo de 60.25 mg/kg de arsénico (P, 0.05), mientras que la exposición al arsénico en la dieta no aumentó. afectan el nivel de CT en el suero (Tabla 4).

Cambios histopatológicos

La apariencia del tejido hepático fue normal e inalterada en el grupo de {{0}}.95 mg/kg de arsénico. Sin embargo, a medida que la dosis de arsénico en la dieta aumentó de 20,78 a 60,25 mg/kg, la proliferación de la vía biliar, la esteatosis de los hepatocitos y la deformación de la vena central se volvieron más graves (Figuras 1A-1D). La apariencia del tejido renal fue normal e inalterada en el grupo de 0,95 mg/kg de arsénico. Sin embargo, hubo una contracción glomerular grave en el grupo de arsénico de 20,78 mg/kg en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg. A medida que la dosis de arsénico en la dieta aumentó de 40,67 a 60,25 mg/kg, el agrandamiento de los túbulos renales, la fifibrosis tubular y la hialinización se volvieron más graves (Figuras 1E-1H).

Biomarcadores de Estrés Oxidativo

En comparación con los del grupo de {{0}}.95 mg/kg de arsénico, los niveles hepáticos de MDA aumentaron significativamente en el grupo de 60.25 mg/kg de arsénico (P , {{12} }.05), y los niveles renales de MDA aumentaron significativamente en los grupos de arsénico de 20,78 mg/kg (P, 0,05), 40,67 mg/kg (P, 0,05) y 60,25 mg/kg (P, 0,05). grupos (Figura 2A). niveles de GSH en el hígado yriñóndisminuyó significativamente en el grupo de 20.78 mg/kg de arsénico en comparación con los del grupo de 0.95 mg/kg de arsénico (P, 0.05) , y se estabilizó en los grupos de arsénico de 40.67 y 60.25 mg/kg (Figura 2B). La actividad de SOD hepática disminuyó significativamente en los grupos de arsénico de 40,67 mg/kg (P, 0,05) y 60,25 mg/kg (P, 0,05) en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg. La actividad renal de SOD disminuyó significativamente en el grupo de arsénico de 20,78 mg/kg en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg (P, 0,05) y se estabilizó en los grupos de arsénico de 40,67 y 60,25 mg/kg (Figura 2C). Actividad CAT en el hígado yriñóndisminuyó significativamente a medida que la dosis de arsénico en la dieta aumentó de {{0}}.95 a 60.25 mg/kg (P, 0.05, Figura 2D). En comparación con el grupo de 0.95 mg/kg de arsénico, la actividad de GR en el hígado y el riñón disminuyó significativamente en el grupo de 60.25 mg/kg de arsénico (P, 0.05, Figura 2E ). Además, en comparación con el grupo de 0,95 mg/kg de arsénico, la actividad hepática de GSH-Px disminuyó significativamente en el grupo de 60,25 mg/kg de arsénico (P, 0,05) y la actividad renal de GSH Px disminuyó considerablemente en el grupo de 20,78 mg/kg de arsénico. (P, 0,05) y se estabilizó en los grupos de arsénico de 40,67 y 60,25 mg/kg (Figura 2F).

Expresiones génicas de enzimas antioxidantes, moléculas Nrf2 y Keap1

La expresión del gen hepático CuZnSOD disminuyó significativamente en el grupo de 20,78 mg/kg de arsénico en comparación con el grupo de 0,95 mg/kg de arsénico (P, 0.{{16} }5) y se estabilizó en los grupos de arsénico de 40.67 y 60.25 mg/kg. La expresión del gen CuZnSOD renal disminuyó significativamente en los grupos de 40,67 mg/kg (P, 0,05) y 60,25 mg/kg (P , 0.05) grupos de arsénico en comparación con el grupo de 0.95 mg/kg de arsénico (Figura 3A). En comparación con el grupo de 0.95 mg/kg de arsénico, la expresión del gen MnSOD hepático disminuyó significativamente en el grupo de 20.78 mg/kg de arsénico (P, 0).{{73 }}5) y se estabilizó en los grupos de arsénico de 4{{80}}.67 y 60.25 mg/kg. La expresión del gen MnSOD renal no fue significativamente diferente entre los grupos (Figura 3B). La expresión del gen CAT hepático disminuyó significativamente en el grupo de 20,78 mg/kg de arsénico en comparación con el grupo de {{105}},95 mg/kg de arsénico (P, 0,05) y se estabilizó. en los grupos de arsénico de 40,67 y 60,25 mg/kg. La expresión del gen CAT renal disminuyó significativamente en el grupo de 20,78 mg/kg de arsénico en comparación con el grupo de 0,95 mg/kg de arsénico (P, 0,05) y se estabilizó en el grupo de 40,67 mg/kg de arsénico, y se redujo drásticamente en el grupo de 60,25 mg/kg. grupo de arsénico en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg (P, 0,05, Figura 3C). La expresión del gen GR en el hígado y el riñón disminuyó significativamente en el grupo de arsénico de 20,78 mg/kg en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg (P, 0,05) y se estabilizó en los grupos de arsénico de 40,67 y 60,25 mg/kg (Figura 3D). Además, la expresión del gen GSH-Px hepático disminuyó significativamente a medida que la dosis de arsénico en la dieta aumentó de 0,95 a 40,67 mg/kg (P, 0,05) y luego se estabilizó en el grupo de 60,25 mg/kg de arsénico. La expresión del gen GSH-Px renal disminuyó significativamente en el grupo de arsénico de 20,78 mg/kg en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg (P, 0,05) y se estabilizó en los grupos de arsénico de 40,67 y 60,25 mg/kg (Figura 3E). La expresión del gen Nrf2 en el hígado y el riñón disminuyó significativamente en el grupo de 20,78 mg/kg de arsénico en comparación con el grupo de 0,95 mg/kg de arsénico (P, 0,05) y se estabilizó en los grupos de 40,67 y 60,25 mg/kg de arsénico (Figuras 4A y 4C). ). Por el contrario, la expresión del gen Keap1 en el hígado y el riñón aumentó considerablemente en el grupo de arsénico de 20,78 mg/kg en comparación con el grupo de arsénico de 0,95 mg/kg (P, 0,05) y se estabilizó en los grupos de arsénico de 40,67 y 60,25 mg/kg (Figuras 4B y 4D).

Análisis de correlación relacionados con la ruta Nrf2- Keap1

La expresión génica de CuZnSOD (hígado, r {{0}}.613, P , 0.01;riñón, r {{0}}.687, P , 0.{{10}}1), CAT (hígado, r 5 0.738, P , 0.01; riñón, r 5 0.903, P , 0.01), GR (hígado, r 5 0.477, P , 0.05; riñón, r 5 0.485, P , 0.05) y GSH-Px (hígado, r 5 0.450, P , 0.05; riñón , r 5 0.767, P , 0.01) en el hígado y el riñón, y la expresión del gen hepático MnSOD (r 5 0.707, P , 0.01) se correlacionaron positivamente con las actividades de sus correspondientes enzimas antioxidantes. Además, la expresión del gen Nrf2 se correlacionó positivamente con las expresiones génicas de CuZnSOD (hígado, r 5 0.756, P, 0.01;riñón, r {{0}}.736, P , 0.01), CAT (hígado, r 5 0.893, P , 0.01;riñón, r {{0}}.740, P , {{10}}.01), GR (hígado, r 5 0 .837, P , 0.01; riñón, r 5 0.915, P , 0.01) y GSH-Px (hígado, r 5 0.822, P , 0.01; riñón, r {{17} }.722, P , 0.01) en el hígado yriñón, y la expresión del gen hepático MnSOD (r {{0}}.720, P , 0.01). Hubo una correlación negativa entre la expresión de ARNm de Nrf2 y Keap1 (hígado, r 5 20.746, P, 0.01;riñón, r {{0}}.771, P , 0.01) en hígado y riñón. Además, no hubo correlación entre la expresión del gen MnSOD y la actividad enzimática de SOD, o la expresión del ARNm de Nrf2 en elriñones de gallinas ponedoras(Cuadro 5).

DISCUSIÓN

El arsénico es un metaloide ubicuo y tóxico en la naturaleza. Induce varias toxicosis en humanos y animales, incluyendo hepatotoxicidad, nefrotoxicidad, neurovirulencia, inmunotoxicidad, toxicidad cardiovascular, hepatotoxicidad y toxicidad reproductiva (Mandal y Suzuki, 2002). El arsénico apunta de manera más robusta al sistema reproductivo de los animales. Estudios anteriores han demostrado que la exposición a la roxarsona en la dieta altera la tasa de puesta y la producción de huevos (Chiou et al., 1999; Zhang et al., 2017). En este estudio, la suplementación con arsénico en la dieta disminuyó significativamente el rendimiento de la puesta, incluida la producción de huevos y la EW. Estudios anteriores han encontrado que la suplementación con arsénico en la dieta induce la acumulación de arsénico en los huevos y reduce la calidad del huevo (Chiou et al., 1998; Zhang et al., 2017). En el presente estudio, la suplementación con arsénico en la dieta disminuyó significativamente la unidad Haugh, la altura de la albúmina y la fuerza de la cáscara del huevo. Excepto por el color de la yema y el grosor de la cáscara del huevo, se encontraron correlaciones negativas entre la deposición de arsénico en los huevos y los parámetros de calidad del huevo. Esto sugiere que la unidad Haugh, la altura de la albúmina y la resistencia de la cáscara del huevo podrían verse afectadas por la deposición de arsénico en el huevo. Como sabemos, el espesor de la capa empalizada en la cáscara del huevo es el determinante del espesor de la cáscara (Ruiz y Lunam, 2000), mientras que la deposición de pigmento determina el color de la yema. Por lo tanto, especulamos que la suplementación con arsénico en la dieta podría no afectar el espesor de la capa empalizada de depósito de pigmento en los huevos de las gallinas ponedoras. La evidencia emergente indica que los trastornos hepáticos y renales son comunes en los mamíferos después de la exposición al arsénico (Liu y Waalkes, 2008; Huang et al., 2009). Un estudio previo mostró que la exposición al arsénico induce lesiones histopatológicas en el hígado, incluyendo desorientación tisular, peliosis y vacuolización acompañadas de cariólisis, apoptosis y necrosis de hepatocitos en Channa punctatus (Roy y Bhattacharya, 2006). En este estudio, observamos cambios severos en la proliferación de la vía biliar, esteatosis de hepatocitos y deformación de la vena central en el hígado a medida que la dosis de arsénico en la dieta aumentó de 20,78 a 60,25 mg/kg. Roy y Bhattacharya (2006) también encontraron que la exposición al arsénico induce la contracción del glomérulo, irregularidades en el túbulo renal y un aumento en el espacio de Bowman. En la presente investigación, como la dosis de arsénico dietético

aumentó de 20,78 a 60,25 mg/kg, los cambios histopatológicos renales fueron muy graves, incluido el agrandamiento de los túbulos renales, el encogimiento glomerular y la fifibrosis tubular y la hialinización, lo cual es consistente con un estudio anterior (Roy y Bhattacharya, 2006). Según informes anteriores, se ha demostrado que los niveles séricos de AST y ALT son marcadores indirectos de la reacción inflamatoria hepática y la fifibrosis (Wang et al., 2008; Khattab et al., 2015). En este estudio, los aumentos en los niveles séricos de AST y ALT implicaron que la respuesta inflamatoria hepática se intensificó después de la exposición al arsénico, lo cual fue consistente con los cambios histopatológicos observados en los hígados de las gallinas ponedoras. Patel y Kalia (2013) también encontraron que la hepatotoxicidad inducida por arsénico se manifiesta por un aumento en los niveles séricos de ALT y AST en ratas Wistar. La función renal se controla de forma rutinaria mediante los niveles de BUN, CT y UA en el suero. Encontramos que los niveles séricos de BUN y AU aumentaron significativamente, y el nivel sérico de CT tendió a aumentar después de la suplementación con arsénico en la dieta, lo que implica queriñóndaños y perjuiciosresultó de la exposición al arsénico en gallinas ponedoras, lo cual es consistente con investigaciones previas (Liu et al., 2000). Está bien establecido que el daño tisular inducido por la exposición al arsénico está estrechamente relacionado con el estrés oxidativo (Jomova et al., 2011). Cuando se desencadena el estrés oxidativo, las especies de oxígeno reactivo intracelular (ROS) inducen LPO, que puede controlarse mediante los niveles de MDA intracelular (Storey, 1996). En este estudio, los niveles hepáticos y renales de MDA aumentaron significativamente después de la suplementación con arsénico en la dieta, lo que implica que hubo un aumento en la LPO, lo que puede haber indicado daño oxidativo en el hígado yriñones de gallinas ponedoras.GSH también juega un papel vital en la regulación del estrés oxidativo intracelular (Finkel and Holbrook, 2000). En comparación con los del grupo de 0,95 mg/kg de arsénico, los niveles de GSH

disminuyeron significativamente en los grupos tratados con concentraciones más altas de arsénico, lo que sugiere que el arsénico podría unirse con GSH para atenuar las capacidades antioxidantes del hígado yriñón.Flora et al. (1997) informaron que la exposición al arsénico reduce la concentración de GSH y produce lesiones pronunciadas en el hígado yriñonesde ratas Además, los sistemas enzimáticos antioxidantes intracelulares confieren funciones protectoras para proteger contra el estrés oxidativo, incluidos SOD, CAT, GR y GSH-Px (Finkel y Holbrook, 2000). En este estudio, la suplementación con arsénico en la dieta redujo significativamente las actividades de SOD, CAT, GR y GSH-Px en el hígado y los riñones de las gallinas ponedoras. Cuando los sistemas antioxidantes no pueden neutralizar el exceso de ROS intracelular, se produce un daño oxidativo debido a la LPO, que podría, a su vez, atenuar las actividades de las enzimas antioxidantes. Un estudio anterior informó de manera similar que el arsénico induce estrés oxidativo en el riñón de rata (Sener et al., 2016). Las enzimas antioxidantes son proteínas y pueden estar reguladas por genes a nivel transcripcional. En el presente estudio, la exposición al arsénico disminuyó significativamente la expresión del ARNm de CuZnSOD, CAT, GR y GSHPx. Además, la expresión génica de CuZnSOD, CAT, GR y GSH-Px se correlacionó positivamente con las actividades de las enzimas antioxidantes, lo que implica que la exposición al arsénico redujo las actividades de las enzimas antioxidantes al inhibir la expresión del ARNm. De manera similar, se informaron correlaciones entre las actividades de las enzimas antioxidantes y la expresión génica en el hígado y los riñones de las gallinas ponedoras después de la exposición al mercurio. Sin embargo, la suplementación con arsénico en la dieta no afectó la expresión de MnSOD en losriñón.Esto puede deberse a que la SOD tiene varias isoenzimas y su actividad no se ve afectada por el gen MnSOD. Nrf2 juega un papel vital en el sistema de defensa contra el estrés oxidativo. En condiciones basales, Nrf2 se une a Keap1 en el citoplasma. Una vez que el nivel de ROS intracelular es lo suficientemente alto como para modificar los grupos tiol reactivos de Keap1, Nrf2 se transloca mucho más fácilmente al núcleo, donde irrita el tejido que responde a los antioxidantes.

y luego activa los genes protectores aguas abajo (Sinha et al., 2013). En este estudio, encontramos que la exposición al arsénico redujo significativamente la expresión del gen Nrf2 y la expresión de enzimas antioxidantes aguas abajo. La regulación a la baja de Nrf2 y de los genes de las enzimas antioxidantes aguas abajo después de la exposición al arsénico sugirió que el arsénico inhibía la expresión de los genes de las enzimas antioxidantes al suprimir la expresión del gen Nrf2 en el hígado yriñón. Además, la mejora de la expresión del gen Keap1 se correlacionó negativamente con la expresión del gen de la enzima antioxidante y Nrf2, lo que implica que la regulación positiva de Keap1 citoplasmático promueve la translocación de Nrf2 del citoplasma al núcleo (Kensler et al., 2007). Un estudio similar informó que la vía intracelular Nrf2-Keap1 se inactiva en respuesta a la exposición al arsénico (Janasik et al., 2018). Sin embargo, un estudio anterior también informó que la exposición al arsénico mejora la vía Nrf2-Keap1 para proteger contra el daño oxidativo (Massrieh et al., 2006). Estos hallazgos no son incompatibles con este estudio. En las primeras etapas del estrés oxidativo, los efectos protectores de Nrf2-Keap1 podrían activarse para prevenir el estrés oxidativo. No obstante, la vía Nrf2-Keap1 podría no resistir los daños oxidativos inducidos por la exposición sostenida a una dosis alta de arsénico (Kensler et al., 2007). A partir de entonces, la vía Nrf2- Keap1 podría inhibirse y podría producirse daño oxidativo intracelular o incluso apoptosis en el hígado y los riñones de las gallinas ponedoras. En vista de los presentes resultados, este estudio proporciona nueva evidencia de la defensa antioxidante hepática y renal bajo la exposición al arsénico en gallinas ponedoras y aclara por primera vez un papel central de la vía Nrf2-Keap1 en el estrés oxidativo inducido por el arsénico. . En resumen, la suplementación con arsénico en la dieta redujo el rendimiento de la puesta y la calidad del huevo de las gallinas ponedoras. Se produjeron daños histopatológicos en el hígado yriñóndespués de la exposición al arsénico en la dieta. Además, la exposición al arsénico en la dieta indujo estrés oxidativo hepático y renal al afectar la vía Nrf2-Keap1 en gallinas ponedoras.