Los flavanoles de cacao en la dieta mejoran la función mitocondrial en el músculo esquelético y modifican el metabolismo de todo el cuerpo en ratones sanos

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Resumen: La disfunción mitocondrial está ampliamente reportada en diversas enfermedades y contribuye a su patogenia. Evaluamos el efecto deflavanoles de cacaosuplementación sobre la función mitocondrial y el metabolismo completo, y exploramos si la sirtuina desacetilasa mitocondrial-3 (Sirt3) está involucrada o no. Exploramos los efectos de 15 días de suplementación con CF en ratones de tipo salvaje y Sirt3-/. El metabolismo de todo el cuerpo se evaluó mediante calorimetría indirecta y se realizó una prueba de tolerancia oral a la glucosa para evaluarmetabolismo de la glucosa. Se evaluó la función respiratoria mitocondrial en fibras permeabilizadas y se cuantificó el contenido de nucleótidos de piridina (NAD plus y NADH). En el tipo salvaje, la suplementación con CF modificó significativamente el metabolismo de todo el cuerpo al promover el uso de carbohidratos y mejorar la tolerancia a la glucosa. La suplementación con CF indujo un aumento significativo de la masa mitocondrial, mientras que se produjo una adaptación cualitativa significativa para mantener la producción de H2O2 y el estrés oxidativo celular. La suplementación con CF indujo un aumento significativo en el contenido de NAD plus y NADH. Todos los efectos mencionados anteriormente se atenuaron en los ratones Sirt3-7. En conjunto, la suplementación con CF impulsó el metabolismo de NAD que estimula el metabolismo de las sirtuinas y mejoró la función mitocondrial, lo que probablemente contribuyó a la adaptación observada del metabolismo de todo el cuerpo, con una mayor capacidad para usar carbohidratos, al menos parcialmente a través de Sirt3.

Palabras clave: flavanoles de cacao; metabolismo de NAD; masa mitocondrial; metabolismo de la glucosa; músculo esquelético

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1. Introducción

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares que participan en múltiples funciones celulares, como la transducción de energía a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial y en la producción de peróxido de hidrógeno mitocondrial o la activación de la muerte celular mediada por mitocondrias [1-3]. La evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial está involucrada en muchas patologías y juega un papel central en su patogénesis [4]. Nuestro grupo informó deterioro mitocondrial en pacientes con diabetes tipo 1 mucho antes de las complicaciones clínicas [5]. Además, con el envejecimiento se produce una disminución de la capacidad oxidativa mitocondrial incluso en personas sanas [6]. Por lo tanto, la identificación de estrategias para mitigar estas disfunciones o aumentar la masa mitocondrial son oportunidades para prevenir, o al menos reducir, la incidencia de muchos trastornos o aumentar la capacidad aeróbica de sujetos sanos.

En este contexto, es de interés la identificación de compuestos seguros y naturales que mejoren la función mitocondrial y el metabolismo de todo el cuerpo con o sin efectos secundarios limitados. Entre los compuestos naturales,flavanoles de cacao(CF) se consideran moléculas prometedoras, ya que se demostró que su consumo afecta positivamente la salud cardiovascular, la resistencia a la insulina o la función inmunológica [7]. De hecho, se demostró que CF mejora el metabolismo de la glucosa, y una administración a corto plazo de CF va seguida de un aumento de la sensibilidad a la insulina, incluso en pacientes hipertensos con intolerancia a la glucosa [8,9].

Entre los flavanoles, la (-)-epicatequina (EPI) es el monómero que se encuentra con mayor frecuencia en la FQ, y la EPI se considera la principal molécula biodisponible y bioactiva de la FQ [10]. Un cuerpo consistente de evidencia indica que la suplementación con EPI mejora la función y/o el contenido mitocondrial en el músculo esquelético [11]. La suplementación con EPI estimula múltiples vías que convergen en el coactivador gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisomas 1-alfa (PGCl) y los principales complejos transcripcionales nucleares. EPI mejora directamente la generación de óxido nítrico, lo que estimula la biogénesis mitocondrial [11]. Al mismo tiempo, las sirtuinas 1 y 3 también son estimuladas por la suplementación con EPI [11]. El uso de proantocianidinas, oligoméricasflavonoidesque contienen EPI, se demostró que aumenta los niveles intracelulares de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD plus) a través del aumento de varios precursores para la biosíntesis de NAD y regula al alza los niveles de ARNm de sirtuina-1 en hígado de rata [12]. La familia de las sirtuinas (Sirt), una desacetilasa dependiente de NAD, comprende siete miembros que se diferencian por su distribución subcelular, especificidad de sustrato y funciones celulares [13]. Sirt1, un miembro ampliamente estudiado de esta familia, estimula la biogénesis mitocondrial al promover la desacetilación de PGCl, mejorando así su actividad transcripcional [14]. Sirte, un sensor metabólico clave, fue estimulado luego de la administración de EPI [12,15-17]. Sin embargo, no se ha explorado la influencia de EPI en otras sirtuinas. La evaluación del efecto EPI será particularmente interesante en las sirtuinas ubicadas dentro de las mitocondrias (Sirt3, Sirt 4 y Sirt5), que se sabe que modulan la actividad del ciclo de Krebs y las enzimas de la cadena respiratoria [18]. Sirt3, que se expresa en gran medida en tejidos con alto recambio metabólico y contenido mitocondrial, es de particular interés por su papel crítico en el mantenimiento de la función mitocondrial normal a través de la desacetilación reversible de la proteína lisina [19-21]. Además, Sirt3 juega un papel importante en la regulación del metabolismo de todo el cuerpo [20. Se demostró que Sirt3 está alterado en el músculo esquelético de modelos de diabetes tipo 1 y tipo 2 y enfermedades cardiovasculares [22,23]. Además, se sugirió que la activación de Sirt3 podría representar una estrategia terapéutica prometedora para mejorar la función y el metabolismo mitocondrial [23,24]. Por lo tanto, es de interés determinar si Sirt3 subyace en parte de los efectos beneficiosos de la suplementación con CF sobre el metabolismo de todo el cuerpo y la función mitocondrial.

En este estudio, utilizamos un enfoque integrador para investigar, en ratones, el efecto de una suplementación con FQ de 15-días. Presumimos que la suplementación con CF: (i) modificaría el metabolismo de todo el cuerpo ymetabolismo de la glucosa, (ii) aumentar la función mitocondrial en el músculo oxidativo y glicolítico en las fibras permeabilizadas, y (ii) impulsar el metabolismo de NAD. También exploramos la supuesta participación de Sirt3 en la biogénesis mitocondrial inducida por FQ y el metabolismo de todo el cuerpo. Nuestras hipótesis eran que los efectos de la FQ sobre el metabolismo de todo el cuerpo y la masa mitocondrial se atenuarían en los ratones Sirt3-7.

2. Métodos

2.1. Animales y Dieta

Para este estudio, se compraron ratones macho 129S1/SvlmJ de 10-semanas de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Para determinar si las sirtuinas están involucradas en la adaptación de la función y la masa mitocondrial inducida por la administración de FQ, también utilizamos ratones macho sirt3 knock-out de cuerpo entero de 10- semanas de edad en la misma cepa que el tipo salvaje [25]. Sirt3/ratones se utilizaron para explorar la participación de Sirt3 en la biogénesis mitocondrial inducida por FQ y las adaptaciones del metabolismo de todo el cuerpo. Los ratones se mantuvieron en una habitación a una temperatura regulada de 23-25 grados e iluminación controlada (ciclos de luz y oscuridad de 12- h). Los animales tenían acceso a alimento para roedores y agua del grifo ad libitum.

Después de al menos una semana de habituación en las instalaciones para animales, los animales de experimentación recibieron suplementos de CF a través de una sonda oral de un extracto natural (302,1 mg/kg de peso corporal dos veces al día durante 15 días) resuspendido en carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich, St. Louis). , Mo, EE. UU.). La composición del cacao en polvo se describe en la Tabla 1 y se ha obtenido de Naturex (Quart de Poblet, España). La composición ha sido establecida por el método de cromatografía líquida de alta resolución y 100 mg del extracto equivalen a una media de 475 mg de semillas secas de cacao. Los ratones de control recibieron un vehículo compuesto por un contenido similar de teobromina y cafeína disueltos en carboximetilcelulosa por sonda oral. La dosis diaria se determinó de acuerdo con la guía de la industria que convierte la dosis humana en dosis equivalentes en animales en función del área de superficie corporal, y multiplicamos la dosis humana por 12,3 [26]. La sonda oral fue realizada por un técnico experimentado.

2.2. Recolección de tejidos1

Veinticuatro horas después de la última alimentación forzada oral, los animales no ayunados fueron anestesiados usando ketamina y xilazina (respectivamente: 100 y 10 mg/kg). La recolección de tejidos se realizó inmediatamente después de lograr la anestesia. Se extirparon el sóleo y la porción blanca del gastrocnemio. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 grados para análisis posteriores o se usaron para preparar fibras musculares desolladas.

2.3. Evaluaciones Metabólicas y de Actividad Física

La calorimetría indirecta y la actividad física espontánea se midieron utilizando el Sistema Integral de Monitoreo de Animales de Laboratorio (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, EE. UU.). Los ratones se alojaron individualmente en las cámaras a 28 grados, con luz de 07h00 a 19h00 y acceso ad libitum a comida para roedores y agua del grifo. Los ratones se aclimataron a las jaulas metabólicas durante tres días antes del primer día de recogida de datos. La recolección de datos se realizó el decimoquinto día de la suplementación. El consumo de oxígeno (VO2), la producción de dióxido de carbono (VCO2) y la relación de intercambio respiratorio (RER) se midieron con un flujo de aire de 0,5 L/min y una muestra de aire de 0,4 L/ mín. El porcentaje de frecuencia relativa acumulada (PCRF) de RER se determinó durante un período de 24- horas, tal como lo describieron previamente Riachi et al. (2004). Brevemente, PCRF se determinó mediante la adición de la frecuencia de cada punto de datos a la secuencia de incremento anterior (de 0,65 a 1,20 con un incremento de 0,01) [27]. La flexibilidad metabólica se determinó mediante la pendiente de Hill (valor H) y el percentil 50 (EC50) de la curva PRCF y midiendo la amplitud RER durante 24 h (Riachi et al.2004). La actividad física general fue monitoreada utilizando un sistema de sensor operado por rayos infrarrojos que detectó actividad en los ejes x y z. Se evaluaron tanto los recuentos totales (cada vez que se rompe un haz) como los recuentos ambulatorios (cada vez que se rompe un nuevo haz). Se registra un recuento X-total (X-TOT) cuando el animal se mueve horizontalmente más de 0,5 pulgadas y es representativo de actividades repetitivas a pequeña escala, como rascarse y acicalarse. El conteo X-ambulatorio (X-AMB) mide la locomoción real registrando un conteo solo cuando el animal rompe un nuevo haz. Se registra un conteo Z-total (Z-TOT) cuando ocurre un movimiento vertical de 1,5 pulgadas, es decir, la crianza (Abreu-Vieira 2016). Para estimar carbohidratos y grasas.oxidaciónde VO2 y VCO2, utilizamos la tabla de cociente respiratorio no proteico de Péronnet y Massicotte utilizada previamente en ratones [28,29].

2.4. Masa corporal total y grasa

La masa grasa total y la masa magra total se determinaron en ratones no anestesiados mediante análisis de interferencia de resonancia cuantitativa utilizando el analizador de resonancia magnética de cuerpo entero EchoMRI (Echo Medical System, Houston, TX, EE. UU.). La masa grasa total representaba la suma de toda la grasa del cuerpo. La masa magra total incluía principalmente músculos y órganos internos. Se sabe que la masa muscular esquelética representa la mayor parte de la masa magra total.

2.5.Prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT)

La glucemia se midió mediante una gota de sangre extraída de la cola con un glucómetro (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). La OGTT se realizó en ratones que estuvieron en ayunas durante 5 a 6 h. La medición se realizó el último día de la suplementación con CF. Después de la medición de la glucemia basal (tiempo O), a los ratones se les inyectó por vía oral una solución de glucosa al 20 por ciento en agua estéril a una dosis de 1,5 g de glucosa·kg de peso corporal-1. La glucemia se midió a los 15, 30, 60, 90 y 120 min después de la inyección de la solución de glucosa. Luego se calculó el área incremental de la curva de glucosa como una medida de la tolerancia a la glucosa.

2.6.Análisis qRT-PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. El ADNc se sintetizó a partir del ARN total (2 μL) utilizando la supermezcla de transcripción inversa iScript para RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, EE. UU.). Los productos de RT total se analizaron mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCR) utilizando 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Canadá). El ciclado se logró en un ciclador CFX96 (Biorad, Hercules, California; condiciones: 95 grados C por 10 min y 40 ciclos de 95 grados por 30 s, 55 grados por 45 s y 72 grados por 45 s). Al final de cada ciclo, se confirmó la ausencia de formación de dímeros de cebadores y la presencia de un único amplicón utilizando la curva de fusión. Los valores del ciclo umbral (Ct) se usaron siguiendo el método 2-A△Ct para analizar los datos de qPCR, con ß-actina o HPRT1 como gen de mantenimiento【30】. Los valores cuantitativos de RT-PCR se relacionaron con los del grupo de control, que se establecieron en 1.

2.7. Actividades enzimáticas

La medición de la actividad específica de los complejos de la cadena de transporte de electrones y la citrato sintasa se realizó espectrofotométricamente como se describió anteriormente [31]. Los músculos gastrocnemios blancos congelados pulverizados (~30 mg) se homogeneizaron con un homogeneizador de microesferas vibrantes en 500 uL de tampón de homogeneización (120 mM KCl, 20 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA y 5 mg·mL-I de BSA , pH 7,4) seguido de la adición de 500 μL de medio hipotónico (fosfato de potasio 25 mM y MgCl 5 mM, pH 7,2). A continuación, las muestras se sometieron a tres rondas de ciclos de congelación y descongelación en nitrógeno líquido. Las muestras se centrifugaron durante 10 min a 600 xga 4 grados y el sobrenadante se mantuvo en hielo hasta el análisis. El contenido de proteínas se determinó en el sobrenadante por triplicado utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.).

La actividad de la citrato sintasa (CS) se determinó espectrofotométricamente a 412 nm tras la reducción de 5,5'-ditio-bis(2-ácido nitrobenzoico) 2 mM en presencia de 0, acetilo 1 mM. -CoA y ácido oxaloacético 12 mM en tampón Tris 200 mM (pH 7,4). El ensayo de NADH-decilubiquinona oxidorreductasa (complejo I) sensible a la rotenona se realizó a 340 nm usando el aceptor 2,3-dimetoxi-5-metil-6-n-decil-14-benzoquinona （ 80 μM） y NADH como donante de electrones (200 μM) en tampón Tris 10 mM (pH 8,0). Se usó la adición de 4 μM de rotenona para cuantificar la actividad sensible a la rotenona. La actividad de la citocromo oxidasa (complejo IV) se realizó a 550 nm utilizando citocromo c reducido 10 μM como donante y n-dodecil-ß-maltósido 2,5 mM para permeabilizar ambas membranas mitocondriales en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0).

Todos los ensayos de enzimas se determinaron por triplicado y los resultados se relacionaron con los del grupo de control, que se establecieron en 100.

2.8. Evaluación mitocondrial

La respiración mitocondrial y la producción mitocondrial de H2O2 se estudiaron in situ en fibras permeabilizadas con saponina utilizando músculos blancos gastrocnemio y sóleo|1]. Brevemente, las fibras se separaron bajo el microscopio binocular en solución A a 4 grados (en mM: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 taurinas, 0,5 DTT, 5{ {50}} K-metano sulfonatos, 20 imidazoles, 5,7 Na2 ATP y 15 creatina-fosfato, pH 7,1) y se permeabilizó en solución A con 50 ug·mL-I de saponina durante 30 min a 4 grados. La función respiratoria mitocondrial se determinó en un oxímetro equipado con un electrodo tipo Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). La cámara se llenó con 1 mL de Solución B (en mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 taurina, 0,5 DTT, 50 K-metano sulfonatos y 20 imidazoles, pH 7,1) y después de registrar contenido de oxígeno de referencia en la cámara, se colocó un paquete de 1-2 mg de peso seco de miofibras permeabilizadas en la cámara, que luego se cerró herméticamente. Después de las lecturas de línea de base, se hicieron secuencialmente las siguientes adiciones: palmitoil carnitina y malato (160 μM∶5 mM), glutamato (10 mM), succinato (25 mM), rotenona (0,5 μm), el desacoplador CCCP (1 μM), antimicina -A (8 uM), y diclorhidrato de N, N', N'-tetrametil-p-fenilendiamina y ascorbato (0,9:9 mM). La respiración se midió a 23 grados bajo agitación continua. Al final de cada prueba, las fibras se retiraron cuidadosamente de la celda xilográfica, se secaron y se secaron al menos 24 h a ~80 °C para determinar el peso de la fibra. Las tasas de consumo de O2 (JO2) se expresaron en nmol O2 min-1.(mg peso seco)-I. Todas las mediciones se realizaron al menos por duplicado.

La liberación neta de H2O2 por la respiración de las mitocondrias se midió en haces de fibras permeabilizadas con la sonda fluorescente Amplex Red (20 μM∶excitation-emission∶563-587 nm), como se describió anteriormente [32]. Después de la preparación de fibras permeabilizadas, muestras

destinados a las mediciones de H2O2 se enjuagaron tres veces en tampón Z(en mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O y 0.5 mg:mL{ {14}} BSA, pH7.3 a 4 grados). Se incubaron haces de fibras ({{20}}.3-1.0 mg de peso seco) a 37 grados en una microcubeta de cuarzo con agitación magnética continua en 600 uL de tampón Z (pH 7.3 a 37C) suplementado con 1,2 U·mL-I de peroxidasa de rábano picante. Las lecturas de fluorescencia de referencia se tomaron en ausencia de sustratos respiratorios exógenos. Luego se hicieron las siguientes adiciones secuencialmente: glutamato (5 mM), succinato (5 mM), rotenona (0,5 uM), ADP (10 mM) y antimicina-A （8 μM）. Al final de cada prueba, las fibras se se retira cuidadosamente de la cubeta, se seca y se seca para determinar el peso de la fibra. Las tasas de producción de H2O2 se expresaron en AU·min-1.(mg de peso seco)-I y capacidad peroxfos que correspondía a la respiración mitocondrial máxima en estado de fosforilación. Todas las mediciones se realizaron al menos por duplicado.

La capacidad de retención de calcio mitocondrial (CRC) se evaluó en fibras fantasma del músculo gastrocnemio blanco como se describió previamente [33]. Brevemente, las fibras se incubaron en una microcubeta de cuarzo con agitación continua en 600 μL de tampón CRC (en mM∶250 de sacarosa, 10 MOPS, 0,005 EGTA y 10P;-Tris, pH 7,3). A continuación, las fibras se expusieron a un único pulso de 20 nM de Ca2 plus. Los cambios en la concentración de calcio extramitocondrial se monitorearon fluorométricamente utilizando verde de calcio 5N (1 mM: excitación-emisión: 505-535 nm). La susceptibilidad del poro de transición de permeabilidad (PTP) se evaluó midiendo el tiempo requerido para la apertura de PTP, y CRC se tomó como la cantidad total de Ca 'acumulada por las mitocondrias antes de su liberación. Al final de cada prueba, las fibras se retiraron cuidadosamente de la cubeta, se secaron y secaron para determinar el peso de la fibra. Los valores de CRC se expresaron en nM de Ca2 más por mg de peso seco.

2.9. Análisis de Western Blot

Las proteínas de los músculos gastrocnemio y sóleo blanco se diluyeron en tampón Laemmli y se separaron en geles de poliacrilamida prefabricados al 10 por ciento Mini-PROTEAN TGX Stain-Free (Biorad); se cargó un estándar interno en cada gel. La separación electroforética se realizó a 200 V durante 35 min en tampón de migración (TrisBase 25 mM,0.2 M glicina y SDS al 1 por ciento (p/v)). La tecnología Stain-Free (SF) contiene un compuesto tri halo patentado que reacciona con las proteínas, haciéndolas detectables a través de la exposición a los rayos UV. Las imágenes de SF se realizaron con el software ChemiDoc MP Imager e Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, California, EE. UU.) con un tiempo de activación de tinción de 5-min y, por lo tanto, se visualizaron los patrones de proteínas totales. A continuación, las proteínas se transfirieron a una hoja de nitrocelulosa de 0,2 um utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Biorad). La calidad de la transferencia se controló mediante membranas de formación de imágenes utilizando tecnología SF. Después del paso de transferencia, las proteínas carbonilo se derivatizaron con dinitrofenilhidrazina diluyéndolas en HCl 2N y finalmente se lavaron extensamente con metanol. Las membranas se bloquearon con leche descremada en polvo al 5 % en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 (TBST: Tris/HCl 15 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM y Tween al 0,05 %-20) para 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se incubaron a 4 grados durante la noche o 2 h a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo primario de proteína carbonilo (Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) y SOD2 (#Ab13533, Abcam). Después de tres lavados de 10 min en TBST, se probaron las membranas con anticuerpos secundarios para la proteína carbonilo (HRP-conjugate;#STA-308, Cell Biolabs) y SOD2 (anti-rabbit IgG-HRP-linked;#7074, Cell Signalling) en solución de bloqueo durante 2 h a temperatura ambiente y finalmente se lavaron extensamente con TBST. La dilución de anticuerpos primarios y secundarios se optimizó para cada anticuerpo. La detección de quimioluminiscencia se realizó con ECL Clarity (Biorad) y la captura de imágenes con ChemiDocMP. Todas las imágenes fueron analizadas utilizando el software Image Lab 4.0.1. La normalización de las intensidades de las señales de las proteínas se llevó a cabo tras la cuantificación de los respectivos niveles de proteínas totales en imágenes SF, control de muestras y estándares internos.

2.10. Medición NAD

Los niveles de NAD y NADH total se midieron en gastrocnemio blanco homogeneizado utilizando un kit comercial (#K337-100, Biovision, EE. UU.) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se extrajo el grupo total de NAD (NADt= NADt y NADH). Para cada una de las muestras extraídas, la mitad de la muestra se calentó a 60 grados durante 30 minutos para descomponer el NADt y mantener el NADH intacto. Tanto las muestras de NADt como las de NADH se mezclaron con la enzima cíclica de NAD y se midió la absorbancia a 450 nm. NADt y NADH se cuantificaron comparándolos con la curva estándar de NADH y normalizándolos a mg de proteína. Finalmente, se calculó la relación de NAD más (NADt-NADH) a NADH. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

2.11. Estadísticas

Los datos se informan como media ± desviación estándar (DE). La normalidad de los datos se evaluó mediante la prueba de normalidad de D'Agostino-Pearson. El análisis de datos se realizó utilizando la prueba t de Student y ANOVA de dos vías (grupo y tiempo) para mediciones repetidas seguidas de la prueba post hoc de Bonferroni utilizando Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Se aplicó un nivel bilateral del 5 por ciento para el error tipo I.

3. Resultados

3.1. Composición Corporal y Metabolismo de Todo el Cuerpo

Quince días de suplementación con CF, en ratones de tipo salvaje (WT), no modificaron el peso corporal (p=0.091), la masa magra (p=0.{{24} }73) y masa grasa evaluada por EchoMRI (p=0.89;Figura 1A). Las tasas de consumo de O2 expresadas por masa magra fueron significativamente más altas en el ciclo de oscuridad (8±8 por ciento, p=0.042), mientras que permanecieron similares en el ciclo de luz (p =0 .392, figura 1B.). No hubo cambios en la actividad locomotora (no se muestran los datos). Los ratones CF mostraron un aumento significativo del gasto de energía de todo el cuerpo en un 15 ± 15 por ciento (p =0.042; Figura 1C) y en ingesta de alimentos (0.08±0.01 vs. 0.11±0.01 g por peso corporal magro, respectivamente grupo CF y WT, p=0.013, Figura 1D).

La suplementación con CF modificó significativamente el metabolismo de todo el cuerpo: el efecto principal de un RER más alto en el grupo CF se observó durante 24 h (p=0.023, Figura 2A) y el RER medio durante 12 h fue mayor en el grupo CF en ciclos de luz y oscuridad (más 5±3 por ciento, p=0.035 y más 9±4 por ciento, respectivamente, p=0.026). Además, la suplementación con CF promovió el uso de carbohidratos (CHO) (51± 13 por ciento del consumo de energía dependió de la oxidación de CHO en el grupo CF vs. 37 ± 12 por ciento en el grupo de control durante el ciclo de luz, p=0.108 y 71±21 por ciento en el grupo CF frente a 47±24 por ciento en el grupo de control durante el ciclo oscuro, p=0.004; Figura 2B.). Sin embargo, cuando se expresó en kJ, no hubo diferencia en la oxidación de CHO ni en la oxidación de ácidos grasos (oxidación de CHO: 3,7±1,4 kcal·d-1 en el control frente a 4,4±1,7 kcal.masa corporal magra-1. d-1 en CF,p=0.33 y oxidación de ácidos grasos: 2.3± 1.0 kcal·d-Iin control vs.2.6±0.87 kcal.masa corporal magra-1.d{{ 50}}en CF,p=0.608). El análisis de PRCF de RER reveló un aumento de los valores EC50 en el grupo CF (p=0,009; Figura 2D), lo que significa que CF induce un cambio hacia un mayor uso de carbohidratos. Se observó una disminución de la pendiente de Hill en el grupo CF (valores de H: 25,16±4,44 en los controles vs. 12,79±3,96 en el grupo CF, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Bioenergética mitocondrial

Probamos el efecto de la suplementación con CF en la energía de las mitocondrias en el músculo blanco gastrocnemio y sóleo en ratones WT. Se observó una mayor respiración mitocondrial usando sustratos del complejo IV en los músculos blancos gastrocnemio y sóleo (p=0.004 y p=0.028, respectivamente; Figura 3A, B). No se observaron modificaciones de las relaciones de respiración CII/CI y CIV/CI (p =0.899 y p =0.701 para el gastrocnemio blanco y p=0.693 y p{{ 11}}.912 para los músculos sóleo, respectivamente, datos no mostrados). Además, las actividades del complejo I, IV y citrato sintasa aumentaron significativamente en el músculo gastrocnemio blanco (respectivamente: más 31 ± 27 por ciento, p=0.004; más 28 ± 38 por ciento, p=0 0,027, más 35±38 por ciento, p= 0,009, más 14±13 por ciento, p=0,040; Figura 3C). el gastrocnemio blanco (más 24±12 por ciento, p =0.096; Figura 3D), mientras que no se observó diferencia en el sóleo (p =0.363). Las tasas relativas de respiración estimulada por palmitoil-carnitina no cambiaron cuando se expresaron en función de la respiración del complejo I (62 ± 11 en el grupo de control frente a 64 ± 20 en el grupo CF en el gastrocnemio blanco y 70 ± 18 frente a 72 ± 16 en el sóleo). A continuación, exploramos la sensibilidad a la apertura de PTP inducida por Ca plus en el gastrocnemio blanco. Como se muestra en la Figura 3E, ni el tiempo de apertura de PTP ni la capacidad de retención Ca² se modificaron después de la suplementación con CF (p=0.608 y p=0.943, respectivamente).

La evaluación del ARNm de los genes implicados en la biogénesis mitocondrial mostró una regulación positiva del 70 por ciento del ARNm de NRF1, mientras que no se informaron diferencias para PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa y Cox2 (Tabla 3). Exploramos, en algunas muestras, el efecto de la suplementación con CF en los supercomplejos mitocondriales (Figura S1, Materiales complementarios). El análisis densitométrico sugiere que la suplementación con CF aumentó el contenido general de supercomplejos sin adaptación o reordenamientos cualitativos. De hecho, la densidad respiratoria mejoró en un 58 % con las sondas de complejo I y complejo Ⅱ y en un 93 % con la sonda de complejo I. De manera similar, el contenido de complejo I y complejo III incrustado en supercomplejos fue mayor en el grupo CF.

La suplementación con CF reduce la emisión de ROS mitocondrial. Si bien la emisión de H2O2 permaneció sin cambios tanto en el gastrocnemio blanco como en el sóleo cuando se expresó por peso seco (Figura 4A, B, respectivamente), las tasas disminuyeron cuando se expresaron por contenido mitocondrial (Figura 4C). Se observó un efecto positivo principal de la suplementación con CF en varias condiciones en el gastrocnemio blanco (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Marcadores de estrés oxidativo en el músculo esquelético

El nivel de estrés oxidativo de la proteína celular en ratones WT no se vio afectado por la suplementación con CF, ya que el contenido celular de SOD2 fue similar en los grupos experimental y de control en el gastrocnemio y el sóleo blancos (Figura 4E). Además, no se observaron diferencias en la carbonilación de proteínas en el gastrocnemio y el sóleo blancos (Figura 4F). Además, no se observaron diferencias en la expresión de ARNm de catalasa y MnSod después de la suplementación con CF (Tabla 3).

3.4.Metabolismo de NAD

El grupo total de nucleótidos de piridina aumentó después de la suplementación con CF en un 36±33 por ciento (p=0.012). Específicamente, los contenidos de NAD y NADH aumentaron en el gastrocnemio blanco (respectivamente en un 69±60 por ciento, p{{6 }}.026 y 29± 42 por ciento, p=0.017; Figura 5A,B) y la relación NAD más /NADH tendió a aumentar en el grupo CF (p =0.084). No se observó un efecto significativo para el ARNm de Sirt3 (p=0.096), el ARNm de NMNAT (p=0.094) y el ARNm de Sirt1 (p =0.869; Tabla 3 ).

3.5. Respuesta del metabolismo celular y de todo el cuerpo después de la suplementación con CF en ratones Sirt3-/

Examinamos el efecto de la suplementación con CF en ratones Sirt{{0}}. La composición corporal como peso, masa magra y masa grasa no fue diferente entre los grupos CF y control (p= 0.52,p=0.66,p=0.45, respectivamente; Figura 6A). De manera similar, el gasto energético diario no se vio afectado por la suplementación con CF ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal.cuerpo magro masa-1.día-1 en los controles vs. 0.39 ± 0.01 Kcal·masa corporal magra-1.día-1 en CF, p=0.502;Figura 6B). El RER fue similar entre ambos grupos en los ciclos de luz y oscuridad (p=0.301; Figura 6C), y la oxidación del sustrato no se vio afectada por la suplementación con CF (44 ± 17 por ciento del consumo de energía dependía de la oxidación de CHO en el ciclo de luz). grupo control frente a 50 ± 11 % en el grupo CF durante la fase de luz, p=0.209 y 65 ± 19 % en el grupo de control frente a 77 ± 21 % en el grupo CF durante la fase oscura, p=0.395; Figura 6D). La flexibilidad metabólica evaluada por la amplitud del RER durante 24 h se mantuvo similar entre los dos grupos (0,19± 0,05 en el control frente a 0,20±0,03 en CF, p=0,604), mientras que la pendiente PRCF disminuyó en el grupo CF (Valores de H: 17,77±4,38 en control vs. 12,79±3,93 en CF, p=0,039).

A continuación, comparamos el efecto de la suplementación con CF sobre las actividades de las enzimas mitocondriales. La suplementación con CF no logró aumentar la actividad enzimática del complejo I, I, IV y CS en Sirt3-/ratones como se observó previamente en WT (respectivamente: p=0.623,p=0 .629, p=0.283 y p=0.791, Figura 6E). Se observó una mayor actividad enzimática del complejo y IV en ratones WT en comparación con Sirt3-7 después de la suplementación con CF ( respectivamente:p=0.027 y P=0.045)

4. Discusión

En este estudio, proporcionamos un análisis integrador del efecto de la ingestión de CF. Observamos que la ingestión crónica de CF mejoró la respiración mitocondrial y redujo la producción de H2O2, evaluada en su entorno de miofibras, mientras que la susceptibilidad a la apertura de PTP no cambió. La ingestión de CF mejoró el metabolismo de NAD, lo que respalda la participación de las vías de sirtuina en las adaptaciones mitocondriales observadas. También observamos modificaciones en el metabolismo de todo el cuerpo hacia una mayor capacidad para usar carbohidratos como sustrato principal, lo que sugiere que las adaptaciones mitocondriales probablemente contribuyeron a la adaptación observada del metabolismo de todo el cuerpo.

4.1.Metabolismo

La administración dietética de flavanoles de cacao se ha identificado como una estrategia eficaz para aliviar la intolerancia a la glucosa, lo que brinda oportunidades para mejorar las enfermedades metabólicas [34]. Nuestros resultados están de acuerdo con estudios previos que informaron una mayor tolerancia a la glucosa después de la ingesta de flavanoles [35,36]. Los mecanismos propuestos para este efecto implican un aumento en la translocación de GLUT4 hacia la membrana celular, un aumento en la fosforilación de AMPK y la sobrerregulación de la expresión del gen UCP-2 en el músculo esquelético [8,37]. . Además, la ingesta de CF se asoció con una mejora de la sensibilidad a la insulina en humanos[8]. Después de 15 días de consumo de chocolate negro, se observó una disminución de la evaluación del modelo de homeostasis del índice de resistencia a la insulina en sujetos sanos junto con un aumento del índice de verificación de sensibilidad a la insulina cuantitativa y el índice de sensibilidad a la insulina [8]. También observamos un aumento concomitante en la tolerancia a la glucosa y la flexibilidad metabólica en ratones WT, lo que se refiere a la capacidad de un organismo para adaptar la oxidación de combustible a la disponibilidad de combustible [38]. Curiosamente, mientras que la capacidad oxidativa mitocondrial deteriorada y la oxidación de sustratos relacionada se asociaron con la resistencia a la insulina 39, el entrenamiento de resistencia aumentó el contenido mitocondrial, la sensibilidad a la insulina y la flexibilidad metabólica [38]. Por lo tanto, los presentes resultados son específicos de la suplementación con CF y no están influenciados por la actividad espontánea.

El efecto positivo de la CF sobre la flexibilidad metabólica, así como el aumento de la actividad de los complejos mitocondriales, se atenuaron en los ratones Sirt3-7, lo que indica que los efectos positivos de la CF se producen al menos parcialmente a través de Sirt3. Estos resultados respaldan los hallazgos previos y el papel fundamental de Sirt3 en la regulación de la flexibilidad metabólica [24]. Nuestros resultados sugieren que un aumento en la función mitocondrial puede mejorar la flexibilidad metabólica. Sin embargo, además de la función mitocondrial, el cociente respiratorio basal, la tasa de eliminación de glucosa, la capacidad de almacenamiento de lípidos en el tejido adiposo y la concentración de ácidos grasos libres en plasma también se identificaron como factores determinantes de la flexibilidad metabólica y deben ser considerados [40]. Los estudios futuros deberían evaluar los determinantes celulares de la flexibilidad metabólica más profundamente para profundizar nuestra comprensión de las causas subyacentes de la mejora de la flexibilidad metabólica después de la suplementación con CF.

La evaluación del metabolismo de todo el cuerpo reveló un aumento en la oxidación relativa de CHO después de la suplementación con CF. Este resultado contrasta con un estudio anterior que informó un aumento en la lipólisis luego de una ingestión aguda de flavanoles o una suplementación de dos semanas con flavanoles en ratones [36]. Además de las diferencias en la composición del extracto, estos hallazgos contradictorios pueden deberse a los efectos pleiotrópicos del NO. Está bien aceptado que la ingestión de FC estimula la producción o la biodisponibilidad del metabolismo del NO [7]. Por un lado, el NO estimula el transporte y la captación de glucosa en el músculo esquelético. La estimulación de la producción de NO en miotubos derivados de líneas celulares mediante insulina o peróxido de hidrógeno resultó en un aumento de la translocación de GLUT4, que se redujo con la inhibición de nNOS [41]. Además, el NO puede aumentar el transporte de glucosa en una vía independiente de la insulina que conduce a un aumento en los niveles de GMP cíclico y AMPK [42], lo que promueve la oxidación de glucosa en el músculo esquelético de rata independientemente de la disponibilidad y oxidación de ácidos grasos [43]. Por otro lado, el NO promueve la oxidación de ácidos grasos al reducir el nivel de malonil-CoA mediante la inhibición de la acetil-CoA carboxilasa y la activación de la malonil-CoA descarboxilasa en el músculo esquelético[44]. Si bien observamos un cambio hacia una menor proporción relativa de usar ácido graso como sustrato con FC, no hubo diferencia con respecto a los valores absolutos expresados ​​en kJ. Esto sugiere que el aumento en el gasto de energía observado con la suplementación con CF se basa en un aumento en la oxidación de la glucosa. Por lo tanto, estos resultados apoyan la idea de que el consumo de CF aumenta la sensibilidad a la insulina y promueve la oxidación de glucosa sin un efecto concomitante sobre la capacidad de oxidación de ácidos grasos. Estos resultados plantean la cuestión de la relevancia del uso de flavanoles de cacao en el contexto de una dieta rica en grasas. Los estudios futuros deberían evaluar un posible efecto nocivo de una asociación de suplementos de CF y una dieta rica en grasas.

4.2.Función mitocondrial

Se ha demostrado que la administración dietética de flavanoles de cacao mejora la función mitocondrial, lo que incluye (i) la respiración mitocondrial y las actividades de las enzimas de la cadena de transporte de electrones; (i) la liberación mitocondrial de H2O2, que refleja la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales; y (i) la capacidad de retención de calcio mitocondrial que refleja la susceptibilidad a la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) (para revisión, consulte [11]. Nuestros resultados están de acuerdo con estudios previos; sin embargo, nuestro estudio fue el primero en evaluar el efecto de La suplementación con CF sobre la función mitocondrial evaluada in situ en fibra permeabilizada y en diferentes tipos de músculos A diferencia de los estudios previos sobre mitocondrias aisladas, la evaluación de la función mitocondrial en fibra permeabilizada conserva la morfología mitocondrial, las interacciones funcionales con otros componentes intracelulares [1] y evita la estructura mitocondrial interrupción durante el proceso de aislamiento mitocondrial [32] Por lo tanto, es importante estudiar la función mitocondrial en preparaciones de tejido donde se conserva la estructura mitocondrial y se representa todo el grupo mitocondrial para evaluar mejor la respuesta al tratamiento.

Estudios previos realizados en cultivos celulares o in vivo en ratones han demostrado que la suplementación con EPI, que se considera la principal molécula bioactiva en la FQ, aumenta la respiración máxima estimulada por ADP (p. ej., respiración de estado 3) cuando las mitocondrias se energizan con una combinación de energía sustratos que alimentan varios sitios a lo largo de la cadena respiratoria [45-49]. De acuerdo con estos resultados, observamos un efecto principal de la suplementación con CF sobre la respiración mitocondrial en los músculos oxidativos y glucolíticos. Para determinar si este aumento está relacionado con un aumento de la masa mitocondrial o con la remodelación de los complejos respiratorios mitocondriales, evaluamos los supercomplejos mitocondriales del músculo cuádriceps. Se cree que estas estructuras supramoleculares disminuyen la producción de ROS, estabilizan o ayudan en el ensamblaje de complejos individuales, regulan la actividad de la cadena respiratoria y evitan la agregación de proteínas en la membrana mitocondrial interna rica en proteínas [50-52]. A pesar de un número limitado de medidas, el análisis visual de los resultados (Materiales complementarios) sugiere que la suplementación con CF induce un aumento de la masa mitocondrial, como se refleja en un aumento en todas las especies supercomplejas, en lugar de reorganizaciones específicas del complejo de la cadena respiratoria. En conjunto, estos resultados sugieren que la FQ promueve un aumento de la masa mitocondrial sin una adaptación cualitativa de los arreglos complejos de la cadena respiratoria.

Durante la respiración mitocondrial, se forman cantidades variables de superóxido que pueden metabolizarse para formar otros tipos de ROS [53]. Aunque la producción excesiva de ROS de las mitocondrias está involucrada en un amplio espectro de patologías, las bajas concentraciones fisiológicas de ROS pueden tener efectos beneficiosos, como la protección contra agentes infecciosos y la participación en la señalización celular [2,54]. Estudios previos realizados in vivo en roedores y humanos y modelos de cultivo celular informaron efectos beneficiosos de la suplementación con CF en la producción de ROS y varios sistemas antioxidantes [11]. Por ejemplo, la alimentación forzada oral con EPI durante 15 días aumenta la SOD2 y la actividad de la catalasa en los músculos cuádriceps de ratones [17]. Si bien la producción de ROS mitocondrial no ha sido ampliamente evaluada, observamos que los niveles de producción de ROS fueron similares cuando los valores se expresaron por peso muscular, mientras que la producción disminuyó cuando se expresó por masa mitocondrial, lo que sugiere que se producen adaptaciones cualitativas para mantener las concentraciones fisiológicas de ROS. Además, no observamos ningún efecto de CF en SOD2 ni daños inducidos por ROS evaluados por carbonilación de proteínas. Mientras que CF mejora las reservas de proteínas antioxidantes, incluidos los niveles de SOD2 y catalasa ampliamente informados [16,17,55], esta adaptación no siempre se asoció con una disminución en los daños inducidos por ROS [56-59]. Estos datos respaldan la teoría de que se requieren bajos niveles de producción de ROS para la homeostasis celular normal [2]. En conjunto, estos resultados sugieren que, junto con un aumento de la masa mitocondrial, la CF promueve adaptaciones mitocondriales cualitativas para mejorar su capacidad antioxidante y mantener niveles bajos de producción de ROS.

4.3.Biogénesis mitocondrial

La masa mitocondrial es el resultado de la interacción entre la biogénesis mitocondrial y la mitofagia. Nuestro estudio se centró en la biogénesis mitocondrial activada por el consumo de polifenoles [60]. La biogénesis mitocondrial es el proceso celular que mejora la masa mitocondrial. Este proceso complejo y altamente regulado involucra varios factores de transcripción, receptores de hormonas nucleares y coactivadores de transcripción que actúan colectivamente para coordinar cambios en la expresión de genes codificados por ADN nuclear y mitocondrial [61]. Estudios previos han intentado identificar qué vías pueden ser la base de la biogénesis mitocondrial inducida por la suplementación con FQ. La estimulación de la señalización dependiente de NO ha surgido como una vía central involucrada en la biogénesis mitocondrial. La suplementación con CF mejora la generación de NO al inhibir la enzima arginasa que degrada la arginina, lo que aumenta la disponibilidad de L-arginina para la biosíntesis de NO [62,63]. Además, al usar un inhibidor de eNOS, el efecto estimulante de la epicatequina sobre la biogénesis mitocondrial se vio parcialmente mitigado [17]. Estos resultados sugieren la participación de otras vías de señalización para estimular la biogénesis mitocondrial.

Recientemente, Aragonés et al. (2016) informaron que las proantocianidinas dietéticas, miembros de la familia de los polifenoles, estimulan el metabolismo hepático de NAD plus al mejorar la ruta de biosíntesis de ahora o NAD plus y la actividad de Sirte de una manera dependiente de la dosis en ratas [12]. Además, el hígado exporta precursores de NADt a otros órganos, como el músculo esquelético, que tienen una menor capacidad para sintetizar NAD, lo que plantea la posibilidad de extender los efectos observados en el hígado a todo el organismo [64]. Si bien algunos estudios informaron un efecto de la suplementación con CF en el contenido, la actividad o el ARNm de la proteína Sirt1 [12,15-17,65,66], la participación del metabolismo de NAD en la biogénesis mitocondrial después de la suplementación con CF usando pérdida o ganancia de La función nunca ha sido probada. Si bien una desactivación específica del músculo hubiera sido preferible a los ratones Sirt3 KO de cuerpo entero utilizados en nuestro estudio, nuestros resultados sugieren que la FQ mejora el metabolismo de NAD, y Sirt3 está involucrado en esta mejora de la actividad de la cadena de transporte de electrones mitocondrial inducida por la suplementación. Los efectos positivos observados en la actividad de los complejos mitocondriales después de la suplementación con CF no se observaron usando ratones Sirt3-7 y se observó una mayor actividad de los complejos I y IV después de la suplementación con CF solo en WT. Estas observaciones amplían trabajos anteriores que muestran que Sirt3 desempeña un papel fundamental en la función mitocondrial]67. En conjunto, estos hallazgos sugieren que las sirtuinas, a través de la modulación del metabolismo de NAD, están involucradas en la mejora de la masa mitocondrial observada después de la suplementación con CF. 4.4.Límites

Los granos de cacao están compuestos por una mezcla de flavanoles monoméricos, oligoméricos y poliméricos. Entre los flavanoles, el EPI parece ser el monómero polifenólico más abundante que se encuentra en los productos de cacao y representa hasta el 35 % del contenido de polifenoles [68]. EPI se estableció como la principal molécula bioactiva subyacente a los beneficios asociados con la suplementación con cacao y chocolate [47,69]. Sin embargo, los metabolitos de EPI (EPIm) pueden estar involucrados en los efectos biológicos inducidos por EPI observados en estudios in vivo. EPIm puede alcanzar concentraciones plasmáticas más altas que EPI[70]. Además, se observaron diferencias importantes en EPIm entre especies. De hecho, el 80 por ciento de EPIm presente en humanos no se detectó en ratas, mientras que se encontró que la similitud entre ratones y humanos era ligeramente más favorable ya que se detectaron los dos principales metabolitos humanos [70]. Utilizamos extracto CF enriquecido que contiene hasta cinco veces más EPI que los granos de cacao sin fermentar[71]. Además, el contenido de EPI se redujo en 10-20 por ciento por fermentación y disminuyó de manera dependiente de la temperatura durante el tostado [71,72]. En conjunto, estos datos sugieren que solo se debe prestar atención al contenido de EPI al evaluar los beneficios de la suplementación con EPI en la salud humana, y los presentes resultados deben considerarse con precaución antes de extrapolar los mecanismos subyacentes observados en humanos.

5. Conclusiones

La suplementación diaria con CF durante 15 días conduce a mejoras en la función mitocondrial en los músculos oxidativos y glucolíticos. Los presentes resultados sugieren que el aumento de la respiración mitocondrial da como resultado un aumento en la masa mitocondrial mientras se mantiene el nivel celular de producción de ROS, lo que sugiere adaptaciones cualitativas dentro de las mitocondrias. Concomitantemente con el efecto celular sobre el metabolismo del NO descrito previamente [73], la FQ modula el metabolismo del NAD, lo que estimula la actividad de las sirtuinas. Sirt3 juega un papel central en las adaptaciones mitocondriales y la flexibilidad metabólica después de la suplementación con CF. Dado que las sirtuinas son dianas recientes en la patogenia de varias enfermedades, como la diabetes o el asma [74,75l], estudios adicionales explorarán el interés potencial de usar CF como un activador natural de las sirtuinas.

Referencias

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