Quercetina atenúa alteraciones oxidativas cerebrales inducidas por nanopartículas de óxido de hierro en ratas

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Resumen: La terapia con nanopartículas de óxido de hierro (IONP) tiene diversos beneficios para la salud, pero las dosis altas o la terapia prolongada pueden inducir lesiones celulares oxidativas, especialmente en el cerebro. Por lo tanto, llevamos a cabo el estudio actual para investigar el papel protector dequercetinasuplementación contra las alteraciones oxidativas inducidas en cerebros de ratas por IONPs. Cuarenta ratas albinas macho adultas se distribuyeron en cinco grupos iguales; el control recibió una dieta basal normal, el grupo de IONP recibió una inyección intraperitoneal de IONP de 50 mg/kg de peso corporal (BW) y los grupos tratados con quercetina tenían IONP más Q25, IONP más Q50 e IONP más Q100 que se reemplazaron por vía oral con quercetina mediante dosis de 25, 50 y 100 mg de quercetina/kg de peso corporal al día, respectivamente, administradas con la misma dosis de IONP durante 30 días. Los IONP indujeron aumentos significativos en el malondialdehído (MDA) y redujeron significativamente el glutatión reducido (GSH) y el glutatión oxidado (GSSG). En consecuencia, los IONP indujeron significativamente lesiones graves en el tejido cerebral debido a la deposición de hierro que condujo a alteraciones oxidativas con aumentos significativos en la creatina fosfoquinasa (CPK) y la acetilcolinesterasa (AChE) cerebrales. Además, los IONP indujeron reducciones significativas en la epinefrina, la serotonina y la melatonina cerebrales con la regulación a la baja del coactivador gamma activado por el proliferador de peroxisomas 1-alfa (PGC-1a) y el ARNm del factor de transcripción mitocondrial A (mtTFA) expresiones Los IONP indujeron la apoptosis en el cerebro monitoreada por aumentos en la caspasa 3 y disminuciones en los niveles de expresión del linfoma de células B 2 (Bcl2). La suplementación con quercetina derrotó notablemente al cerebrodaños oxidativosde manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente la suplementación con quercetina durante los IONP para obtener los beneficios de los IONP con menos riesgos para la salud.

Palabras clave: nanopartículas de óxido de hierro; estrés oxidativo; quercetina; antioxidante

1. Introducción

Las nanopartículas de óxido de hierro (IONP) se utilizan para el direccionamiento de fármacos, la administración de genes, el etiquetado de células, un agente de contraste en imágenes de resonancia magnética y la terapia de hipertermia[1]. También se utiliza como aditivo alimentario en bebidas y cereales fortificados con hierro para consumo humano [2], además de numerosos usos industriales en el tratamiento de aguas residuales, detección de gases y lubricantes absorbentes de semiconductores, pigmentos y revestimientos [3]. Sin embargo, el uso diverso de IONP induce una sobrecarga de hierro y el posterior inicio del estrés oxidativo en varios órganos [4]. La ingestión, la inhalación y la penetración dérmica son las principales vías de entrada de los IONP[5]. En el torrente sanguíneo, los IONP se unen a proteínas plasmáticas y se distribuyen en diferentes

órganos, incluidos el hígado, el bazo, los riñones, los pulmones y el corazón, y penetran la barrera hematoencefálica (BBB), induciendo lesiones oxidativas [6,7]. Los hierros liberados de los IONP que causan la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) conducen a alteraciones oxidativas graves en lípidos, proteínas y ADN [8,9].

quercetina(3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona) es unflavonoidepresente en frutas (manzanas, bayas, cerezas y uvas rojas) y vegetales (cebollas y brócoli) además de muchas semillas, trigo sarraceno, nueces, flores, cortezas, té verde y aceite de oliva[10]. La quercetina tiene abundantes efectos valiosos que incluyen efectos antiinflamatorios, antioxidantes, antimutagénicos, antiisquémicos, antivirales y antienvejecimiento [11-17]. La quercetina es lipofílica y puede penetrar la barrera hematoencefálica (BBB)[18]. Además, la quercetina exhibe un papel antioxidante potencial mediante la mejora del glutatión reducido (GSH) y la regulación positiva de la superóxido dismutasa de cobre-zinc (SOD1) [17]. La quercetina puede quelar el hierro, inhibiendo la reacción de Fenton e inhibiendo la generación de ROS [19]. En consecuencia, la quercetina es un potencial terapéutico para múltiples enfermedades neurodegenerativas y lesiones neuronales [20]. losantioxidanteEl potencial de la quercetina nos animó a realizar el presente estudio para investigar el potencial protector de la quercetina contra las alteraciones oxidativas inducidas por los IONP en los tejidos cerebrales.

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2. Resultados

2.1.Tamaño y cargo de los IONP

Una imagen SEM de IONP, como se muestra en la Figura 1, reveló una forma esférica con un tamaño promedio de 16.34-22.88 nm mientras poseía un valor de potencial zeta positivo más 22.8 mV (Figura 2).

2.2. Estrés oxidativo cerebral y estado antioxidante

Los niveles del producto de peroxidación lipídica malondialdehído (MDA) aumentaron significativamente en el grupo de IONP (p<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">

Los niveles de GSH en el homogeneizado de cerebro se redujeron significativamente en IONP (p<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">

Los niveles de glutatión oxidado (GSSG) aumentaron significativamente en IONP (p<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">

Según los datos de GSH y GSSG, los valores de la relación GSH/GSSG disminuyeron significativamente en los IONP (p<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>

2.3.Actividades de la creatina fosfoquinasa cerebral (CPK) y la acetilcolinesterasa (AChE)

Las actividades de CPK aumentaron significativamente en IONP (p<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>

En la Figura 4B, las actividades de AChE aumentaron significativamente en IONP (p<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">

2.4.Hormonas cerebrales de epinefrina, serotonina y melatonina

Los niveles de epinefrina en los homogeneizados de cerebro se redujeron significativamente en los IONP (p<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">

Como se puede ver en la Figura 4D, los niveles de serotonina se redujeron significativamente en los IONP (p<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">

Los niveles de melatonina en homogeneizados de cerebro se redujeron significativamente en IONP (p<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">

2.5. Expresión de ARNm de PGC-1a y mtTFA en el cerebro

Los cambios en la expresión del ARNm del coactivador gamma 1-alfa(PGC-1a) activado por el proliferador de peroxisomas se redujeron significativamente en los IONP (p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">

En IONP (p<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">

2.6. Evaluación de tinción de hematoxilina (H) y eosina (E) de secciones de cerebro

Las evaluaciones histológicas del tejido cerebral revelaron que el grupo de control mostró una estructura histológica normal de las capas del cerebelo (Figura 6A). En el grupo IONP, el cerebelo mostró un agotamiento severo de la capa de células de Purkinje (Figura 6B) La capa debida a los IONP se alivió en los grupos de IONP más Q25 (Figura 6C), IONP más Q50 (Figura 6D) e IONP más Q100 (Figura 6E) de manera dependiente de la dosis.

Las ratas del grupo de control mostraron una estructura histológica normal de las meninges y la corteza cerebral (Esquema 1A), mientras que las meninges de las ratas tratadas con IONP mostraron congestión de los vasos sanguíneos submeníngeos (Esquema 1B). En los grupos de IONP, el cerebro del cerebro de las ratas mostraron satelitosis, neuronofagia (Esquema 1C), gliosis (Esquema 1D) y espongiosis (Esquema 1E) además de congestión del plexo coroideo (Esquema 1F).

Como puede verse en el Esquema iF, el cerebro de las ratas del grupo IONP más Q25 mostró espongiosis (flechas cortas) y congestión de los vasos sanguíneos submeníngeos. Además, el cerebro de las ratas del grupo IONP más Q50 mostró espongiosis leve y congestión de los vasos sanguíneos (Esquema 1H). El cerebro de ratas en el grupo IONPs más Q100 mostró una estructura histológica relativamente normal de las meninges y la corteza cerebral (Esquema 1I).

2.7. Evaluación de tinción con azul de Prusia de secciones de cerebro

Las secciones de cerebro del grupo de control mostraron tinción negativa con azul de Prusia (Figura 7A). En el grupo de IONP, se reconocieron manchas de tinción de azul de Prusia en secciones de cerebro (Figura 7B). Por el contrario, la intensidad de las manchas de tinción de azul de Prusia de las secciones del grupo de IONP fue atenuada por la quercetina en los grupos de IONP más Q25 (Figura 7C), IONP más Q50 (Figura 7D) e IONP más Q100 (Figura 7E) en un manera dependiente de la dosis.

2.8. Niveles de proteína caspasa 3 y Bcl2 en secciones del cerebro

El grupo de control mostró una expresión negativa de los niveles de proteína caspasa 3 (Figura 8A) mientras que estaban altamente expresados ​​en IONP (Figura 8B).Tratado con quercetinaLos grupos (Figura 8C-E) mostraron una baja expresión de caspasa 3 en comparación con los IONP. Por el contrario, Bcl2 se expresó significativamente en IONP más Q25 (Figura 9C), IONP más Q50 (Figura 9D) y IONP más Q100 (Figura 9E) en comparación con IONP (Figura 9B) y el grupo de control (Figura 9A).

3. Discusión

La exposición a los IONP condujo al hierro y su depósito en los tejidos blandos, especialmente en el cerebro [21]. En el presente estudio, reconocimos la deposición de hierro en el cerebro evidenciada por la tinción con azul de Prusia y las alteraciones morfológicas monitoreadas por la evaluación de la tinción con H y E. Dhakshinamoorthy et al. [22] demostraron que el contenido de hierro aumentó significativamente en el tejido cerebral de los grupos tratados con IONP en comparación con el control. Esto se evaluó mediante la tinción con azul de Prusia de las regiones del cerebro y se evidenció mediante manchas azules en la corteza frontal, el hipocampo y el cerebelo. El Sayed et al. [23] también indicaron aumentos significativos en los niveles de hierro en el tejido cerebral debido a la administración de IONP en ratas.

Los IONP podrían tener más capacidad para penetrar la BBB e inducir lesiones en las células cerebrales que otras células de órganos [24,25]. Otra explicación puede ser que el aumento de los niveles de hierro

en el cerebro debido a la unión del hierro a la transferrina desencadena la regulación al alza de los receptores de hierro en el cerebro y, en consecuencia, transporta el hierro a través de la BHE [26].

Los feiones libres reaccionan con H2O2 para generar ROS en el proceso de reacción de Fenton [27]. Las ROS elevadas aumentaron la permeabilidad de la membrana mitocondrial externa, la peroxidación lipídica, el daño proteico y la cadena de ADN se rompió [28]. losestrés oxidativode ROS condujo a aumentos en los niveles cerebrales del producto de peroxidación lipídica, MDA, como se indicó en el estudio actual en ratas tratadas con IONP. De manera similar, Dhakshinamoorthy et al, [22] informaron aumentos significativos en los niveles de MDA en tejidos cerebrales de ratones tratados con IONP. Reddy y otros[26] también indicó que los niveles de MDA aumentaron significativamente en el tejido cerebral en una dosis alta pero un aumento no significativo en una dosis baja en ratas tratadas con IONP. Gaharwar y Paulraj [5] revelaron que los niveles de MDA estaban significativamente elevados en ratas tratadas con IONP. De manera similar, los IONP indujeron la lesión oxidativa de los cardiomiocitos monitoreada por una alta producción de MDA y concentraciones disminuidas de GSH [29].

Los autores de varios estudios han investigado el efecto protector de los productos naturales o sus extractos contra los efectos secundarios asociados con los IONP, incluidos los extractos de Echinacea purpurea [30] y Antlriscus sulvestris [31]. En el estudio actual, investigamos el papel protector de la quercetina contra la toxicidad de los IONP en el cerebro de las ratas. La suplementación con quercetina en ratas tratadas con IONP disminuyó los niveles de MDA en el tejido cerebral y nuestros resultados coincidieron con los obtenidos por Dong et al. [32] quien afirmó que la quercetina disminuyó la peroxidación lipídica al reducir los niveles de MDA en el tejido cerebral en ratas. Esto puede explicarse por la capacidad de la quercetina para reducir las ROS, por lo tanto, inhibiendo la peroxidación lipídica y previniendo la formación de MDA [33]. Esto se atribuyó al grupo catecol (anillo B) y al grupo OH en la posición 3 del anillo A y C, que tienen una eliminación óptima de radicales libres [17].

GSH es una parte esencial de la defensa antioxidante celular que reacciona directamente con ROS y otras especies reactivas [34]. En el presente estudio, los niveles de GSH en el cerebro disminuyeron significativamente en las ratas tratadas con IONP, pero los niveles de GSSG aumentaron significativamente. Reddy et al. [26] indicaron el agotamiento de los niveles de GSH en el tejido cerebral de las ratas tratadas con IONP y sugirieron que podría deberse a una mayor utilización de GSH en las reacciones de conjugación como parte de un mecanismo de desintoxicación, por lo tanto, GSH reducido, GSSG oxidado y disminuido. aumentó. La coadministración de ratas tratadas con IONP con quercetina restauró eso al aumentar los niveles de GSH y disminuir los niveles de GSSG en el tejido cerebral. Estos resultados estaban en armonía con Singh et al. [35] quien informó la elevación de los niveles de GSH en el tejido cerebral, lo que indica el potencial antioxidante de la quercetina. Dong et al. [32] también reveló que la quercetina alteró la expresión del gen del factor 2 (Nrf2) relacionado con el factor eritroide 2- nuclear. En consecuencia, Nrf2 estimuló la producción de enzimas antioxidantes en los tejidos cerebrales.

En el presente estudio, la CPK aumentó significativamente en el tejido cerebral de las ratas tratadas con IONP. En el almacenamiento de energía celular y la transmisión de energía, la CPK/fosfocreatina juega un papel importante, especialmente en células con necesidades energéticas altas y fluctuantes, como las neuronas [36]. Por lo tanto, la activación del sistema CPK/fosfocreatina y los cambios en la expresión de CPK pueden ser un indicador temprano de estrés oxidativo y bioenergético en la célula [37] como compensación por la disminución de la producción de energía debido al estrés oxidativo. La coadministración de ratas tratadas con IONP con quercetina disminuyó la CPK en el tejido cerebral, Lemmens et al. [38]disminuciones demostradas de las actividades de CPK debido a la suplementación con quercetina.

La actividad de la AChE en el tejido nervioso es responsable de la hidrólisis de la acetilcolina (Ach) a colina en las sinapsis y la unión neuromuscular [39]. En el presente estudio, la AChE aumentó significativamente en las ratas tratadas con IONP y este resultado estuvo en armonía con Dhakshinamoorthy et al. [22] quienes reconocieron aumentos significativos en las actividades de AChE en el tejido cerebral de ratas tratadas con IONP en las que la acumulación de hierro por IONP alteró el sistema colinérgico.

Los neurotransmisores son sustancias químicas endógenas que permiten que las neuronas se comuniquen por todo el cuerpo; permiten que el cerebro realice diferentes funciones en la transmisión sináptica química [40]. En el estudio actual, las concentraciones de epinefrina, serotonina y melatonina en los tejidos cerebrales se redujeron significativamente en las ratas tratadas con IONP.

Yousef et al. [41] informaron que los niveles de serotonina y dopamina se redujeron significativamente en el tejido cerebral en ratas tratadas con IONP. Por el contrario, la quercetina aumentó las concentraciones de epinefrina, serotonina y melatonina en los tejidos cerebrales en comparación con los IONP. Singh et al. [35l declaró que la quercetina aumentaba la serotonina, la norepinefrina y la dopamina.

La biogénesis mitocondrial asume un papel principal en el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial para satisfacer las necesidades fisiológicas celulares de las células neurales [42]. PGC-1a es un factor de regulación co-transcripcional que induce la biogénesis mitocondrial y promueve la expresión de mtTFA [43]. En el presente estudio, los niveles de expresión de PGC-1a y mtTFA se redujeron significativamente en el tejido cerebral en ratas tratadas con IONP. Nuestros resultados concuerdan con los obtenidos por Yousef et al. [44]. Ilustraron que la biogénesis mitocondrial representada por PGC-la y mtTFA disminuyó significativamente su expresión en el tejido cerebral en ratas expuestas a IONP, lo que indica una disminución de la biogénesis mitocondrial y la replicación y transcripción del mtDNA que podría conducir a una disfunción mitocondrial. La coadministración de ratas tratadas con IONP con quercetina restauró esta disminución al elevar las expresiones de PGC-1a y mtTFA en el tejido cerebral y nuestros resultados coincidieron con los de Sharma et al.[45] quienes informaron que la quercetina aumentó la expresión de PGC-1a, NRF-1, NRF-2 y mtTFA. Sugirieron que debido a una disminución de ROS por parte de la PGC inducida por quercetina{{17 }}un aumento, esto condujo a la activación de NRF-1 y NRF-2 estimuló la expresión de mtTFA.

La quercetina atenuó el efecto apoptótico de los IONP a través de una reducción significativa de la caspasa 3 y un aumento en los niveles de expresión de Bcl2 en secciones inmunohistoquímicas de cerebro. Este hallazgo apoya laantioxidantepotencial de la quercetina. De manera similar, el tratamiento con quercetina atenuó el aumento de caspasa 3 en la lesión cerebral isquémica en ratas [46,47] y Bcl2 en ratones tratados con lipopolisacáridos [48].

4. Materiales y Métodos

4.1.Reactivos y Químicos

El polvo de nanopartículas de óxido de hierro (ⅡI) se obtuvo de Sigma-Aldrich (Louis, Mo, EE. UU.), que se solubilizó en agua desionizada antes de su uso. La quercetina en forma de polvo también se obtuvo de Sigma-Aldrich, que se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) y agua destilada en una proporción de 1:20, respectivamente, antes de su uso. Se adquirió DMSO superior o igual al 99,6 por ciento de Sigma-Aldrich. Se compraron otros productos químicos y agua desionizada del Centro de Estudios e Investigación de Posgrado de la Universidad de Alexandria.

4.2. Declaración de Ética

El estudio fue aprobado en respuesta a las directrices de la "Guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio" por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Alejandría, Egipto.

4.3. Caracterización de IONP

La morfología y el tamaño de partícula de los IONP se examinaron mediante microscopio electrónico de barrido (SEM). La carga de la partícula también se determinó mediante el potencial zeta utilizando un ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido).

4.4.Animales, Alojamiento y Diseño Experimental

Se compraron cuarenta ratas albinas macho adultas sanas que pesaban 150 ± 20 de peso corporal (BW) de la Unidad de cría de animales, Instituto de investigación médica de la Universidad de Alejandría, Egipto. Los animales se mantuvieron en jaulas metálicas bajo condiciones ambientales controladas con temperatura óptima (23± 2), humedad (55±5) y ciclo luz/oscuridad (12 h), y libre acceso a una dieta de alimentación basal (Cuadro 1) y agua potable. Todos los animales se alojaron durante dos semanas antes del experimento para su aclimatación. Las ratas se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (ocho ratas cada uno); el control recibió una dieta basal normal y agua ad libitum, al grupo de IONP se le inyectó intraperitonealmente 50 mg/kg de peso corporal de IONP tres veces por semana[49], al grupo de IONP más Q25 mg se le administró la misma dosis

de IONP y se administró por sonda con 25 mg de quercetina/kg de peso corporal al día, el grupo de IONP más Q50 se administró con la misma dosis de IONP y se administró por sonda con 50 mg de quercetina/kg de peso corporal por día y el grupo de IONP más Q100 se administró con la misma dosis de IONP y se administró por sonda con 100 mg de quercetina/kg de peso corporal al día [17]. Todos los tratamientos se mantuvieron durante 30 días.

4.5. Muestreo

Al final del experimento, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 12 h y se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100 mg/kg/10 mg/kg), luego se sacrificaron y el cerebro se diseccionó inmediatamente. enjuagado con solución salina normal enfriada al 0,9 por ciento y dividido en tres partes; el primero se utilizó para análisis bioquímicos. La segunda parte se mantuvo a -80 grados para la extracción de ARNm y la evaluación de RT-PCR, mientras que la última parte se enjuagó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se fijó en paraformaldehído al 4 % disuelto en PBS durante 48 h para la fijación de la muestra.

4.6. Análisis bioquímicos

Se homogeneizaron partes de cada cerebro de rata en solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y se centrifugaron durante 10 min a 4 grados a 1435 xg. Malondialdehído (MDA), GSH, glutatión oxidado (GSSG) y creatina fosfoquinasa (CPK) se determinaron mediante los kits comerciales de Biodiagnostic Co. (Giza, Egipto). Las actividades de la enzima acetilcolinesterasa (AChE) en homogeneizados de cerebro se determinaron mediante un kit de ensayo colorimétrico (BioVision Co., Milpitas, CA, EE. UU.). Los niveles de epinefrina, serotonina y melatonina en homogeneizados de cerebro también se determinaron utilizando kits ELISA (BioVision Co., Milpitas, CA, EE. UU.).

4.7.Extracción de ARNm y RT-PCR

El ARN total se extrajo de las muestras utilizando los kits de extracción de ARN total easy-RED del fabricante (iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Corea del Sur). El cDNA de la primera hebra se logró utilizando el paquete HiSen Script cDNA (iNtRON Biotechnology, Inc.). Se usaron cebadores específicos para amplificar genes seleccionados con gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como un gen de mantenimiento estable (Tabla 2). CA, EE. UU.) y una mezcla maestra TOP real TM PreMIX SYBR Green qPCR (cat. RT 500, Enzynomics, Daejeon, Corea del Sur) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones relativas de expresión génica se evaluaron utilizando el método 2-AAct descrito por Pfaffl [50].

4.8. Examen histopatológico

Utilizando la técnica tradicional de incorporación de parafina, las muestras fijadas se deshidrataron con grados ascendentes de etanol, se aclararon en tres turnos de xileno y se terminaron mediante la inclusión de parafina a 65 °C. Las secciones de 4 um de espesor se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) [51].

Las secciones de cerebro se hidrataron a través de una serie de concentraciones de alcohol decrecientes y se colocaron en una solución de ferrocianuro de potasio al 20 por ciento con una solución de HCl al 20 por ciento durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavaron, deshidrataron, aclararon con xileno y se observaron bajo el microscopio en busca de tinción azul o contenido de hierro [52].

4.9.Examen inmunohistoquímico

Se aplicó la técnica estándar de inmunohistoquímica con peroxidasa de rábano picante (HRP) a los portaobjetos cargados positivamente de las secciones de tejido en parafina. De acuerdo con las pautas del fabricante, se usaron caspasa 3 anti-rata de conejo (Lab Vision, Fremont, CA, EE. UU.) y Bcl2 (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Secciones de cinco um de espesor del cerebro, el cerebelo, la médula espinal y el nervio ciático se desparafinaron, rehidrataron y pretrataron con peróxido de hidrógeno al 3 por ciento (H2O2) para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. La recuperación del antígeno se logró colocando los portaobjetos en un microondas durante 10 min en un tampón de citrato de sodio 10 mM (pH 6,0). Los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo primario y luego se enjuagaron con solución salina tamponada con Tris y el anticuerpo secundario. Los portaobjetos se incubaron con una solución cromógena de sustrato de 3,3/-diaminobencidina (DAB) y luego se contrastaron con hematoxilina de Mayer. Se tomaron imágenes de 10 campos diferentes con un aumento de ×400.

4.10. Análisis estadístico

Se utilizó un ANOVA unidireccional con pruebas de rango múltiple post hoc de Tukey para el análisis de datos utilizando un GraphPad Prism v.5https://www.graphpad.com/, consultado el 10 de marzo de 2021 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.) . Todas las declaraciones de importancia dependían de p<0.05. 5.="">

Las nanopartículas de óxido de hierro (IONP) inyectadas por vía intraperitoneal en una dosis de 50 mg/kg de peso corporal indujeron alteraciones oxidativas en el cerebro, mientras que la quercetina en dosis de 25, 50 y 100 mg/kg de peso corporal alivió las lesiones oxidativas cerebrales inducidas por los IONP. Por lo tanto, la quercetina es un complemento alimenticio prometedor junto con la terapia con IONP.

Referencias

1. Mazdeh, M.; Rahiminejad, ME; Nili-Ahmadabadi, A.; Ranjbar, A. Trastornos neurológicos y estrés tóxico oxidativo: un papel de las nanopartículas metálicas. Jundishapur J. Nat. Farmacia Pinchar. 2016, 11, e27628. [Referencia cruzada]

2. Fidler, MC; Walczyk, T.; Davidson, L.; Zeder, C.; Sakaguchi, N.; Juneja, LR; Hurrell, RF Un pirofosfato férrico micronizado y dispersable con una alta biodisponibilidad relativa en el hombre. Hermano J. Nutr. 2004, 91, 107–112. [Referencia cruzada]

3. Ramimoghadam, D.; Bagheri, S.; Hamid, SBA Avances en la síntesis electroquímica de nanopartículas de óxido de hierro magnético. J. magn. Magn. Mate. 2014, 368, 207–229. [Referencia cruzada]

4. Gaharwar, EE. UU.; Kumar, S.; Rajamani, P. Respuesta hematopoyética e inmunológica inducida por nanopartículas de óxido de hierro en ratas. RSC Avanzado. 2020, 10, 35753–35764. [Referencia cruzada]

5. Gaharwar, EE. UU.; Paulraj, R. Daño oxidativo inducido por nanopartículas de óxido de hierro en células sanguíneas periféricas de rata. J. Biomédica. ciencia Ing. 2015, 8, 274–286. [Referencia cruzada]

6. Feng, Q.; Liu, Y.; Huang, J.; Chen, K.; Huang, J.; Xiao, K. Captación, distribución, eliminación y toxicidad de nanopartículas de óxido de hierro con diferentes tamaños y recubrimientos. ciencia Rep. 2018, 8, 1–13. [Referencia cruzada] [PubMed]

7. Gaharwar, EE. UU.; Meena, R.; Rajamani, P. Biodistribución, aclaramiento y alteraciones morfológicas de nanopartículas de óxido de hierro administradas por vía intravenosa en ratas Wistar macho. En t. J. Nanomed. 2019, 14, 9677–9692. [Referencia cruzada] [PubMed]

8. Palmieri, B.; Sblendorio, V. Pruebas de estrés oxidativo: Visión general sobre confiabilidad y uso, Parte II. EUR. Rev.Med. Farmacol. ciencia 2007, 11, 383–399.

9. Naqvi, S.; Samim, M.; Abdin, MZ; Ahmed, FJ; Maitra, AN; Prashant, CK; Dinda, AK Toxicidad dependiente de la concentración de nanopartículas de óxido de hierro mediada por un aumento del estrés oxidativo. En t. J. Nanomed. 2010, 5, 983–989. [Referencia cruzada]

10. David, Ava; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. Resúmenes de la importancia biológica de la quercetina: un flavonoide bioactivo. Farmacogn. Rev. 2016, 10, 84–89.

11. Wu, W.; Li, R.; Li, X.; Él, J.; Jiang, S.; Liu, S.; Yang, J. La quercetina como agente antiviral inhibe la entrada del virus de la influenza A (IAV). Virus 2015, 8, 6. [Referencia cruzada]

12. Akdemir, FNE; Gülçin, ˙I.; Karagoz, B.; Soslu, R. La quercetina protege el músculo esquelético de rata de la lesión por isquemia-reperfusión. J. enzima. inhibir Medicina. química 2016, 31, 162–166. [Referencia cruzada] [PubMed]