Diferencia de glucósidos de feniletanol en Cistanches Herba de mesa de 2 huéspedes BaDiferencia de glucósidos de feniletanol en Cistanches Herba de mesa de 2 huéspedes según análisis UPLC-QQQ-MS y PLS-DA según análisis UPLC-QQQ-MS y PLS-DA

Cistanche deserticolaes una planta holoparásita perenne perteneciente a la familia Orobanchaceae. Es el tallo carnoso y seco cubierto de hojas en forma de escamas deCistanche deserticola YC Ma[1-2]. Esta planta se distribuye principalmente en Mongolia Interior, Xinjiang y Gansu, donde parasita.Haloxylon ammodendron (CA Mey.) Bunge, una planta xerofítica del desierto de Chenopodiaceae [3-4]. Los principales componentes activos deCistanche deserticolaincluyen glucósidos de feniletanoides, iridoides y polisacáridos [5-7], que exhiben propiedades como protección de la función reproductiva, antioxidación y protección del hígado [8-10]. Con más de 2000 años de uso en China, ocupa el primer lugar en prescripciones de la medicina tradicional china destinadas a fortalecer la vitalidad y el segundo en formulaciones antienvejecimiento [11]. Sin embargo, debido a la sobreexplotación y la destrucción ambiental, los recursos silvestres deCistanche deserticolaestán al borde de la extinción, lo que motivó su clasificación como planta protegida a nivel nacional (Categoría II) y su inclusión en elLista internacional de protección de plantas silvestres[12]. Para abordar el desequilibrio entre oferta y demanda en el mercado medicinal, el cultivo artificial se ha vuelto esencial para el desarrollo sostenible delCistanche deserticolaindustria.

 

 

 

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Estudios recientes han informado de la inoculación exitosa deCistanche deserticolaenAtriplex canescens[13], un arbusto de hoja perenne de la familia Chenopodiaceae. Comúnmente conocido como el "desalador biológico".Atriplex canescenses una especie de árbol de alta calidad para la mejora de suelos salinos-alcalinos [14]. CultivandoCistanche deserticolaenAtriplex canescensOfrece importantes ventajas, como un alto rendimiento y una calidad superior. En consecuencia, evaluar la calidad deAtriplex canescens-Cistanche deserticolase ha convertido en un foco de investigación [15-16]. Investigaciones anteriores se han centrado principalmente en las propiedades medicinales de los frutos secos.Cistanche deserticola, mientras que los estudios sobre los componentes activos en su forma fresca siguen siendo escasos. En particular, tras la inclusión deCistanche deserticolacomo sustancia alimenticia y medicinal según el sistema de gestión de ensayos (Aviso n.º. 9 de la Comisión Nacional de Salud, 2023), su desarrollo y utilización como hierba medicinal de doble propósito han ganado una atención significativa en el campo de la medicina tradicional china [17]. FrescoCistanche deserticolase prefiere por su excelente sabor y conveniencia, lo que lo hace muy prometedor para el desarrollo. Los materiales medicinales frescos se refieren a sustancias vegetales, animales o fúngicas frescas sin procesar con propiedades terapéuticas o que promueven la salud. Entre las 2.000 hierbas medicinales chinas de uso común, 486 son variedades frescas [18].

El método de cromatografía líquida de ultra rendimiento y espectrometría de masas en tándem de triple cuadrupolo (UPLC-QQQ-MS) es altamente sensible, lo que lo hace adecuado para detectar componentes complejos y de baja concentración [19]. Para abordar la cuestión del alto contenido de agua enCistanche deserticola, donde los glucósidos de feniletanoide son propensos a la hidrólisis enzimática, lo que resulta en un contenido reducido, un método de secado por inactivación de enzimas preserva eficazmente el contenido de glucósidos de feniletanoide [20]. Este estudio emplea UPLC-QQQ-MS para evaluar 8 glucósidos feniletanoides, incluidos el equinacósido y el acteósido, como componentes activos clave en alimentos frescos.Cistanche deserticolade dos plantas hospedantes [21-22]. El estudio examina las diferencias en el contenido de los componentes del jugo y los residuos del fresco.Cistanche deserticolacultivado en dos huéspedes. Además, el residuo se sometió a un tratamiento de inactivación de enzimas a 80 grados durante 5 minutos, seguido de secado, para comparar aún más la retención de componentes activos enCistanche deserticola. Los hallazgos tienen como objetivo proporcionar evidencia científica y respaldo técnico para el valor de doble propósito de los alimentos frescos.Cistanche deserticolay la optimización de sus técnicas de procesamiento.

1 Instrumentos y Materiales

1.1 Instrumentos

1290-6460 cromatografía líquida de ultra rendimiento: espectrómetro de masas en tándem de triple cuadrupolo (Agilent Technologies, EE. UU.).

Balanza analítica electrónica AL104 (Mettler-Toledo, Suiza).

H-2050R centrífuga (Changsha Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd.).

Limpiador ultrasónico SB25-12DTD (Ningbo Xinzhi Biological Technology Co., Ltd.).

1.2 Materiales

ElAtriplex canescens-Cistanche deserticolayHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolaSe recolectaron muestras en marzo, abril y mayo de 2024 delCistanche deserticolabase de cultivo en la ciudad de Xiquan, condado de Jingtai, provincia de Gansu. Las muestras fueron identificadas por el profesor Sun Xuegang de la Universidad Agrícola de Gansu como tallos carnosos deCistanche deserticola YC Macon hojas de escamas.

Estándares de referencia:

Echinacósido (número de lote: 23031605; pureza: 99,74%).

Acteoside (número de lote: 21102103; pureza: 98,83%).

Cistanósido A (número de lote: 23041703; pureza: 98,30%).

Isoacteosido (número de lote: 23052508; pureza: 99,90%).

2'-Acetilactósido (número de lote: 210053102; pureza: 97,12%).

Salidroside (número de lote: 22051208; pureza: 98,43%).

Cistanósido B (número de lote: 20120903; pureza: 98,57%).

Tubulosido A (número de lote: 21060302; pureza: 93,24%).

Todos fueron adquiridos en Chengdu Pfeide Biotechnology Co., Ltd.

reactivos:

Metanol (número de lote: O1140576, cromatográficamente puro).

Acetonitrilo (número de lote: S3641440, cromatográficamente puro). Ambos fueron adquiridos de Shanghai Anpu Experimental Technology Co., Ltd.

El ácido fórmico (número de lote: 20230710, cromatográficamente puro) se adquirió de Tianjin Kermio Chemical Reagent Co., Ltd.

Agua purificada (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.).

2 métodos y resultados

2.1 Métodos

2.1.1 Preparación de la muestra

tres lotes deAtriplex canescens-Cistanche deserticola(números de lote: 20240330-1, 20240420-1, 20240510-1) y tres lotes deHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticola(números de lote: 20240330-2, 20240420-2, 20240510-2), se recolectaron un total de seis lotes, con cinco plantas por lote. Las plantas se lavaron con agua.

Tratamiento:

Las muestras fueron trituradas y exprimidas, lo que dio como resultado jugo y residuos de los dos derivados del huésped.Cistanche deserticola.

Los residuos se secaron bajo dos condiciones:

Sin inactivación enzimática.

Con inactivación enzimática (5 minutos a 80 grados en horno).

Los residuos secos se almacenaron para su posterior análisis. Cada lote de material medicinal se dividió en cuatro grupos, como se muestra en la Tabla 1.

 

Tab. 1 Información de agrupación de muestra

Grupo	Tipo	Atriplex canescens-Cistanche deserticola	Haloxylon ammodendron-Cistanche deserticola
①	Residuo	C1	S1
②	Jugo	C2	S2
③	Residuo inactivado por enzimas (secado de 5 min, triturado)	C3	S3
④	Residuo no inactivado enzimáticamente (secado y triturado)	C4	S4

 

2.1.2 Condiciones cromatográficas

Columna: Columna Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 mm × 150 mm, 1,8 μm).

Caudal: 0,3 ml/min.

Volumen de inyección: 1 μL.

Temperatura de la columna: 35 grados .

Fase móvil: 0,1% de ácido fórmico en agua (A) y acetonitrilo (B).

Tiempo de análisis: 12 minutos.

gradiente de elución:

0–1,5 min: 10% → 20% B.

1,5–3 min: 20% → 30% B.

3 a 5 min: 30% → 32% B.

5 a 8 min: 32 % → 38 % B.

8–9,6 min: 38 % → 10 % B.

9,6-12 min: 10% B.

Los cromatogramas de los estándares de referencia mixtos y las muestras de prueba se muestran en la Figura 1.(Confirme si la fase móvil es ácido fórmico al 0,01% en agua (A) y acetonitrilo (B).)

Fig. 1 Cromatogramas de sustancias de referencia (A) y muestra (B) 1-salidrosida; 2-equinacósido; 3-cistanosidoA; 4-tubulosidoA; 5-actósido; 6-isoactósido; 7-2'-acetilactósido; 8-tubulosido B.

 

 

2.1.3 Condiciones de espectrometría de masas

Tipo de fuente de iones: Ionización por electropulverización (ESI).

Modo: Monitorización de reacciones múltiples (MRM) en modo de iones negativos.

Temperatura de la fuente de iones: 350 grados .

Presión del nebulizador: 35 psi.

Gas de colisión: Nitrógeno, ajustado a nivel medio.

Los parámetros de espectrometría de masas para los componentes a analizar se muestran en la Tabla 2.

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2.1.4 Preparación de la solución estándar mixta

Pesar con precisión cantidades apropiadas de los estándares de referencia.echinacósido, acteosido, cistanósido A, isoactósido, 2'-acetilactósido, salidrosida, cistanósido B, ytubulosido Ay colóquelos en frascos de reactivos de color ámbar de 10 ml. Agregue metanol al 50% para preparar una solución estándar mixta con una concentración de 0,2 mg·mL⁻¹ y guárdela para su uso posterior.

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2.1.5 Preparación de soluciones de prueba

Pesar con precisión 0,2 g de frescoAtriplex canescens-Cistanche deserticolaresiduo (C1), frescoHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolaresiduo (S1), secoAtriplex canescens-Cistanche deserticolaresiduos (C3, C4), y secadosHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolaresiduos (S3, S4). Coloque las muestras en matraces volumétricos de color ámbar de 10 ml, agregue metanol al 50%, lleve a volumen y registre la masa. Remojar durante 0,5 horas, someter a ultrasonidos durante 40 minutos (250 W, 35 kHz), enfriar a temperatura ambiente y registrar la masa nuevamente. Utilice metanol al 50% para compensar cualquier pérdida de peso, mezcle bien, centrifugue y deje que la solución se asiente. Filtrar el sobrenadante a través de una membrana microporosa de 0,22 μm para obtener el filtrado.

Para frescoAtriplex canescens-Cistanche deserticolajugo (C2) y frescoHaloxylon ammodendron-Cistanche deserticolajugo (S2), tomar 10 ml de cada uno, pesar con precisión, mezclar bien, centrifugar y dejar reposar la solución. Filtrar el sobrenadante a través de una membrana microporosa de 0,22 μm para obtener el filtrado.

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2.1.6 Estudio de linealidad

Se diluyeron cantidades apropiadas de la solución estándar mixta preparada en la sección 2.1.4 para crear un gradiente de concentración de51,2, 128,0, 320,0, 800,0, 4.000,0 y 20.000,0 ug·L⁻¹. Las muestras se inyectaron secuencialmente desde concentraciones bajas a altas siguiendo las condiciones descritas en las secciones 2.1.2 y 2.1.3. Se realizó una regresión lineal, utilizando la concentración de la inyección como eje X y el área del pico como eje Y. Las relaciones lineales de los ocho componentes se muestran en la Tabla 3.

 

Tab. 3 Resultados del examen de relación lineal de 8 componentes en la tabla Cistanches Herba

 

Componente	Ecuación de regresión	r	Rango lineal (ug·L⁻¹)
equinacósido	Y = 16.410 × X − 0.804	0.9996	51.2–20,000.0
Acteosido	Y = 102.794 × X − 55.793	0.9998	51.2–20,000.0
isoactósido	Y = 31.007 × X − 45.169	0.9999	51.2–20,000.0
2'-Acetilactósido	Y = 110.235 × X − 8.953	0.9992	51.2–20,000.0
salidrosida	Y = 19.678 × X − 0.557	0.9993	51.2–20,000.0
Tubulosido A	Y = 26.785 × X − 13.630	0.9997	51.2–20,000.0
Tubulosido B	Y = 71.810 × X − 0.993	0.9998	51.2–20,000.0
Cistanósido A	Y = 0.578 × X + 1.531	0.9994	51.2–20,000.0

 

2.1.7 Prueba de precisión

La solución estándar mixta preparada en las condiciones de la sección 2.1.4 se diluyó con metanol al 50% y se inyectó seis veces consecutivas en las condiciones de las secciones 2.1.2 y 2.1.3. Las desviaciones estándar relativas (RSD) de las áreas de pico paraechinacósido, acteosido, isoactósido, 2'-acetilactósido, salidrosida, cistanósido B, tubulosido A, ycistanósido Afueron 0,95%, 1,47%, 0,56%, 1,05%, 0,93%, 1,08%, 1,19% y 0,91%, respectivamente, lo que indica una buena precisión.

 

2.1.8 Prueba de estabilidad

Una sola muestra deCistanche deserticola(S4) se preparó en las condiciones descritas en la sección 2.1.5. La solución de prueba se inyectó y analizó a las 0, 2, 4, 8, 12 y 24 horas en las condiciones descritas en las secciones 2.1.2 y 2.1.3. Los RSD de las zonas pico deechinacósido, acteosido, isoactósido, 2'-acetilactósido, salidrosida, cistanósido B, tubulosido A, ycistanósido Afueron 1,46 %, 0,79 %, 0,95 %, 1,29 %, 1,22 %, 0,56 %, 0,49 % y 1,18 %, respectivamente, lo que indica que la solución de muestra se mantuvo estable dentro de las 24 horas.

 

2.1.9 Prueba de repetibilidad

Un solo lote deCistanche deserticolaLa muestra (S4) (número de lote: 20240420-2) se preparó en seis soluciones de prueba paralelas en las condiciones descritas en la sección 2.1.5. Las muestras fueron inyectadas y analizadas en las condiciones descritas en los apartados 2.1.2 y 2.1.3. Los RSD del contenido paraechinacósido, acteosido, isoactósido, 2'-acetilactósido, salidrosida, cistanósido B, tubulosido A, ycistanósido Afueron 1,26%, 0,98%, 1,55%, 1,06%, 1,33%, 0,99%, 1,65% y 0,95%, respectivamente, lo que demuestra una buena repetibilidad.

 

2.1.10 Prueba de recuperación

Nueve muestras del mismo lote deCistanche deserticola(S4, número de lote: 20240420-2), con 0,1 g por muestra. Las muestras se dividieron en tres grupos, con tres réplicas por grupo. Cada grupo recibió el 80%, 100% y 120% del contenido estándar de referencia en elCistanche deserticolamuestra. Las soluciones de prueba se prepararon siguiendo el método descrito en la sección 2.1.5 y se analizaron en las condiciones de las secciones 2.1.2 y 2.1.3. Se calcularon las recuperaciones de los ocho glucósidos feniletanoides y los resultados se muestran en la Tabla 4.

 

Tab. 4 Tasas de recuperación de 8 componentes probados en Cistanches Herba

 

Componente	Contenido de muestra (mg)	Enriquecido (mg)	Medido (mg)	Recuperación promedio (%)	RSD (%)
equinacósido	0.513 8	0.410 1	0.911 2	99.85	1.37
equinacósido	0.513 8	0.513 8	1.015 2	99.88	0.95
equinacósido	0.513 8	0.616 5	1.129 4	99.85	1.06
Acteosido	0.421 5	0.337 2	0.759 6	99.90	1.02
Acteosido	0.421 5	0.421 5	0.843 5	99.87	1.18
Acteosido	0.421 5	0.505 8	0.926 7	99.84	1.24
isoactósido	0.327 1	0.261 7	0.588 6	99.85	0.86
isoactósido	0.327 1	0.327 1	0.654 2	99.86	1.05
isoactósido	0.327 1	0.392 5	0.719 1	99.84	1.13
2'-Acetilactósido	0.110 2	0.088 2	0.198 3	99.87	1.15
2'-Acetilactósido	0.110 2	0.110 2	0.220 1	99.86	1.09
2'-Acetilactósido	0.110 2	0.132 2	0.242 4	99.85	1.21
salidrosida	0.081 6	0.065 3	0.146 7	99.84	1.18
salidrosida	0.081 6	0.081 6	0.163 1	99.85	1.02
salidrosida	0.081 6	0.097 9	0.179 7	99.84	1.17
Tubulosido B	0.072 3	0.057 9	0.130 0	99.86	1.09
Tubulosido B	0.072 3	0.072 3	0.144 1	99.86	1.05
Tubulosido B	0.072 3	0.086 8	0.159 2	99.84	1.24
Tubulosido A	0.043 8	0.035 0	0.078 5	99.86	1.16
Tubulosido A	0.043 8	0.043 8	0.087 5	99.86	1.02
Tubulosido A	0.043 8	0.052 5	0.096 2	99.84	1.15