Modelado de enfermedades con organoides renales Ⅱ

4. Estrategias para mejorar las plataformas organoides renales

Los organoides renales actuales exhibenestructuras relevantes para el riñónpero no se parecenriñones adultos funcionales. Por lo tanto, los protocolos descritos en la Sección2.2 dan lugar a organoides renales que carecen de un entorno biofísico similar al in vivo, incluido el flujo de fluido a través de los tejidos. Estudios recientes han mejorado el parecido de los organoides con el riñón adulto, utilizando técnicas como el trasplante y combinando diferentes tipos de organoides para lograr estructuras renales de orden superior. Estas técnicas pueden combinarse con enfoques de bioingeniería para explorar y mejorar la maduración de organoides. A continuación, destacaremos esas estrategias y discutiremos nuevas consideraciones para generar la próxima generación.sistemas organoides renales. 

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4.1. Introduciendo gradientes

Sabemos que durante la embriogénesis normal, el mesonefros, el metanefros y el UB se envían señales entre sí para modelar el riñón en desarrollo [6]. Además, los gradientes bioquímicos establecidos en el embrión temprano son esenciales para dirigir el patrón y el desarrollo adecuados del riñón [47]. Un problema importante en nuestros protocolos actuales de desarrollo de organoides renales es su aislamiento de otros tejidos corporales durante el desarrollo y, por lo tanto, la falta de gradientes bioquímicos establecidos a través de interacciones con otros sistemas de tejidos en desarrollo conjunto de un embrión. Por lo tanto, vale la pena incluir esas interacciones en el desarrollo de organoides. Taguchi y Nishinakamura (2017) y Tsujimoto et al. (2020) han considerado algunas de estas interacciones para facilitar la maduración de los organoides [17,24]. En sus estrategias, primero utilizaron factores específicos de PIM y AIM para desarrollar organoides independientes, luego trasplantaron organoides MM y UB cocultivados en ratones [17,24]. Los organoides renales desarrollados de esta manera exhibieron estructuras de orden superior, pero no pudieron recapitular una ramificación UB extensa similar a la in vivo. Si bien estos estudios subrayan la importancia del cocultivo de los tejidos vecinos, exigen la mejora del organoide a través de gradientes establecidos incluidos desde el inicio del desarrollo del organoide.

Como es casi imposible incluir todos los tejidos del embrión en desarrollo y optimizar sus condiciones, proponemos una simulación de un entorno donde las células experimentan los efectos del tejido vecino. Esto se puede lograr diseñando un gradiente bioquímico para hacer crecer células, en el que el gradiente puede imitar la presencia de tejidos vecinos. Luego, el gradiente puede dirigir los linajes AIM y PIM dentro de la misma suspensión de células y, por lo tanto, inducir la formación de UB y MM simultáneamente. Por ejemplo, podríamos establecer un gradiente de GDNF y hacer avanzar la ramificación de UB dentro del MM para inducir la formación del intrincado sistema de conductos colectores del riñón adulto.

Aunque estos enfoques basados ​​en gradientes no se han explorado para establecer organoides renales, se han utilizado para mejorar la maduración de otros organoides. Por ejemplo, Ben-Reuven y Reiner et al. (2020) incorporaron perlas liberadoras de morfógeno en un hidrogel para ayudar a modelar el eje anteroposterior de los organoides cerebrales [48]. En otro estudio, Kamperman et al. (2019) establecieron un sustrato celular con morfógenos biotinilados [49]. Además de estos enfoques estáticos, los investigadores también han desarrollado chips de microfluidos con adición de morfógenos impulsada por otros. Por ejemplo, Cui et al. (2020) utilizaron una cámara con cámaras de quimiotaxis para la distribución de morfógenos y cámaras en las que se pueden cultivar células madre en hidrogeles [50]. Por lo tanto, los investigadores pueden aplicar sistemas similares para programar el desarrollo de organoides renales utilizando factores específicos que se controlan espacialmente para mediar sus efectos. Esto establecería un gradiente e imitaría las distribuciones de morfógenos naturales relevantes para el desarrollo del riñón embrionario. Por ejemplo, se pueden sembrar perlas con factores específicos para la diferenciación de AIM y PIM en lados opuestos de un hidrogel para imitar gradientes naturales de AIM-PIM. Alternativamente, para controlar la diferenciación de hiPSC, se pueden sembrar células u organoides en dispositivos de microfluidos, de modo que las células/organoides de diferentes linajes estén en lados opuestos (consulte la Figura 5A). Se pueden cultivar HiPSC incrustadas en hidrogeles entre estas dos estructuras, lo que puede servir como fuente de factores morfogénicos. Este enfoque puede utilizarse para imitar las interacciones entre los mesonefros y metanefros, de los que carecen los protocolos actuales de organoides renales en su configuración (ver Figura 5A). Por lo tanto, el trabajo futuro debería apuntar a imitar señales bioquímicas de múltiples tipos de tejidos que son relevantes para el desarrollo del riñón, incluidos aquellos entre la UB y el MM, así como entre el riñón en desarrollo y la vasculatura. El diseño del sistema relacionado puede explorar las opciones de establecer gradientes para imitar esas interacciones.

4.2. Perfusión de organoides con microfluidos

El flujo de fluido es vital parafisiología renalya que inicia una cascada de eventos intracelulares en respuesta a la mecanodetección y facilita el transporte a través de los tejidos [51]. Por lo tanto, si deseamos generar organoides renales funcionales y mantenerlos durante períodos prolongados de tiempo, debemos integrar redes vasculares estables y perfusibles en nuestros sistemas modelo organoides. El flujo de fluido se ha introducido en los organoides renales de dos formas principales: microfluidos y trasplante. Homan et al. (2019) incluyeron señales biofísicas en un chip bioimpreso en 3D, en el que los organoides se cultivaron en una cámara con flujo de fluido dinámico [52]. Esta configuración simuló microfluidos y promovió la formación de redes vasculares, pero no recapituló la perfusión a través de estructuras vasculares y tubulares para replicar la fisiología del riñón. Sin embargo, este estudio destacó la importancia del entorno biofísico en la maduración de los organoides.

Figura 5. Mejoras propuestas a las plataformas organoides renales. (A) Enfoques para generar gradientes en los que las hiPSC pueden cultivarse para evolucionar a organoides renales. De izquierda a derecha: grupo de iPSC en hidrogel flanqueado por perlas emisoras de morfógenos, grupo de hiPSC en hidrogel flanqueado por organoides emisores de morfógenos, sistema de chip de múltiples cámaras con grupo de hiPSC cultivado en un hidrogel y expuesto bilateralmente a morfógenos de linaje NP y UB contenidos en un líquido. (B) Sistema de chip propuesto para cultivar un organoide renal junto a un canal endotelial ramificado, con seguimiento en un hidrogel (por ejemplo, matriz de colágeno). (C) Configuraciones de andamiaje propuestas, en las que se pueden cultivar y posteriormente trasplantar organoides renales. De izquierda a derecha: armazón poroso con canales endoteliales ramificados (rojo), organoides renales sembrados y perlas morfógenas sembradas (esferas rojas y azules); andamio poroso con organoides NP que rodean organoides UB

Creemos que se pueden desarrollar organoides en una plataforma de órgano en chip de microfluidos canalizados para modelar el riñón humano, como se ha realizado en otros sistemas esferoidales. Por ejemplo, a diferencia de Homan et al. (2019), quienes colocaron un organoide en una cámara de fluido, Nashimoto et al. (2017) cultivaron esferoides de fibroblastos de pulmón humano en una matriz extracelular (ECM) entre dos canales endoteliales [52,53]. Los canales dieron lugar a una red vascular perfusible formada mediante angiogénesis. Utilizando un enfoque algo similar al de Nashimoto et al. (2017), proponemos colocar un grupo de hiPSC junto a un vaso endotelial perfusible que puede integrarse en un chip, como se muestra en la Figura 5B [53]. Con la posterior adición de señales específicas del organoide del riñón en crecimiento, se puede dirigir el canal vascular para que se ramifique e invada el organoide a medida que comienza a diferenciarse. Esta configuración replicaría las primeras etapas del desarrollo renal [54]. Con una perfusión sostenida de las señales morfogenéticas necesarias para el desarrollo del riñón, los organoides renales deberían poder replicar mejor los procesos reales de formación del riñón humano. También es importante que los parámetros del sistema, como la tensión del fluido, la composición y configuración del ECM y la etapa del organoide, se consideren y optimicen cuidadosamente. Además, desde Schumacher et al. (2021) han demostrado que la hipoxia conduce a un aumento de la angiogénesis en los organoides renales; dicho sistema ex vivo puede cultivarse en presencia de una disminución de oxígeno para inducir una vascularización más eficiente [55]. En última instancia, estas estrategias deberían facilitar la maduración de los organoides, recapitular la perfusión vascular y tubular y realizar funciones fisiológicas tal como ocurren in vivo.

4.3. Avanzar en la maduración de organoides mediante trasplantes

Los estudios han indicado que el trasplante de organoides renales a un huésped, como un ratón, un huevo de gallina o una rata, puede proporcionar una ruta viable para la vascularización [16,33,56]. Sin embargo, los organoides trasplantados exhiben un éxito limitado como estructuras funcionales. Un obstáculo importante en esta estrategia es recapitular la extensa ramificación de UB dentro del MM de organoides trasplantados. Además, los segmentos de nefrona dentro de los organoides carecen de una orientación adecuada hacia un conducto colector. Estas características son esenciales para que los organoides trasplantados realicen la función de un riñón humano adulto. Además, los organoides postrasplante se integran con el huésped, lo que dificulta distinguir los límites del tejido del organoide frente al del huésped y, por lo tanto, limita el análisis específico de los organoides.

Las estrategias de ingeniería de tejidos proporcionan una amplia gama de herramientas paramejorar el desarrollo de organoides renalesen términos de maduración e integración funcional. Normalmente, los enfoques de ingeniería de tejidos emplean andamios (p. ej., andamios de fibroína de seda) en diversas configuraciones, como películas, esteras, hidrogeles y esponjas, para respaldar la disposición de las células y recapitular las diferentes señales biofísicas de los problemas deseados. Por ejemplo, en un estudio, Gupta et al. (2019) utilizaron andamios de seda porosos para cultivar organoides, seguidos del trasplante [31]. En este enfoque, el biomaterial y la configuración del andamio proporcionaron un marco para apoyar el desarrollo de organoides y conferir estabilidad tras el trasplante. Sin embargo, este sistema carecía de señales funcionales para apoyar la maduración de los organoides, como el desarrollo conjunto de la vasculatura con el compañero en proximidad a otras estructuras en desarrollo.

Los estudios futuros pueden desarrollar estrategias similares e incluir señales funcionales para apoyar la maduración de los organoides. Por ejemplo, como se describe en la Figura 5C, un andamio poroso puede configurarse con canales perfusibles y cargarse con factores morfogénicos para desarrollar un sistema de desarrollo organoide relevante mediante trasplante. La siembra previa con células endoteliales puede favorecer el desarrollo vascular dirigido, mientras que la estructura porosa abierta se puede sembrar con hiPSC y programarse mediante factores morfogenéticos para el desarrollo de organoides. Alternativamente, la matriz extracelular (MEC) secretada por los tejidos renales puede, por sí sola, servir como material de soporte para la ingeniería tisular de un organoide renal. Por ejemplo, se han utilizado riñones descelularizados para favorecer la maduración del organoide. Esas matrices podrían usarse para cultivar y trasplantar organoides o para derivar estructuras de ingeniería de tejidos a partir de esos biomateriales.

Además, los andamios presentan una oportunidad sin explotar para integrar múltiples linajes de organoides en posiciones elegidas. Por ejemplo, Taguchi y Nishinakamura (2017) y Tsujimoto et al. (2020) trasplantaron organoides UB y NP, lo que les permitió vascularizarse [17,24]; sin embargo, carecían de un andamio extracelular para orientar sus organoides de múltiples linajes. Al utilizar andamios, podríamos imitar la generación de nefronas alrededor de una única estructura colectora orientando los organoides UB en el centro y la parte inferior de un andamio. Al mismo tiempo, podemos sembrar organoides NP a lo largo del exterior (ver Figura 5C). Se pueden desarrollar enfoques similares de ingeniería de tejidos para avanzar en la maduración de organoides. Sin embargo, al diseñar un enfoque basado en la ingeniería de tejidos para trasplantar organoides, se deben seleccionar cuidadosamente parámetros como la configuración y la compatibilidad de los biomateriales, según las necesidades del riñón.

5. Conclusiones

El desarrollo de laorganoide renales un gran avance in vitromodelado de enfermedades renales. organoides renalespermitir el estudio individualizado deenfermedades genéticas del riñóny detección de drogas en una plataforma de origen humano. Si bien son muy prometedores, los organoides renales son inmaduros y están aislados en su forma actual. Para modelar verdaderamente elriñón humanoy enfermedades relacionadas, necesitamos madurarlas recapitulando las interacciones renales en desarrollo. En particular, necesitamos avanzar en las interacciones entre UB y MM in vitro e introducir vasculatura de origen humano en los organoides renales. También debemos considerar enfoques morfógenos basados ​​en gradientes para paralelos al desarrollo embrionario humano in vivo. Los organoides renales tienen un gran potencial para estudios genéticos en adultos yenfermedad renal fetaly detección de drogas. Su avance puede conducir al desarrollo de soluciones que salven vidas.nefropatíatratamientos de una manera más rápida y precisa que nunca.

Referencias

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