La disección de las respuestas de anticuerpos de sujetos vacunados con Gam-COVID-Vac sugiere la participación de epítopos externos a RBD en la neutralización del SARS-CoV-2

Abstracto: Millones de personas han sido vacunadas con Gam-COVID-Vac, pero no se han estudiado completamente las finas especificidades de los anticuerpos inducidos. Se obtuvo plasma de 12 sujetos sin experiencia previa y 10 convalecientes de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) antes y después de dos inmunizaciones con Gam-COVID-Vac. La reactividad de los anticuerpos en las muestras de plasma (n=44) ​​se estudió en un panel de proteínas del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) plegadas y desplegadas recombinantes en micromatrices y 46 péptidos que abarcan el pico. proteína (S) y por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de la subclase de inmunoglobulina G (IgG). La capacidad de los anticuerpos inducidos por Gam-COVID-Vac para inhibir la unión del dominio de unión al receptor (RBD) a su receptor, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), se investigó en un ensayo de interacción molecular (MIA). La capacidad de neutralización de virus de los anticuerpos se estudió mediante la prueba de neutralización de virus pseudotipados (pVNT) para Wuhan-Hu-1 y Omicron. Descubrimos que la vacunación Gam-COVID-Vac indujo aumentos significativos de IgG1, pero no de otras subclases de IgG contra S plegada, subunidad 1 de proteína de pico (S1), subunidad 2 de proteína de pico (S2) y RBD de manera comparable en personas sin tratamiento previo y convalecientes. asignaturas. La neutralización del virus estuvo altamente correlacionada con anticuerpos inducidos por la vacunación específicos para RBD plegado y un nuevo péptido (es decir, el péptido 12). El péptido 12 estaba ubicado cerca de RBD en la parte N-terminal de S1 y puede estar potencialmente involucrado en la transición de la conformación previa a la fusión posterior de la proteína de pico. En resumen, la vacunación Gam-COVID-Vac indujo anticuerpos IgG1 específicos de S en sujetos naive y convalecientes de manera comparable. Además de los anticuerpos específicos de RBD, los anticuerpos inducidos contra un péptido cercano al extremo N de RBD también se asociaron con la neutralización del virus.

Palabras clave: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; epítopo; anticuerpo; neutralización de virus; ensayo de interacción molecular; Omicrón

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1. Introducción

Después de los primeros casos de infección por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) a finales de 2019 en Wuhan, China, la nueva enfermedad por coronavirus (COVID-19) se propagó rápidamente por todas partes. todo el mundo y creció hasta convertirse en una pandemia global [1–4]. El rápido desarrollo de las vacunas contra la COVID-19 y la introducción de programas globales de vacunación junto con la aparición de variantes menos patógenas del SARS-CoV-2 se consideran factores importantes para la reducción de las muertes asociadas a la COVID-19- y la gravedad de la pandemia [1,5]. Las primeras vacunas que estuvieron disponibles fueron vacunas genéticas basadas en la transferencia mediada por adenovirus del gen que codifica la proteína de superficie S del SARS-CoV-2 [6–8]. La proteína S del SARS-CoV-2 consta de la subunidad S1 que contiene el dominio de unión al receptor (RBD) que se une a su receptor ACE2 en las células humanas y la subunidad S2 que asegura la unión del virus a la membrana de la célula huésped mediante la escisión proteolítica de la péptido de fusión (FP) durante la infección por el virus [9]. El gen S utilizado para la transferencia genética en determinadas vacunas basadas en adenovirus (p. ej., la vacuna COVID-19 Janssen) puede modificarse para estabilizar la proteína e influir en su escisión, pero este no es el caso de las demás [10]. Las células humanas que están infectadas por adenovirus que contienen el gen codificante S producen una cantidad variable del antígeno S que es liberado y presentado por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II a las células T, lo que da como resultado la ayuda de las células T CD4+. para la producción de anticuerpos específicos de S. La proteína S expresada por las células transfectadas también se presenta en el MHC de clase I en la superficie de la célula infectada y desencadena la activación de células T CD8+ citotóxicas específicas de S, que pueden reconocer las células productoras de antígeno S y destruirlas. El principio de vacunación, es decir, la introducción de información genética que codifica S en las células huésped y la posterior producción de antígeno S por las células infectadas, es similar al de las vacunas de ácido ribonucleico mensajero (ARNm), aunque la tecnología de transferencia de genes difiere de la de los adenovirus. vacunas a base de Por tanto, las "vacunas genéticas" imitan hasta cierto punto una infección natural por SARS-CoV-2. La identificación de epítopos reconocidos por anticuerpos de sujetos vacunados involucrados en la neutralización del virus es crucial no solo para comprender el mecanismo de acción de las vacunas existentes sino también para el desarrollo de estrategias refinadas de vacunación activa e inmunización pasiva contra COVID-19 [11 ,12]. La mayoría de las vacunas actuales se centran en obtener una respuesta de anticuerpos específicos de S con especial atención a la respuesta de anticuerpos específicos de RBD porque se ha visto que los anticuerpos específicos de RBD se correlacionan con una alta actividad neutralizante contra el SARS-CoV-2 [ 13-15]. Sin embargo, el número de mutaciones adquiridas por cada nueva variante preocupante (VOC) indica la importancia de identificar los epítopos conservados entre los VOC dirigidos por anticuerpos neutralizantes que se encuentran no solo en RBD sino también fuera de RBD [16]. De hecho, hay estudios que indican la presencia de epítopos neutralizantes fuera de RBD, que son reconocidos por los anticuerpos después de la inmunización [17-20]. En 2020, la vacuna vectorial Gam-COVID-Vac, también denominada Sputnik-V, estuvo disponible para su uso en la práctica clínica y actualmente ha sido aprobada para su uso en más de 70 países (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine / (consultado el 17 de enero de 2023)). Según el recurso Our World In Data (OWID), 79 millones de personas en Rusia recibieron al menos una inyección de la vacuna y 72 millones están completamente vacunadas (https://ourworldindata.org/covid-vaccinations?country= RUS (consultado el 22 de marzo de 2022)). Gam-COVID-Vac consta de dos tipos de vacunas, que se basan en dos vectores de adenovirus humanos diferentes (hAd26 y hAd5) que transportan la forma nativa de la proteína S de la cepa Wuhan-Hu-1 del SARS-CoV{{ 73}}. Sputnik-V consta de dos inyecciones, una con hAd26 y una segunda con hAd5 y Sputnik light, con solo hAd26. Los dos vectores de adenovirus diferentes se utilizan para la primera y la segunda inmunización para reducir la posibilidad de que los sujetos vacunados produzcan inmunidad a la proteína S contra el adenovirus. De hecho, los anticuerpos específicos de adenovirus limitarían la eficacia de las vacunas de refuerzo mediante la neutralización del vehículo vector de adenovirus. Por lo tanto, el día 21 después de la administración de la primera dosis de una vacuna con rAd26, se realiza una administración repetida de antígeno con el vector rAd5 [8,21]. Pocos estudios han investigado en un grado apreciable las respuestas de anticuerpos específicos de S y RBD y la actividad de neutralización del virus en sueros de vacunados Gam-COVID-Vac [10,22,23]. Se han informado aumentos de anticuerpos IgG específicos de RBD tres meses después de la administración de Gam-COVID-Vac y se ha demostrado que los anticuerpos reaccionan de forma cruzada con las variantes preocupantes Alfa, Beta, Delta y Omicron [24-26]. Gam-COVID-Vac también se ha comparado con otras vacunas autorizadas contra el SARS-CoV-2, que mostraron una alta neutralización del virus y una alta eficacia contra la mortalidad relacionada con la COVID-19-para Sputnik-V, aunque con una ligera inferioridad. a algunas vacunas de ARNm con respecto a la neutralización del virus [24]. Finalmente, se ha demostrado que la inmunización de pacientes positivos al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH+) tratados con terapia antirretroviral (tratados con TAR) con Gam-COVID-Vac muestra eficacia epidemiológica contra el tipo salvaje original y la variante Delta del SARS-CoV. 113}} [27]. Sin embargo, hasta ahora no se ha realizado ningún análisis detallado del reconocimiento de epítopos por parte de los anticuerpos en sujetos vacunados con Gam-COVID-Vac y se necesitan datos para comprender el isotipo de inmunoglobulina y las respuestas de la subclase de IgG en sujetos vacunados con Gam-COVID-Vac. Aquí investigamos dos grupos de sujetos que habían sido vacunados con Gam-COVID-Vac, uno que había tenido una infección previa por SARS-CoV-2 y otro grupo de sujetos que no habían recibido tratamiento previo por SARS-CoV-2. Realizamos un análisis meticuloso de la especificidad del epítopo de los anticuerpos inducidos utilizando proteínas y péptidos plegados y desplegados derivados del SARS-CoV-2-en micromatrices que abarcan la proteína S completa, incluido el RBD. Además, se analizaron las respuestas de las subclases de IgG. Nuestro estudio revela que los sujetos vacunados con Gam-COVID-Vac producen anticuerpos específicos de RBD capaces de bloquear la interacción RBD-ACE2. Curiosamente, encontramos que la neutralización del virus también se asoció con anticuerpos dirigidos contra un péptido fuera de RBD, que puede estar involucrado en la transición de la conformación pre-posfusión de la proteína de pico.

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2. Resultados

2.1. Los sujetos vacunados con la vacuna Gam-COVID incluyen sujetos convalecientes y sin tratamiento previo con COVID-19

Los sujetos convalecientes fueron infectados por la cepa Wuhan-Hu-1 según su prevalencia y los datos de secuenciación obtenidos en el momento de la infección en la región de Moscú. Los sujetos sin tratamiento previo no presentaban síntomas de COVID-19 y carecían de anticuerpos específicos del SARS-CoV-2-en el momento del reclutamiento. Los sujetos del estudio incluyeron 15 mujeres y 7 hombres con una edad promedio de 60 (es decir, 25 a 70 años) (Tabla 1).

Tabla 1. Características demográficas, clínicas y serológicas de los sujetos.

Se obtuvo una muestra de plasma de cada uno de los sujetos en el punto temporal 0 (es decir, línea base) (Figura 1A), luego cada sujeto fue vacunado con Sputnik-V con un intervalo de aproximadamente 21 días entre el primero y el segundo. inyección (puntos de tiempo 1 y 2). En el punto 3, se recogió una segunda muestra de plasma para determinar las respuestas de anticuerpos inducidas por la vacuna (Figura 1A). Los sujetos fueron observados durante 120 días adicionales. El día 110 después de la vacunación final, un sujeto (es decir, el sujeto 22) tenía COVID-19 mientras que los demás no habían desarrollado ningún síntoma de COVID-19 (Tabla 1).

Figura 1. Diseño del estudio y respuestas de anticuerpos específicos del SARS-CoV-2-antes y después de la vacunación con Sputnik-V. (A) Diseño del estudio. Se obtuvieron muestras de plasma de sujetos -19-naïve (n=12) y convalecientes (n=10) en el momento 0 (línea de base), luego los sujetos recibieron dos Sputnik-V. vacunaciones en los momentos 1 y 2, respectivamente, y se obtuvo una muestra de plasma en el momento 3 (es decir, el día 80–85 después de la primera vacunación). (B) Niveles de anticuerpos IgG específicos de la nucleocápside (eje y: ISU) en sujetos naïve y convalecientes (eje x) al inicio del estudio. La línea horizontal indica el límite de positividad. (C) Niveles de anticuerpos IgG (ejes y: ISU) específicos para RBD, S, S1 y S2 en sujetos en los puntos temporales 0 y 3 (ejes x). (D) De izquierda a derecha, niveles de anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (ejes y: valores de densidad óptica OD) hasta S (parte superior) y RBD (parte inferior) en los puntos temporales 0 y 3 ( ejes x). Se indican diferencias significativas entre grupos según lo determinado por la prueba de Wilcoxon: ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns: no significativo.

2.2. La vacunación Gam-COVID-Vac induce respuestas amplias de IgG a S, incluidas S1, RBD y S2

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Realizamos un análisis detallado de las respuestas de anticuerpos frente a un gran panel de proteínas y péptidos del SARS-CoV-2 plegados y desplegados en micromatrices que abarcan la proteína S en muestras de plasma de sujetos convalecientes y sin tratamiento previo contra el SARS-CoV-2- después de un ciclo completo de inmunizaciones con Gam-COVID-Vac (Figura 1A,B; Tabla 1). Al comparar muestras de plasma del momento 0 y del momento 3 después de la vacunación, se encontró una inducción significativa de respuestas de IgG contra RBD, S, S1 y S2 plegados pero no desplegados (Figura 1C). Tres meses después de la vacunación, los sujetos mostraron un aumento 21-veces de anticuerpos IgG específicos de RBD (p < 0.{{20}}001) y un {{ Aumento de 18}} veces de anticuerpos IgG específicos de S (es decir, punto temporal 0: mediana 0,291, punto temporal 3: mediana 5,778) (p < 0,0001), respectivamente. Los anticuerpos IgG contra S1 aumentaron 3,7-veces (p=0.0023) y los anticuerpos IgG contra S2 aumentaron 2,8-veces (p=0.0094) (Figura 1C ). La vacunación con Gam-COVID-Vac indujo principalmente respuestas IgG a S, S1 y RBD plegados de manera comparable en sujetos naïve y convalecientes (Figuras 1C, S2 y S3), lo que indica que se puede usar para estimular el SARS-CoV-2- respuestas de anticuerpos específicos también en sujetos convalecientes. Se observaron aumentos significativos de anticuerpos IgG contra RBD, S, y S1 en sujetos sin tratamiento previo y convalecientes (Figura S2) y no hubo diferencias significativas con respecto a los niveles de IgG contra RBD, S, S1 y S2 en sujetos sin tratamiento previo y convalecientes en el momento 3. (Figura S3).

2.3. La vacunación Gam-COVID-Vac induce principalmente una respuesta de subclase IgG1 a S y RBD

Se ha informado que la inmunoterapia con alérgenos específicos (AIT) induce principalmente respuestas de IgG1 e IgG4 específicas de alérgenos que difieren no sólo en cuanto a sus funciones efectoras (la IgG1 puede mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la activación del complemento, mientras que la IgG4 no tiene estas funciones efectoras) sino también con respecto a su cinética (IgG1: aparición rápida y disminución temprana: IgG4: aparición lenta pero niveles sostenidos) [28-30]. Por lo tanto, investigamos las respuestas de la subclase de IgG (es decir, IgG1-IgG4) a S y RBD en sujetos vacunados con Sputnik-V. La Figura 1D muestra que la vacunación indujo casi exclusivamente una respuesta de subclase IgG1 a S y RBD. Se encontraron aumentos significativos de los niveles de IgG1 específicos para S y RBD (p=0.0002 y p=0.0071, respectivamente) después de la vacunación. Sin embargo, no se pudieron detectar respuestas de subclases IgG2, IgG3 o IgG4 relevantes específicas para S y RBD (Figura 1D).

2.4. Inducción de anticuerpos neutralizantes de virus y anticuerpos que inhiben la interacción RBD-ACE2 mediante la vacunación Gam-COVID-Vac

Para la detección de anticuerpos neutralizantes de virus, utilizamos una prueba pVNT, en la que partículas similares a virus se pseudotiparon con proteína S de la cepa original Wuhan-Hu-1 y el VOC Omicron recientemente descrito. Se encontraron anticuerpos con actividad neutralizante para la cepa Wuhan Hu-1 en todos menos uno (es decir, el sujeto 22) de los 22 sujetos (Figura 2A, Tabla 2), mientras que los títulos de anticuerpos neutralizantes para Omicron fueron significativamente más bajos (Figura 2B) y se encontró solo en 17 de 20 sujetos (Figura 2A, Tabla 2). No se encontró neutralización relevante para los sujetos 6, 7, 10, 11, 15 (Figura 2A, Tabla 2). Los títulos de neutralización de virus para Omicron fueron 25 veces más bajos que para WT (mediana 141,9 y 5,7 para Wuhan-Hu-1 y Omicron, respectivamente) (Figura 2B).

Figura 2. Actividad neutralizante del virus en plasma 3 meses después de la vacunación con Sputnik-V y asociación con respuestas de anticuerpos IgG a RBD y péptidos derivados de S. (A) La neutralización del virus (ID50) (eje y) contra la cepa Wuhan-hu-1 (verde) y Omicron (naranja) se obtuvo con plasma de personas sin tratamiento previo (azul) y convalecientes (rojo). sujetos (ejes x). (B) Comparación de la neutralización del virus (eje y: ID50 obtenida para el plasma de los sujetos analizados, las barras representan medianas con rango intercuartil (IQR) Wuhan Hu-1 (verde) y Omicron (naranja) La línea horizontal representa los resultados obtenidos con plasma de un sujeto control sano y no infectado (control sano, HC). Las diferencias significativas entre cepas se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney: **** p < 0. {{30}}001. (C) Localización de RBD y péptidos correlacionados con la neutralización del virus en un esquema de S (S1, S2). (D) Correlaciones entre los títulos de neutralización del virus para Wuhan-Hu{{19 }} (WT) u Omicron (ejes y) y niveles de IgG específicos para RBD y péptidos derivados de picos 12, 32 y 46A (ejes x: ISU). Los símbolos azules y rojos indican sujetos sin tratamiento previo y convalecientes, respectivamente. Los asteriscos indican correlaciones significativas según la prueba no paramétrica de Spearman, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 **** p < 0,0001, ns=no significativo.

Tabla 2. Comparación de los niveles de IgG específicos para S, S1, S2 y RBD medidos mediante micromatriz con inhibiciones de la unión de RBD a ACE2 y títulos de neutralización del virus (Wuhan-Hu-1, Omicron) determinados para plasma del sujetos investigados. El mapeo de calor se realizó para cada parámetro por separado usando Excel. El nivel más alto se consideró rojo oscuro y el más bajo era blanco.

El hecho de que en todos los sujetos menos uno (es decir, el sujeto 22) los anticuerpos neutralizantes del virus aumentaron después de la vacunación indica que fueron inducidos por la vacunación (Tabla 2). El sujeto 21 ya mostró un alto bloqueo de la interacción RBD-ACE2 en MIA y una alta neutralización del virus al inicio del estudio (Tabla 2). En particular, las muestras de plasma de sujetos convalecientes vacunados con Gam-COVID-Vac que tenían una enfermedad moderada (n.° 1, 2, 17, 18, 21) tuvieron títulos de neutralización del virus más altos que las de sujetos convalecientes que tenían una enfermedad leve (n.° 22) o no tenían síntomas. (#4, 5, 7, 9) (Tablas 1 y 2). Sin embargo, un hallazgo clave fue que la inhibición de la unión de RBD a ACE2 y la neutralización del virus no siempre estaban asociadas. Una inhibición de más del 25% de la unión de RBD Wuhan Hu-1 a ACE2 ocurrió solo en 6 sujetos que también habían mostrado inhibición en la prueba de neutralización del virus debido a la vacunación (es decir, sujetos 1, 2, 3, 17, 18 y 19) (Tabla 2). Curiosamente, se observó actividad neutralizante del virus (50 % de dosis infecciosa (ID50) > 100) en 6 sujetos, aunque mostraron una inhibición deficiente o nula de la unión de RBD a ACE2 (Tabla 2: Sujetos 6, 10, 12, 13, 16, 20). .

2.5. La neutralización del virus en sujetos vacunados con Gam-COVID-Vac está fuertemente correlacionada con las respuestas de IgG a RBD y al péptido 12 derivado de S

Como se indicó anteriormente, el plasma de varios sujetos vacunados con Gam-COVID-Vac (p. ej., en los sujetos 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabla 2) mostró actividad neutralizante del virus pero no inhibió la interacción RBD-ACE2. Por lo tanto, analizamos la reactividad de los anticuerpos IgG frente a los péptidos que abarcan la proteína S mediante análisis de chips basados ​​en microarrays [13] (Figura S4 y Figura 2C) y correlacionamos las respuestas de IgG específicas de péptidos con la neutralización del virus de Wuhan-Hu. } cepa y Omicron (Figura 2D). Las respuestas de IgG a tres péptidos (es decir, péptidos 12, 32, 46A), como las respuestas de IgG a RBD plegado, se correlacionaron significativamente con la neutralización de la cepa Wuhan-Hu-1 (Figura 2C, D). El péptido 12 se destacó porque las respuestas de anticuerpos al péptido 12 desplegado (Figura S1), pero no a los péptidos 32 y 46A desplegados, fueron potenciadas significativamente por Gam-COVID Vac en sujetos sin tratamiento previo (Figura 3A) y también se correlacionaron significativamente con la neutralización de Omicron (Figura 2D). ). No se observó ningún refuerzo significativo en sujetos convalecientes con respecto a los péptidos 12, 32 o 46A (Figura 3A). La secuencia del péptido 12 está altamente conservada entre las cepas de SARS-CoV-2 (Figura 4) y reside en S1 cerca del extremo N de RBD y, por lo tanto, denota una región que puede ser relevante para la transición de la fase pre- a la conformación post-fusión de la proteína S (Figura 3B).

Figura 3. Niveles medios de anticuerpos IgG (ejes y: ISU) contra péptidos derivados de S (P12, P32, P46A) en sujetos vacunados sin tratamiento previo y convalecientes en los momentos 0 y 3 (ejes x) (A) . Se indican diferencias significativas entre grupos según lo determinado por la prueba de Wilcoxon: * p < 0.05, ns=no significativo. (F) (B) Figura 3. Niveles medios de anticuerpos IgG (ejes y: ISU) contra péptidos derivados de S (P12, P32, P46A) en sujetos vacunados sin tratamiento previo y convalecientes en los puntos temporales 0 y 3 (x -ejes) (A). Se indican diferencias significativas entre grupos según lo determinado por la prueba de Wilcoxon: * p < 0,05, ns=no significativo. (B) Visualización de los péptidos 12, 32 y 46A en la representación superficial del trímero de proteína de pico del SARS-CoV-2 (vista lateral, conformación previa a la fusión) generado con PyMOL. El péptido 12 está resaltado en el modelo de trímero S en rojo, el péptido 32 en azul y el 46A en naranja. Los carbohidratos se muestran en gris claro.

Figura 4. Alineación de la secuencia de proteínas de Wuhan-Hu-1 (arriba) y Omicron (abajo) de la proteína S del SARS-CoV-2. RBD está coloreado en amarillo claro y los péptidos 12, 22, 25, 32, 33, 46A y 47 están subrayados. La secuencia de la proteína S de Wuhan corresponde al aislado WA1 (número de acceso de GeneBank: BCN86353.1), la secuencia de la proteína S de Omicron Omicron es el clado GRA, linaje B.1.1.529 BA.1 basado en la base de datos GISAID ( https://www.gisaid.org/ (consultado el 15 de marzo de 2022)). Las sustituciones de aminoácidos están codificadas por colores según su hidropatía y propiedades de carga (rosa=hidrófobo, verde=neutro, azul claro=hidrófilo básico y rojo claro=ácido). hidrófilo).

3. Discusión

La vacuna basada en vectores Gam-COVID-Vac, también denominada Sputnik-V, fue una de las primeras vacunas contra el SARS-CoV-2 que estuvo disponible para su uso en la práctica clínica. Sin embargo, hay relativamente poca información disponible sobre las especificidades finas de las respuestas de anticuerpos en sujetos que han sido vacunados con COVID-19. En este estudio, realizamos un análisis detallado de las respuestas de anticuerpos hacia proteínas y péptidos del SARS-CoV-2 plegados y desplegados en micromatrices que abarcan la proteína S en muestras de plasma de sujetos convalecientes y sin tratamiento previo contra el SARS CoV-2-después de un ciclo completo de inmunizaciones con Gam COVID-Vac. Gam-COVID-Vac indujo principalmente respuestas de IgG1, pero ninguna otra subclase de IgG a S, S1, S2 y RBD plegados de manera comparable en sujetos naïve y convalecientes, lo que indica que se puede utilizar para estimular el SARS-CoV-2- respuestas de anticuerpos específicos también en sujetos convalecientes. Al igual que otras vacunas genéticas, la respuesta de anticuerpos inducida por Gam-COVID-Vac residía principalmente en la subclase IgG1, que tiene una vida media más corta en comparación con una respuesta de la subclase IgG4 que es más sostenible. Por ejemplo, las respuestas de la subclase específica de IgG4 se asocian con una protección a largo plazo durante la inmunoterapia con alérgenos específicos, mientras que las respuestas específicas de IgG1 se acumulan rápidamente pero desaparecen después de unos meses [28-30]. En consecuencia, serán necesarias inyecciones de refuerzo frecuentes de Gam-COVID-Vac y otras vacunas genéticas para mantener las respuestas de anticuerpos neutralizantes en un nivel alto. La vacunación con Gam-COVID-Vac induce una respuesta de anticuerpos que imita en gran medida la encontrada después de la infección natural por SARS-CoV-2 [13]. Además, las respuestas de anticuerpos después de una infección natural pertenecen principalmente a la subclase IgG1 y están dirigidas contra S, S1, S2 y RBD plegados [13]. El hallazgo novedoso e interesante de nuestro estudio fue que el plasma de varios sujetos vacunados con Gam-COVID-Vac (p. ej., en los sujetos 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabla 2) mostró actividad neutralizante del virus pero no inhibió la Interacción RBD-ACE2. Por lo tanto, analizamos la reactividad de los anticuerpos IgG frente a los péptidos que abarcan la proteína S completa mediante análisis de chips basados ​​en microarrays [13] (Figuras 2D y S4) y correlacionamos las respuestas de IgG específicas de péptidos con la neutralización del virus de Wuhan-Hu. } cepa y Omicron BA.1 (Figura 2D). Las respuestas de IgG a tres péptidos (es decir, péptidos 12, 32, 46A), como las respuestas de IgG a RBD, se correlacionaron significativamente con la neutralización de la cepa Wuhan-Hu-1 (Figura 2C, D). Sin embargo, el péptido 12 fue único porque las respuestas de anticuerpos solo al péptido 12, pero no a los péptidos 32 y 46A, fueron potenciadas significativamente por la vacunación (Figura 3A) y también se correlacionaron significativamente con la neutralización de Omicron (Figura 2D). La magnitud del refuerzo de las respuestas de IgG al péptido 12 inducido por la vacuna fue modesto pero significativo en sujetos sin tratamiento previo y bastante comparable al refuerzo de los anticuerpos IgG dirigidos a S y S1. Sin embargo, los anticuerpos IgG contra el péptido desplegado aislado (Figura S1) pueden representar solo una porción de los anticuerpos dirigidos contra el péptido 12 en la proteína plegada. Además, no sólo son importantes los niveles sino también la avidez de los anticuerpos. La secuencia de los péptidos 12 está altamente conservada entre la cepa Wuhan-Hu-1 y BA.1 Omicron VOC (Figura 4) y se deriva de una región que puede ser relevante para la transición de la fusión previa a la posfusión. conformación de la proteína S (Figura 3B). Además, la comparación de nuevas variantes mutantes de Omicron (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1), muestra que el péptido 12 (284–313 aa. ) permanece sin cambios en términos de secuencia de aminoácidos, a diferencia de, por ejemplo, el péptido 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (consultado el 28 de noviembre de 2022)). En particular, se han descrito anticuerpos monoclonales con capacidad de neutralización de virus dirigidos a la región del dominio N-terminal (NTD) de la que forma parte el péptido 12 [31], y se informó que también otras vacunas pueden inducir una respuesta de anticuerpos dirigida contra esta región. [18–20,32], lo que indica que la región definida por el péptido 12 puede ser importante para inducir anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, se puede suponer que los anticuerpos inducidos por la vacuna Gam-COVID-Vac pueden neutralizar el SARS-CoV-2 mediante dos mecanismos, uno simplemente inhibiendo la interacción RBD-ACE2 y otro dirigiéndose a la región que contiene el péptido 12 del gen S- proteína que puede estar implicada en cambios estructurales (es decir, transición de la prefusión a la conformación de fusión de S). Nuestro estudio tiene limitaciones. Por ejemplo, utilizamos un ensayo de neutralización basado en lentivirus pseudotipados, pero estos ensayos se utilizan ampliamente y son fiables [33]. También es una limitación de nuestro estudio el hecho de que los péptidos en nuestra micromatriz estaban desplegados y, por lo tanto, pueden haber identificado solo una fracción de anticuerpos neutralizantes que reconocían los péptidos desplegados, mientras que una fracción aún mayor de anticuerpos puede haberse unido a epítopos conformacionales en los epítopos conformacionales identificados. región. Además, una limitación de nuestro estudio es que analizamos sólo un pequeño número de sujetos. Sin embargo, nuestro estudio indica claramente que los anticuerpos con diferente especificidad de epítopo pueden contribuir al efecto protector de la vacuna Gam COVID-Vac. Además, el estudio muestra una respuesta a un péptido potencialmente conservado que puede usarse para crear anticuerpos ampliamente neutralizantes.

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4. Materiales y métodos

4.1. Población de estudio y declaración de ética

Se inscribieron en el estudio en diciembre de 2020 en el Instituto del Centro Nacional de Investigación de Inmunología de la Agencia Federal Médico-Biológica de Rusia (Número de ética: #12-1, 29 de diciembre de 2020). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. La infección previa por SARS-CoV-2 se confirmó mediante una prueba de PCR positiva anterior y síntomas de COVID-19 o por la presencia de anticuerpos específicos del SARS-CoV-2-dirigidos al antígeno de la nucleocápside y/o RBD y/o antígeno S como se describe [13]. Todos los sujetos fueron inmunizados por vía intramuscular con dos dosis de Sputnik-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, Moscú, Rusia) en un intervalo de tres semanas. Se obtuvieron muestras de sangre un día antes de la primera vacunación (T0, Figura 1A) y de 80 a 85 días después de la primera vacunación (T3, Figura 1A).

4.2. Detección de respuestas de anticuerpos específicos del SARS-CoV-2-

La respuesta de inmunoglobulina de sujetos naïve y convalecientes de COVID{{0}} se evaluó en muestras de plasma antes y después de la inmunización con Sputnik-V (Figura 1A). La IgG específica para un panel completo de proteínas del SARS-CoV-2 y 46 péptidos (25–30 mers) que abarcan la proteína S se midió en muestras de plasma diluidas 1:50 mediante tecnología de chip de microarrays como anteriormente descrito [13]. Las secuencias de aminoácidos, el número de aminoácidos y el peso molecular de todos los péptidos sintéticos en el chip de micromatriz se presentan en la Tabla 3. Para los péptidos 12 y 32 y RBD expresados ​​en Escherichia coli (E. coli) (desplegado) y en las células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) (plegadas) se proporcionan espectros de dicroísmo circular (CD) (Figura S1). Los péptidos 12 y 32 no revelaron ninguna estructura secundaria específica según lo determinado por dicroísmo circular (CD), como se muestra en la Figura S1. En detalle, se activaron portaobjetos de vidrio que contenían micromatrices rodeadas por un marco de epoxi (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Alemania) con un polímero orgánico complejo reactivo con amina, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA). , EE. UU.) para facilitar la unión de proteínas y péptidos. Se detectaron antígenos/péptidos del SARS-CoV-2 utilizando una concentración de 0,5 a 1 mg/ml en (Na2HPO4 75 mM, pH=8.4) por triplicado utilizando un SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, Berlín, Alemania) [13]. La expresión y purificación de proteínas y la síntesis de péptidos se describen en [13]. La reactividad de los anticuerpos IgG frente a los antígenos de los micromatrices se midió lavando primero los micromatrices durante 5 minutos con solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST) al 0,5% y secándolos mediante centrifugación utilizando una centrífuga Sigma 2–7 y MTP-11113 rotor (ambos Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Alemania). Luego se agregaron alícuotas de 35 µL de muestras de plasma diluidas 1:50 (diluyente de muestra, Thermofisher, Waltham, MA, EE. UU.) y se incubaron durante 2 h a 22 ◦C. Después de otro paso de lavado, se aplicaron 30 µL de anticuerpos secundarios (DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) IgG antihumana marcada (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE. UU.)) y se incubaron durante 30 minutos a 22 ◦ CRT. Luego, los chips se lavaron, secaron y posteriormente escanearon utilizando un escáner láser confocal (Tecan, Männedorf, Suiza). El análisis de imágenes se realizó mediante el software de análisis y adquisición de imágenes de microarrays MAPIX (Innopsys, Carbonne, Francia) y la conversión de las unidades de fluorescencia medidas a unidades estandarizadas ISAC (ISU) se realizó como se describe [13]. Los niveles de anticuerpos específicos se expresan en unidades estandarizadas ISAC (ISU). Las respuestas de anticuerpos IgG1–4 específicos de S y RBD se midieron en muestras de plasma (diluidas 1:50) por duplicado mediante ELISA como se describió anteriormente [13] con una variación de<5% for their average values.

Tabla 3. Péptidos sintéticos derivados de proteínas de pico del SARS-CoV-2 §.

4.3. Espectros de dicroísmo circular (CD) del UV lejano

Para los péptidos, P12 y P32, así como RBD expresados ​​en E. coli y células HEK293, el análisis de CD se realizó utilizando un espectropolarímetro Jasco J-180 (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japón) descrito anteriormente [34]. Los espectros CD de péptidos y proteínas (Figura S1) se midieron a una concentración de 0.1 mg/mL en NaH2PO4 10 mM (pH 8,0), que se usó para detectar los antígenos.

4.4. Ensayo de neutralización de virus basado en pseudovirus (PVT)

La actividad de neutralización de virus en muestras de plasma se determinó mediante un ensayo de neutralización de virus basado en pseudovirus como se describió anteriormente [35]. Para producir partículas similares al virus de pico (VLP) del SARS-CoV-2, se cotransfectaron células HEK293T con 3 plásmidos: el plásmido empaquetador lentiviral pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, Reino Unido), pUCHR-GFP y un Plásmido pCAGGS-S∆19 que codifica la proteína de pico del SARS-CoV-2 de tipo salvaje (idéntico a los aislados de referencia Wuhan-Hu-1 y WA1) o plásmido pCAGGS-S∆19-Om que codifica la proteína de pico Omicron del SARS-CoV-2 (amable obsequio de Andrey Gorchakov, Laboratorio de Inmunogenética, Instituto de Biología Molecular y Celular, Rama Siberiana de la Academia de Ciencias de Rusia, Novosibirsk, Rusia). Antes de su uso en pVNT, las VLP se titularon mediante dilución limitante y se incubaron durante 4 días con células HEK293T transfectadas con hACE2-. Se seleccionó para su uso en la prueba una dosis de partículas virales que dieron un 50% de células positivas a la proteína fluorescente verde (GFP). Para pVNT, todas las muestras de plasma se inactivaron térmicamente durante 30 minutos a 56 ◦C antes de su uso. El cuarto día, las células post-infección se resuspendieron y el porcentaje de células positivas para GFP se midió mediante citometría de flujo. Los valores de ID50 se calcularon utilizando una curva sigmoidal (software GraphPad Prism 9.2.0, Sigmoidal, 4PL), reconstruida por el porcentaje de neutralización en las diferentes concentraciones plasmáticas indicadas.

4.5. Ensayo de interacción molecular (MIA)

Detectar la capacidad de muestras de plasma de sujetos convalecientes o naïve de COVID{{0}} (Tabla 1), antes y después de la inmunización con Sputnik-V, para inhibir la unión de 50 ng/mL de RBD-hu-1 al receptor ACE2 se realizó un ensayo de interacción molecular (MIA) como se describe [13,36–39]. Este ensayo puede medir la inhibición de RBD marcado a ACE2 unido a placa ELISA mediante anticuerpos u otros compuestos que inhiben la interacción RBD-ACE2 [38]. En resumen, se recubrió ACE-2 recombinante (GenScript, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.) (2 µg/ml) durante la noche en placas de 96 pocillos NUNC Maxisorb (Thermofisher). Posteriormente, se realizaron tres ciclos de lavado con tampón de lavado y luego las placas se bloquearon durante 3 h a temperatura ambiente con tampón de bloqueo. Las muestras de suero se diluyeron 1:2 en PBS, Tween 20 al 0,05 %, BSA al 1 % y se preincubaron durante 2 h con 50 ng de RBD recombinante marcado con His (GenScript). Luego, las muestras de suero preincubadas se agregaron a las placas que contenían ACE-2 durante 3 h y las placas se lavaron e incubaron durante la noche con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-etiqueta His diluido 1:1000 (Dianova, Hamburgo, Alemania). . Después de 3 pasos de lavado, se añadió anticuerpo IgG1 anti-ratón ligado a HRP diluido 1:1000 (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.) durante 2 h y la detección se realizó con ABTS. Los valores medios de densidad óptica (OD) correspondientes al RBD unido se midieron a 405 nm y 492 nm (referencia) en un lector ELISA TECAN Infinite F5 con el software integrado i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suiza). El control del búfer (superposición sin RBD) se restó de cada resultado. Las determinaciones se realizaron por duplicado y los resultados se muestran como valores medios con una variación de<5%.

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4.6. Visualización de péptidos en la estructura de la proteína Spike.

La representación de superficie de la proteína de pico del SARS-CoV-2 se generó en PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, versión 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, Nueva York, NY, EE. UU.) en la entrada PDB 6XR8.

4.7. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism (versión 9.2.0 GraphPad Software, La Jolla California). Se utilizaron la prueba de Wilcoxon (Figuras 1C, D y 3A), la prueba de Mann-Whitney (Figuras 2B y S3) y la prueba de Friedman (Figura S2) para comparar entre dos o múltiples grupos. p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. La correlación entre los dos grupos se determinó mediante la prueba de rango de Spearman (Figura 2D). Se realizó una regresión no lineal normalizada utilizando el software GraphPad Prism (Sigmoidal 4PL). Los datos se presentan como mediana ± IQR. Los asteriscos indican diferencias significativas entre grupos, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns: no significativo.

5. Conclusiones

En resumen, nuestro estudio es el primero en estudiar en profundidad la especificidad del epítopo y la subclase IgG de los anticuerpos inducidos por Gam-COVID-Vac y en revelar diferentes mecanismos de neutralización del virus inducido por Gam-COVID-Vac mediante anticuerpos. En particular, obtuvimos evidencia de que los anticuerpos dirigidos a un péptido (es decir, el péptido 12) ubicado cerca pero fuera de RBD en la parte N-terminal de S1 están asociados con la neutralización del virus. La posible actividad neutralizante de virus de los anticuerpos específicos del péptido 12- puede deberse a su capacidad para interferir con la transición de la conformación previa a la posterior fusión de la proteína de pico. Sugerimos considerar la inclusión de la región definida por el péptido 12 en una forma inmunogénica en las vacunas para inducir anticuerpos contra esta área del epítopo y probar los anticuerpos inducidos por dichas vacunas para la neutralización del virus. En el caso de que se pueda mejorar la neutralización viral de las vacunas, la inclusión de un péptido inmunogénico de 12 epítopos puede mejorar la eficacia de las vacunas contra la COVID-19. Además, se puede considerar el desarrollo de anticuerpos contra el epítopo definido por el péptido 12-para la inmunización pasiva. Debido a que el epítopo definido por el péptido 12-se conserva en las variantes actualmente conocidas del SARS-CoV-2, las vacunas y los anticuerpos dirigidos al péptido 12 pueden ofrecer protección cruzada contra las variantes del SARS-CoV-2. De este modo, proporcionamos conocimientos novedosos que pueden ser útiles para el desarrollo de nuevas estrategias de vacunación activa y pasiva para COVID-19.

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