Parte 1 El equinacósido aumenta la cantidad de espermatozoides en ratas al dirigirse al receptor de andrógenos hipotalámicos

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 y Xiaoying Zhang1,2

La infertilidad masculina es un problema de salud importante con una prevalencia estimada del 4,2% de la infertilidad masculina en todo el mundo. Nuestros primeros trabajos demostraron queExtractos de cistancheproteger contra el daño de los espermatozoides en ratones y queequinacósido(ECH) es uno de los principales componentes activos. Aquí informamos de un papel esencial para la ECH, un producto natural que revierte o protege contra la aspermia oligoastéstina en ratas. La ECH se ensayó mediante HPLC, se evaluó la cantidad y calidad de los espermatozoides y se determinaron los niveles hormonales mediante ensayo de radioinmunosorbente. ECH redujo los niveles de receptores de andrógenos (AR) y genes clave relacionados con los esteroideos según lo determinado por el análisis de Western blot y qPCR. La interacción entre ECH y AR se evaluó mediante ELISA indirecto y acoplamiento molecular. Los resultados muestran que la ECH combinada con AR hipotalámica en la bolsa de Met-894 y Val-713 inhibe la transferencia de AR del citoplasma a los núcleos en el hipotálamo. Mientras que la retroalimentación negativa de la regulación de las hormonas sexuales se inhibió, la retroalimentación positiva se estimuló para aumentar la secreción de la hormona luteinizante y la testosterona, mejorando posteriormente la cantidad de esperma. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la ECH bloquea la actividad de AR en el hipotálamo para aumentar la cantidad de espermatozoides y proteger contra la oligoastenospermia en ratas.

La producción de testosterona en las células testiculares está fuertemente regulada por el eje hipotalámico-hipofisario-gonadal (HPG) mediante la formación de un bucle de retroalimentación homeostática1. La hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH), secretada por el hipotálamo, puede estimular la secreción de la hormona luteinizante (LH) de la glándula pituitaria, que estimula aún mástestosteronaproducción en células testiculares de Leydig. La testosterona es biosintetizada por una serie de enzimas esteroidogénicas. Como una de las principales vías, la proteína esteroidogénica de regulación aguda (StAR) puede transportar el colesterol de fuentes intracelulares a las mitocondrias2, donde se expone a la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol (CYP11A1), la 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD3β), la 17α-hidroxilasa (CYP17A1) y la 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD 17β) que catalizan la conversión de colesterol en testosterona3,4. La testosterona luego se retroalimenta negativamente al elemento HPG para regular a la baja una mayor secreción de LH de una manera dependiente de la dosis. El efecto de la testosterona en el bucle de retroalimentación del eje HPG se produce al unirse al receptor de andrógenos (AR), que se encuentra tanto en el hipotálamo como en la glándula pituitaria5. En los ratones, la ablación de la AR y la producción mínima de testosterona hacen que los niveles de LH y la hormona estimulante del folículo (FSH) aumenten6, lo que sugiere que la AR participa en la regulación del bucle de alimentación negativo. El mecanismo genómico clásico detestosteronaLa señalización ocurre cuando la testosterona se difunde en la célula y se une a la AR. Este complejo ligando-receptor luego se transloca al núcleo donde se une a los elementos de respuesta de andrógenos (ARE) en las regiones reguladoras de los genes sensibles a la testosterona para modificar su translocación. La testosterona también induce la vía no clásica de acción de la hormona esteroide, caracterizada por eventos rápidos que conducen a la activación de cascadas de señalización citosólicas normalmente desencadenadas por factores de crecimiento7,8. Las vías clásicas y no clásicas de testosterona contribuyen a mantener la espermatogénesis y la fertilidad. Sin embargo, la función de la AR es más importante en la vía clásica, ya que la testosterona actúa para aumentar la calidad del esperma. El equinacósido (ECH) es uno de los componentes bioactivos derivados de las especies de plantas medicinales de la equinácea9 yCistanche10. Con un amplio espectro de actividades farmacológicas, los extractos de la equinácea son 1 Centro de Investigación de Biotecnología Moderna, Escuela de Biotecnología e Ingeniería de Alimentos, Instituto de Tecnología Anyang, Anyang, Henan, 455000, China. 2 Facultad de Medicina Veterinaria, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi, 712100, China. 3Departamento de Ciencias Biomédicas, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canadá. La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a X.Z

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uno de los suplementos herbales más populares en Europa y Estados Unidos debido principalmente a sus propiedades antioxidantes11 y su capacidad para prevenir el resfriado común12. InteresantementeCistancheLos extractos y la ECH se han utilizado tradicionalmente como agente tónico para curar la disfunción reproductiva y para aumentar la actividad sexual masculina en la medicina tradicional china10. Algunos productos OTC deExtracción de cistanchese han desarrollado como suplementos nutritivos y están ganando popularidad en los mercados de alimentos saludables de China y algunos otros países asiáticos (Administración de Alimentos y Medicamentos de China)13. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de la acción de la ECH siguen sin estar claros. La infertilidad masculina es un problema de salud importante con una prevalencia estimada del 4,2% de la infertilidad masculina en todo el mundo14. El diagnóstico de la infertilidad masculina se basa actualmente en el estudio de la calidad espermática incluyendo el análisis de parámetros seminales como la concentración de espermatozoides, la motilidad y la morfología15. El bisfenol A (BPA) es un contaminante ambiental generalizado que ha sido estudiado por su impacto en la fertilidad masculina en varias especies de animales y humanos16. El BPA altera el eje hipotalámico-hipofisario-gonadal, inhibe las expresiones de enzimas esteroidogénicas testiculares y la síntesis de testosterona en las crías machos17, provocando un estado de hipogonadismo hipogonadotrópico18. En este estudio, investigamos los efectos de la ECH en la calidad del esperma y los niveles hormonales. Además, se eligió el BPA como un agente modelo de lesión espermática para estudiar más a fondo el efecto protector de la ECH contra la mala calidad del esperma.

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Resultados

ECH mejora la cantidad de espermatozoides.

El número de espermatozoides en el epidídimo de la cauda, la viabilidad de los espermatozoides y la motilidad de los espermatozoides se presentan en la Tabla 1. El tratamiento con 80 mg / kg de ECH y 15 mg / kg de propionato de testosterona (TP) aumentó significativamente los recuentos de espermatozoides epidídimos. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en la viabilidad de los espermatozoides y la motilidad de los espermatozoides.

ECH aumenta los niveles de testosterona y LH en suero, encéfalo + hipófisis y testículos.

El tratamiento con ECH aumentó notablemente los niveles de LH en el suero, encéfalo + hipófisis y testículos (Fig. 1A). En el grupo ECH(H), los niveles de LH aumentaron significativamente en 1,1 veces en suero, 1,4 veces en encéfalo + hipófisis y 1,2 veces en testículos. La testosterona aumentó significativamente en 1,5 y 1,3 veces en encéfalo + hipófisis y testículos, respectivamente, pero no en suero después del tratamiento con ECH (H). Después del tratamiento con TP, los niveles de testosterona aumentaron significativamente en 1.6, 1.8 y 1.4 veces en suero, encéfalo + hipófisis y testículos.

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ECH aumentó la expresión génica de la enzima esteroidogénica.

ECHaumentó significativamente las expresiones de enzimas esteroidogénicas clave en el testículo (Fig. 1B). Los niveles de ARNm de CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 y HSD17β en el grupo ECH(H) aumentaron más de 3 veces, mientras que los niveles de ARNm StAR no mostraron diferencias significativas con todosECHtratamientos (p>0,05). Tp no alteró significativamente la expresión de CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 y HSD17β. Esto se refleja en un análisis exhaustivo del mapa de calor del efecto de la ECH sobre la expresión de enzimas esteroidogénicas, lo que indica queECHaumentó significativamente los niveles de ARNm de CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 y HSD17β, y particularmente HSD3β1/2 (Fig. 1C).

La ECH puede cruzar la barrera hematoencefálica y, en menor medida, la barrera hematoencefálica.

Para evaluar el bucle de retroalimentación de andrógenos en el eje HPG, la capacidad deECHpara entrar en el hipotálamo se evaluó en una serie de estudios de PK.ECHse detectaron concentraciones en el hipotálamo después de 12h de administración oral única de 30 mg/kg de ECH, y la ECH mostró una marcada penetrancia del hipotálamo con una relación hipotálamo/plasma media del 33,92% (Fig. 2A). Los valores de Te T1/2 fueron de 2,61±0,42 h y 1,88±0,22 h en plasma e hipotálamo, respectivamente (Fig. 2B). Sin embargo, se detectó un acceso muy limitado de ECH en el testículo utilizando HPLC. Las concentraciones de ECH en testículos fueron de 0,083 μg/ml, 0,043 μg/ml y 0,028 μg/ml a las 0,5 h, 1h y 1,5h respectivamente, después del tratamiento.

ECH reduce la translocación hipotalámica de AR al núcleo.

Para probar el efecto deECHen la translocación ar, la expresión de AR en el citoplasma y el núcleo de testículos e hipotálamo se determinó mediante análisis de western blot. Como se muestra en la Fig. 3A, la proteína AR regulada a la baja de ECH en núcleos hipotalámicos se quintuplica en comparación con el grupo de control. El tratamiento con enzalutamida, un inhibidor de la AR, disminuyó los niveles de proteína AR en los núcleos hipotalámicos en 4,8 veces. En particular, la AR citoplasmática fue mayor con el tratamiento con ECH y el tratamiento con enzalutamida que con los controles, lo que sugiere queECHbloquea el transporte de AR desde el citoplasma hasta el núcleo en el hipotálamo. Como era de esperar, la ECH no inhibe el transporte de AR desde el citoplasma hasta el núcleo en el testículo (Fig. 3B).

ECH aumentó las expresiones de genes relacionados con el eje HPG.

ECHaumentó significativamente las expresiones de LHβ, LHR, GnRH 1 y Gnrhr en los grupos mixtos de encéfalo + hipófisis, sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles de GnRH 1 después del tratamiento con TP. El análisis del mapa de calor muestra que las expresiones de GnRH Los β 1 y LH fueron más altos entre los genes relacionados con el eje HPG.

AR es un objetivo de ECH.

Para confirmar las relaciones entre ECH y AR, se sintetizó con éxito ECH-ovoalbúmina (ECH-OVA) (Fig. 5A, B). El peso molecular de ECH-OVA es mayor que OVA, por lo que tienen diferentes tasas de movilidad (Fig. 5A), y el pico de absorbancia de ECH-OVA está entre ECH y OVA (Fig. 5B),

sugiriendo que ECH se conjugó con éxito a OVA. Los resultados indirectos de ELISA (Fig. 5C), muestran que el anticuerpo anti-AR es capaz de detectar la proteína AR presente en los pocillos que contienen ECH-OVA (indicado por el anticuerpo anti-OVA) lo que sugiere que ECH puede unirse a la proteína AR.

ECH se combina con el bolsillo AR de Met-894 y Val-713.

El compuesto ECH se acopló al sitio AF2 en la superficie del AR humano, y el modo de unión teórico de ECH y AR se mostró en la Fig. 5D. El compuesto ECH adoptó una unión de conformación compacta en la bolsa de la AR humana. Dos grupos fenilo de ECH se unen en el dominio hidrófobo de la bolsa de AR y mantuvieron estrechos contactos hidrofóbicos con los residuos Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737, Met-894 e Ile-898, mientras que los otros dos lados de ECH se colocaron en la entrada de la bolsa e hicieron solo unos pocos contactos. El análisis detallado mostró que tanto Met-894 (longitud de enlace: 2.4Å) como Val-713 (longitud de enlace: 2.7Å) formaron enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxi1 del ECH, que fue la principal interacción entre ECH y AR humana.

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ECH atenúa el daño reproductivo inducido por BPA.

Para investigar el efecto de la ECH sobre el daño reproductivo, se examinaron la calidad del esperma y los niveles de hormonas sexuales y enzimas esteroidogénicas en ratones inducidos por BPA. Como se muestra en la Fig. 6, el tratamiento con BPA disminuyó significativamente el recuento de espermatozoides y la motilidad de los espermatozoides en un 26,5% y un 39,2%, respectivamente. La administración de ECH evitó la disminución del recuento de espermatozoides y la motilidad de los espermatozoides en un 35,5% y un 30,1%, respectivamente. La administración de BPA también resultó en una disminución significativa en la secreción de LH y T, y ECH aumentó considerablemente los niveles de LH y T en un 24,1% y 18,3%, respectivamente en comparación con el tratamiento con BPA solo (Fig. 6A, B). Los niveles de ARNm de StAR, CYP17A1, 3β-HSD y 17β-HSD en el tratamiento con BPA-ECH aumentaron significativamente en comparación con el tratamiento con BPA (Fig. 6C, D).