PARTE 1 El echinacósido induce la vasorrelajación de la arteria pulmonar de la rata al abrir los canales NO-cGMP-PKG-BKCa y reducir los niveles intracelulares de Ca2 plus

¿Cómo induce el equinacósido la relajación venosa?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias de la Vida y Biofarmacéutica, Universidad Farmacéutica de Shenyang, Shenyang 110016, China; 2 Centro de Investigación de Medicina de Gran Altitud, Facultad de Medicina de la Universidad de Qinghai, Xining 810001, China; 3 Escuela de Farmacia, Universidad de Nacionalidades de Qinghai, Xining 810007, China; 4 Oficina de Cuarentena e Inspección de Entrada y Salida de Qinghai, Xining 810001, China

Apuntar:La vasoconstricción pulmonar sostenida que se experimenta a gran altura puede provocar hipertensión pulmonar (HP). El objetivo principal de este estudio es investigar el efecto vasorelajante deechinacósido(ECH), un glucósido feniletanoide de la hierba tibetana Lagotis brevituba Maxim yCistanche tubulosa, sobre la arteria pulmonar y su mecanismo potencial.

Métodos:Los anillos arteriales pulmonares obtenidos de ratas Wistar macho se suspendieron en cámaras de órganos llenas de solución de Krebs-Henseleit y se midió la tensión isométrica utilizando un transductor de fuerza. Los niveles intracelulares de Ca2 plus se midieron en células de músculo liso arterial pulmonar de rata cultivadas (PASMC) utilizando Fluo 4-AM.

Resultados: ECH(30–300 μmol/L) relajaron las arterias pulmonares de rata precontraidas por noradrenalina (NE) de una manera dependiente de la concentración, y este efecto se pudo observar tanto en el endotelio intacto como en los anillos denudados del endotelio, pero con una respuesta máxima significativamente más baja y un mayor EC50 en anillos denudados de endotelio. Este efecto fue bloqueado significativamente por L-NAME, TEA y BaCl2. Sin embargo, IMT, 4-AP y Gli no inhibieronECHrelajación inducida. En condiciones libres de Ca2 plus extracelular, la contracción máxima se redujo a 24,54 por ciento ± 2,97 por ciento y 10,60 por ciento ± 2,07 por ciento en anillos tratados con 100 y 300 μmol/L de ECH, respectivamente. En condiciones de entrada de calcio extracelular, la contracción máxima se redujo a 112,42 % ±7,30 %, 100,29 % ±8,66 % y 74,74 % ±4,95 % en anillos tratados con 30, 100 y 300 μmol/L de ECH, respectivamente. Después de cargar las células con Fluo 4-AM, la intensidad de fluorescencia media fue menor en las células tratadas conECH(100 μmol/L) que con NE.

Conclusión: ECHsuprime la contracción inducida por NE de la arteria pulmonar de rata mediante la reducción de los niveles intracelulares de Ca2 plus e induce su relajación a través de la vía NO-cGMP y la apertura de los canales K plus (BKCa y KIR).

Palabras clave:hierba tibetana;echinacósido; hipertensión pulmonar; alta altitud; vasorrelajación; NO; BKCa; Kir; anillo arterial; Células del músculo liso arterial pulmonar.

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Introducción

La vasoconstricción pulmonar sostenida que se experimenta a gran altura puede provocar hipertensión pulmonar (HP) e hipertrofia medial[1], que se han identificado como la principal causa de hipertrofia ventricular derecha e insuficiencia cardíaca[2]. Las personas que viven a gran altura, ya sea de manera temporal o permanente, pueden presentar hipertensión pulmonar de leve a moderada, y aquellos con mayor susceptibilidad a la hipoxia pueden tener una vasoconstricción pulmonar exagerada, lo que lleva a diversas enfermedades de altura que se asocian con una morbilidad y mortalidad significativas, como edema pulmonar de altura y enfermedades del corazón[3].echinacósido(ECH) (Figura 1) es unglucósido feniletanoideencontrado en una variedad de hierbas chinas como la hierba tibetana Lagotis brevituba Maxim yCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim es una especie de Lagotis spp perteneciente a Scrophulariaceae y crece ampliamente a una altitud de más de 3000 metros en la meseta de Qinghai-Tíbet.ECHtiene varias características farmacológicas deseables, como propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, neuroprotectoras, hepatoprotectoras y de eliminación de radicales libres de óxido nítrico (NO)[6]. También puede provocar la relajación dependiente del endotelio en los anillos aórticos torácicos de rata y curar enfermedades cardiovasculares [7]. Sin embargo, hasta donde sabemos, no ha habido un estudio que investigue sus efectos sobre el tono vascular en las arterias pulmonares. Los propósitos de este estudio son los siguientes: (1) explorar si ECH induce vasorrelajación in vitro en arterias pulmonares de ratas precontratadas con noradrenalina (NE), y si este efecto, si lo hay, depende del endotelio o actúa directamente sobre el músculo liso vascular. ; (2) investigar el efecto de ECH sobre la entrada de calcio extracelular y la liberación de calcio intracelular en células de músculo liso arterial pulmonar de rata (PASMC); y (3) para identificar posibles vías y canales K plus involucrados en la relajación inducida por ECH.

materiales y métodos

reactivos

ECH fue proporcionado amablemente por el Dr. Peng-fei TU de la Universidad de Pekín (Beijing, China), con una pureza de más del 98 por ciento según lo determinado por cromatografía líquida de alto rendimiento. El dimetilsulfóxido (DMSO) se adquirió de Solar Science & Technology Co, Ltd (Beijing, China); NE, acetilcolina (ACh, mayor o igual al 99 por ciento), indometacina (IMT), clorhidrato de éster metílico de Nω -nitro-L-arginina (L-NAME), cloruro de tetraetilamonio (TEA), cloruro de bario (BaCl2), {{ 9}}aminopiridina ({{10}}AP) y glibenclamida (Gli) de Sigma Chemical Co (St Louis, MO, EE. UU.); medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM), suero bovino fetal (FBS) y tripsina de Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, EE. UU.); anticuerpo de actina de músculo liso primario de ratón anti-rata (-SMA) y anticuerpo secundario de cabra anti-ratón de Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, China); indicadores de fluo calcio (Fluo 4-AM) de Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, EE. UU.); y todas las sales inorgánicas de Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Beijing, China). IMT se disolvió en DMSO y NaH2PO4 al 5 por ciento, Gli, Fluo 4-AM y ECH se disolvieron en DMSO, y todos los demás reactivos se disolvieron en solución de Krebs-Henseleit (KH) o PBS. Los experimentos preliminares mostraron que el DMSO a menos del 0,1 por ciento (v/v) no tuvo ningún efecto sobre el desarrollo de la tensión de los anillos arteriales pulmonares aislados.

animales de experimentación

Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Qinghai. Se compraron ratas Wistar macho, de 6 a 8 semanas de edad, con un peso corporal de 250 a 300 g, en el Centro Animal de la Universidad de Lanzhou (Lanzhou, China) y se mantuvieron con una dieta estándar de laboratorio y agua del grifo ad libitum a una temperatura ambiente de 22 ± 2 grados y humedad relativa de 45 por ciento a 55 por ciento a lo largo de los experimentos.

Perfusión de la arteria pulmonar in vitro

Preparación de anillos arteriales pulmonares de rata

Se anestesiaron ratas que pesaban 250-300 g mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (40 mg/kg), y luego se extrajeron sus corazones y pulmones y se sumergieron inmediatamente en una solución de KH helada que contenía (en mmol/L) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 y 11,1 glucosa (pH 7,4). Las arterias intrapulmonares (de 0,7 a 1,5 mm de diámetro) se diseccionaron para eliminar el tejido conectivo circundante y la adventicia y luego se cortaron en anillos de aproximadamente 2 a 3 mm de longitud. Los anillos se suspendieron en cámaras de órganos llenas con 10 ml de solución de KH a 37 grados y gaseadas con 95 por ciento de O2–5 por ciento de CO2 [8], y la tensión isométrica se midió usando un transductor de fuerza (JH-2, Space Medico -Instituto de Ingeniería, Pekín, China)

Evaluación de la actividad de los anillos vasculares y evaluación de la función endotelial

Se permitió que los anillos de los vasos se equilibraran durante 2 h bajo una tensión basal de 400 mg, tiempo durante el cual se cambió la solución de KH cada 15 min; luego se añadió 1 μmol/L de NE a la cámara para evaluar la actividad de cada anillo mediante la detección del porcentaje de contracción. Antes y después del protocolo experimental, se midió el porcentaje de contracción (Figura 2A y 2B). Se eliminó el endotelio en algunos anillos frotando suavemente la superficie de la íntima con un alambre fino de acero, y se evaluó cualitativamente la integridad por el grado de relajación causado por la ACh (10 μmol/L) en el porcentaje de tono contráctil inducido por NE (1 µmol/L). Si la relajación con ACh era superior al 80 por ciento, el endotelio permanecía en buenas condiciones; si la relajación era inferior al 30 por ciento, el endotelio se destruía (Figura 2A y 2B)[9].

Aislamiento y cultivo de PASMC de rata

Las arterias pulmonares distales se aislaron de los lóbulos pulmonares de ratas y el endotelio y la adventicia se extrajeron con cuidado. Después de que los tejidos se trituraron en piezas de {{0}}mm, se agregaron a los matraces inmediatamente, se mantuvieron a 37 grados y 5 por ciento de CO2 en una incubadora humidificada durante aproximadamente cuatro horas y luego se cultivaron con DMEM con alto contenido de glucosa. complementado con 20 por ciento de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 U/mL de estreptomicina durante aproximadamente cinco días. La mitad de los medios de cultivo se reemplazó con medios frescos cuando surgieron las células. Cuando las células alcanzaron el 80 % de confluencia, se recolectaron con 0,125 % de tripsina y se sembraron en matraces (proporción 1:2) que contenían DMEM con alto contenido de glucosa complementado con 10 % de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. . Se usaron células con tres a ocho pases para todos los experimentos.

Identificación de PASMC por inmunohistoquímica

Las PASMC dieron positivo para la tinción inmunoquímica cuando se observaron características típicas de "montañas y valles". Las células se sembraron en 6-placas de pocillos con cubreobjetos de vidrio. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 80 por ciento, se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento, se bloquearon con peróxido de hidrógeno al 3 por ciento durante 15 minutos y luego se incubaron con anticuerpo primario anti-SMA de ratón durante la noche a 4 grados. Después de lavarse tres veces en PBS durante 10 min, las células se incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón de cabra a temperatura ambiente durante 45 min, se lavaron nuevamente tres veces en PBS durante 10 min y se visualizaron con diaminobencidina.

Detección de la concentración de calcio intracelular en PASMC de rata

Las PASMC se sembraron en {{0}}placas de pocillos con cubreobjetos de vidrio. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 80 por ciento, los medios de cultivo se reemplazaron con DMEM sin suero. Veinticuatro horas más tarde, las células se cargaron con 7 μmol/L de Fluo 4-AM a 37 grados durante 30 min en una atmósfera humidificada de 5 por ciento de CO2. El tinte residual se lavó con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) que contenía lo siguiente (en mmol/L): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 y 5,56 D-Glucosa, sin rojo fenol. Las células cargadas con Fluo 4-AM se expusieron a una de las tres condiciones de tratamiento: (1) el grupo de control (grupo con), en el que las células se incubaron con DMEM sin suero; (2) el grupo NE, en el que las células se incubaron con DMEM sin suero suplementado con 1 μmol/L de NE durante 10 min; y (3) el grupo NE más ECH (100 μmol/L) (grupo NE más ECH100), en el que las células se incubaron con DMEM sin suero suplementado con 1 μmol/L de NE durante 10 min y 100 μmol/L de ECH durante 20 min. La intensidad de la fluorescencia se observó y fotografió mediante microscopía de fluorescencia (IX71, Olympus, Tokio, Japón) [11]. Se recolectaron seis campos de visión (200x) para cada muestra. La concentración de calcio intracelular se cuantificó midiendo la intensidad de fluorescencia media utilizando el software Image Pro-Plus 6.0.

análisis estadístico

Los datos se expresaron como la media ± DE. Cuando se evaluó una diferencia significativa apropiada mediante la prueba de Dunnett o la prueba de Student-Newman-Keuls para comparaciones múltiples después del análisis de varianza de una vía (ANOVA). Un nivel de probabilidad de P<0.05 was="" considered="">

Resultados Efectos vasorrelajantes de la ECH en arteria pulmonar aislada

Al comienzo del experimento, la adición acumulada de ECH de 30 a 300 μmol/L no tuvo un efecto significativo sobre la tensión basal de la arteria pulmonar. Después de que la vasoconstricción inducida por NE alcanzó una meseta, se agregó ECH acumulativamente (30–300 μmol/L) al endotelio intacto (E plus, Figura 2C) o anillos denudados de endotelio (E–, Figura 2C). En anillos de endotelio intactos, la adición acumulativa de ECH dilató los vasos de una manera dependiente de la concentración, con un máximo de

porcentaje de relajación máxima de 89,22 por ciento ±0,32 por ciento a 300 μmol/L y un EC50 de 51,60±0,57 μmol/L (Figura 2A y 2C). De manera similar, en los anillos sin endotelio, la ECH también dilató los vasos de una manera dependiente de la concentración, pero con una respuesta máxima significativamente menor de 67,72 por ciento ± 1,69 por ciento (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Efectos de ECH sobre la liberación de calcio intracelular y la entrada de calcio extracelular

Los anillos denudados de endotelio se expusieron a 1 μmol/L de NE hasta que se alcanzó la contracción máxima. En condiciones libres de Ca2+ extracelular, los anillos se equilibraron en una solución de KH libre de Ca2+ que contenía 0,2 mmol/L de EGTA antes del inicio de los experimentos. Después de tres lavados con solución de KH libre de Ca2 plus y EGTA, los anillos se preincubaron con ECH (30, 100 y 300 μmol/L) durante 20 min y luego se volvieron a exponer a 1 μmol/L de NE. Los anillos producidos

contracciones no sostenidas que regresaron rápidamente a la línea de base, en comparación con las contracciones iniciales inducidas por NE, que sirvió como referencia. La contracción máxima del control fue del 33,27 % ±2,94 % (Figura 3A y 3E), pero se redujo significativamente al 24,54 % ±2,97 % y al 10,60 % ±2,07 % en anillos pretratados con 100 y 300 μmol/L de ECH, respectivamente (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Papeles de diferentes inhibidores en la vasorrelajación de la arteria pulmonar de rata inducida por ECH

La vasorrelajación de la arteria pulmonar de rata inducida por ECH se investigó en presencia o ausencia de los siguientes inhibidores: L-NAME (inhibidor de eNOS), IMT (inhibidor de la ciclooxigenasa), TEA (inhibidor del canal de K plus activado por Ca2 plus de gran conductancia), BaCl2 ( rectificador de entrada K más inhibidor de canal), 4-AP (K más inhibidor de canal dependiente de voltaje) y Gli (K más inhibidor de canal sensible a ATP). Los anillos se contrajeron al máximo con 1 μmol/L de NE y luego L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) , BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) o Gli (10 μmol/L), respectivamente. Una vez que se alcanzó una nueva meseta, se agregó ECH de manera acumulativa de 30 a 300 μmol/L. Las curvas de concentración-respuesta en presencia de diferentes inhibidores se muestran en la Figura 4. El efecto vasorelajante de ECH sobre los anillos arteriales pulmonares contraídos con 1 μmol/L de NE fue bloqueado significativamente por L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) y BaCl2 (1 mmol/L), con relajaciones máximas de 64,41 % ±3,20 %, 84,38 % ±0,70 % y 75,27 % ±0,93 %, respectivamente (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identificación de PASMC de rata

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 por ciento) (Figura 6A). Los miofilamentos teñidos de marrón se observaron claramente en el citoplasma a gran aumento (Figura 6B).

Cistancheechinacósidopuede resistirapoptosis

Efecto de ECH en la concentración de calcio intracelular en PASMC de rata

NE (1 μmol/L) aumentó significativamente la concentración de calcio intracelular (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">