PRIMERA PARTE El echinacósido aumenta la cantidad de esperma en ratas al actuar sobre el receptor hipotalámico de andrógenos

¿Cómo estimula el echinacósido el estrógeno y aumenta el conteo de espermatozoides?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 y Xiaoying Zhang1,2

La infertilidad masculina es un problema de salud importante con una prevalencia estimada del 4,2 por ciento de la infertilidad masculina en todo el mundo. Nuestro trabajo inicial demostró que los extractos de Cistanche protegen contra el daño del esperma en ratones y queechinacósido(ECH) es uno de los principales componentes activos. Aquí reportamos un papel esencial paraECH, un producto natural que revierte o protege contra oligo como la aspermia en ratas.ECHse ensayó por HPLC, se evaluó la cantidad y calidad de los espermatozoides y se determinaron los niveles hormonales mediante ensayo de radioinmunoabsorción. ECH redujo los niveles del receptor de andrógenos (AR) y clavegenes relacionados con la esteroidogénesis según lo determinado por Western blot y análisis qPCR. La interacción entreECHy AR se evaluó mediante ELISA indirecto y acoplamiento molecular. Los resultados muestran que ECH combinado con AR hipotalámico en el bolsillo de Met-894 y Val-713 inhibe la transferencia de AR desdeel citoplasma a los núcleos del hipotálamo. Si bien se inhibió la retroalimentación negativa de la regulación de las hormonas sexuales, se estimuló la retroalimentación positiva para aumentar la secreción de hormona luteinizante y testosterona, aumentando posteriormente la cantidad de esperma. En conjunto, estos datos demuestranqueECHbloquea la actividad AR en el hipotálamo para aumentar la cantidad de espermatozoides y proteger contra la oligoaspermia en ratas.

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La producción de testosterona en las células testiculares está fuertemente regulada por el eje hipotálamo-pituitario-gonadal (HPG) mediante la formación de un circuito de retroalimentación homeostático1. La hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), secretada por el hipotálamo, puede estimular la secreción de hormona luteinizante (LH) de la glándula pituitaria, lo que estimula aún más la producción de testosterona en las células testiculares de Leydig. La testosterona es biosintetizada por una serie de enzimas esteroidogénicas. Como una de las vías principales, la proteína reguladora aguda esteroidogénica (StAR) puede transportar colesterol desde fuentes intracelulares a la mitocondria2, donde se expone a la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol (CYP11A1), 3 -hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD3), { {10}}hidroxilasa (CYP17A1) y 17 hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD 17 ) que catalizan la conversión de colesterol en testosterona3,4. Luego, la testosterona retroalimenta negativamente al elemento HPG para regular a la baja la secreción adicional de LH de una manera dependiente de la dosis.

El efecto de la testosterona en el circuito de retroalimentación del eje HPG ocurre al unirse al receptor de andrógenos (AR), que se encuentra tanto en el hipotálamo como en la glándula pituitaria5. En los ratones, la ablación de la AR y la producción mínima de testosterona hacen que aumenten los niveles de LH y de la hormona estimulante del folículo (FSH)6, lo que sugiere que la AR participa en la regulación del circuito de alimentación negativo. El mecanismo genómico clásico de la señalización de testosterona ocurre cuando la testosterona se difunde en la célula y se une al AR. Este complejo ligando-receptor luego se transloca al núcleo donde se une a los elementos de respuesta androgénica (ARE) en las regiones reguladoras de los genes sensibles a la testosterona para modificar su translocación. La testosterona también induce la vía no clásica de acción de las hormonas esteroides, caracterizada por eventos rápidos que conducen a la activación de cascadas de señalización citosólica normalmente desencadenadas por factores de crecimiento7,8. Las vías de testosterona clásicas y no clásicas contribuyen a mantener la espermatogénesis y la fertilidad. Sin embargo, la función del AR es más importante en la vía clásica ya que la testosterona actúa para aumentar la calidad del esperma.

equinacósido(ECH) es uno de los componentes bioactivos derivados de las especies de plantas medicinales Echinacea9 y Cistanche10. Con un amplio espectro de actividades farmacológicas, los extractos de Echinacea son uno de los suplementos herbales más populares en Europa y EE. UU. principalmente debido a sus propiedades antioxidantes11 y su capacidad para prevenir el resfriado común12. Curiosamente,Cistancheextractos yECHse han utilizado tradicionalmente como un agente tónico para curar la disfunción reproductiva y para estimular la actividad sexual masculina en la medicina tradicional china10. Algunos productos de venta libre de la extracción de Cistanche se han desarrollado como suplementos nutritivos y están ganando popularidad en los mercados de alimentos saludables de China y algunos otros países asiáticos (Administración de Alimentos y Medicamentos de China)13. Sin embargo, los mecanismos subyacentes deECHla acción sigue sin estar clara. La infertilidad masculina es un problema de salud importante con una prevalencia estimada del 4,2 por ciento de la infertilidad masculina en todo el mundo14. Actualmente, el diagnóstico de la infertilidad masculina se basa en el estudio de la calidad espermática que incluye el análisis de parámetros seminales como la concentración, motilidad y morfología espermática15. El bisfenol A (BPA), que imita a los estrógenos, es un contaminante ambiental generalizado que se ha estudiado por su impacto en la fertilidad masculina en varias especies de animales y humanos16. El BPA altera el eje hipotálamo-pituitario-gonadal, inhibe la expresión de enzimas esteroidogénicas testiculares y la síntesis de testosterona en las crías macho17, provocando un estado de hipogonadismo hipogonadotrópico18. En este estudio, investigamos los efectos deECHsobre la calidad del esperma y los niveles hormonales. Además, se eligió el BPA como agente modelo de lesión del esperma para estudiar más a fondo el efecto protector deECHcontra la mala calidad del esperma.

Resultados ECH aumenta la cantidad de esperma. El número de espermatozoides en la cola del epidídimo, la viabilidad y la motilidad de los espermatozoides se presentan en la Tabla 1. El tratamiento con 80 mg/kg de ECH y 15 mg/kg de propionato de testosterona (TP) aumentó significativamente el conteo de espermatozoides del epidídimo. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en la viabilidad y motilidad de los espermatozoides.

ECH aumenta los niveles de testosterona y LH en suero, encéfalo, hipófisis y testículos. El tratamiento con ECH aumentó notablemente los niveles de LH en suero, encéfalo más hipófisis y testículos (fig. 1A). En el grupo ECH(H), los niveles de LH aumentaron significativamente en 1.1-veces en suero, 1.4-veces en encéfalo más pituitaria y 1.2-veces en testículos. La testosterona aumentó significativamente en 1,5 y 1,3- veces en el encéfalo más la hipófisis y los testículos, respectivamente, pero no en el suero después del tratamiento con ECH(H). Después del tratamiento con TP, los niveles de testosterona aumentaron significativamente en 1.6, 1.8 y 1.4-veces en suero, encéfalo más hipófisis y testículos.

ECH increased steroidogenic enzyme gene expression. ECH significantly increased the expressions of key steroidogenic enzymes in the testis (Fig. 1B). The mRNA levels of CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2, and HSD17β in the ECH(H) group were increased more than 3-fold, while the levels of StAR mRNA showed no significant differences with all ECH treatments (p>0.05). TP no alteró significativamente la expresión de CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 y HSD17. Esto se refleja en un análisis de mapa de calor integral del efecto de ECH en la expresión de enzimas esteroidogénicas que indica que ECH aumentó significativamente los niveles de ARNm de CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 y HSD17, y en particular HSD3 1/ 2 (Fig. 1C).

La ECH puede atravesar la barrera hematoencefálica y, en menor medida, la barrera hematotesticular. Para evaluar el circuito de retroalimentación de andrógenos en el eje HPG, se evaluó la capacidad de ECH para ingresar al hipotálamo en una serie de estudios PK. Se detectaron concentraciones de ECH en el hipotálamo después de 12 horas de administración oral única de 30mg/kg de ECH, y ECH mostró una marcada penetrancia en el hipotálamo con una proporción media de hipotálamo/plasma de 33,92 por ciento (Fig. 2A). Los valores de T1/2 fueron 2,61±0,42 h y 1,88±0,22 h en plasma e hipotálamo, respectivamente (fig. 2B). Sin embargo, mediante HPLC se detectó un acceso muy limitado de ECH a los testículos. Las concentraciones de ECH en testículos fueron 0.083 ug/mL, 0.043 ug/mL y 0.028 ug/mL a las 0.5h, 1h y 1.5h respectivamente, después del tratamiento .

ECH reduce la translocación hipotalámica AR al núcleo. Para probar el efecto de ECH en la translocación de AR, se determinó la expresión de AR en el citoplasma y el núcleo de los testículos y el hipotálamo usando análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 3A, ECH reguló a la baja la proteína AR en los núcleos hipotalámicos cinco veces en comparación con el grupo de control. El tratamiento con enzalutamida, un inhibidor de AR, redujo los niveles de proteína AR en los núcleos hipotalámicos en 48-veces. En particular, la AR citoplasmática fue más alta con el tratamiento con ECH y el tratamiento con enzalutamida que con los controles, lo que sugiere que la ECH bloquea el transporte de AR desde el citoplasma al núcleo en el hipotálamo. Como era de esperar, ECH no inhibe el transporte de AR desde el citoplasma al núcleo en el testículo (Fig. 3B).

ECH aumentó las expresiones de genes relacionados con el eje HPG. ECH aumentó significativamente las expresiones de LH, LHR, GnRH 1 y Gnrhr en las mezclas de encéfalo más hipófisis; sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles de GnRH 1 después del tratamiento con TP. El análisis del mapa de calor muestra que las expresiones de GnRH 1 y LH fueron más altas entre los genes relacionados con el eje HPG.

AR es un objetivo de ECH. Para confirmar las relaciones entre ECH y AR, se sintetizó con éxito ECH-Ovoalbúmina (ECH-OVA) (Fig. 5A, B). El peso molecular de ECH-OVA es mayor que OVA, por lo que tienen diferentes tasas de movilidad (Fig. 5A), y el pico de absorbancia de ECH-OVA está entre ECH y OVA (Fig. 5B),

lo que sugiere que ECH se conjugó con éxito a OVA. Los resultados indirectos de ELISA (Fig. 5C) muestran que el anticuerpo anti-AR puede detectar la proteína AR presente en pocillos que contienen ECH-OVA (indicado por el anticuerpo anti-OVA), lo que sugiere que ECH puede unirse a la proteína AR. ECH se combina con bolsillo AR de Met-894 y Val-713. El compuesto ECH se acopló al sitio AF2 en la superficie del AR humano, y el modo de unión teórico de ECH y AR se mostró en la Fig. 5D. El compuesto ECH adoptó una unión de conformación compacta en el bolsillo del AR humano. Los dos grupos fenilo de ECH se unen al dominio hidrofóbico del bolsillo AR y mantienen estrechos contactos hidrofóbicos con los residuos Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 e Ile-898, mientras que los otros dos lados de ECH se colocaron en la entrada del bolsillo y solo hicieron algunos contactos. El análisis detallado mostró que tanto Met-894 (longitud del enlace: 2,4 Å) como Val-713 (longitud del enlace: 2,7 Å) formaron enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxi1 de la ECH, que fue la principal interacción entre la ECH y RA humana. ECH atenúa el daño reproductivo inducido por BPA. Para investigar el efecto de ECH en el daño reproductivo, se examinaron la calidad del esperma y los niveles de hormonas sexuales y enzimas esteroidogénicas en ratones inducidos con BPA. Como se muestra en la Fig. 6, el tratamiento con BPA redujo significativamente el recuento y la motilidad de los espermatozoides en un 26,5 % y un 39,2 %, respectivamente. La administración de ECH evitó la disminución del recuento y la motilidad de los espermatozoides en un 35,5 % y un 30,1 %, respectivamente. La administración de BPA también resultó en una disminución significativa en la secreción de LH y T, y ECH aumentó considerablemente los niveles de LH y T en un 24,1 por ciento y un 18,3 por ciento, respectivamente, en comparación con el tratamiento con BPA solo (Fig. 6A, B). Los niveles de ARNm de StAR, CYP17A1, 3 -HSD y 17 -HSD en el tratamiento con BPA-ECH aumentaron significativamente en comparación con el tratamiento con BPA (Fig. 6C, D).