El echinacósido estimula la proliferación celular y previene la apoptosis celular en las células MODE-K del epitelio intestinal mediante la regulación al alza de la expresión del factor de crecimiento transformante- 1

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Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo y Caigan Du

Resumen

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) se ha utilizado ampliamente como un laxante a base de hierbas en la medicina a base de hierbas para el tratamiento del síndrome del intestino irritable o el estreñimiento, yechinacoside de cistanche(ECH) es uno de los principales ingredientes bioactivos de esta hierba. Nuestro objetivo era investigar el efecto de la ECH sobre el crecimiento y la muerte de las células epiteliales intestinales. MODE-K, una línea de células epiteliales intestinales, se utilizó como modelo in vitro del intestino. La proliferación celular se midió mediante el ensayo de metil tiazol tetrazolio (MTT). La apoptosis celular se determinó con tinción con Anexina-V. Aquí mostramos que en células MODE-K cultivadas, ECH estimuló significativamente la proliferación celular y mejoró la supervivencia celular al reducir la apoptosis celular en presencia de H2O2 o la mezcla de citocinas proinflamatorias, mientras que el factor de crecimiento transformante (TGF)- 1 la expresión se reguló de manera dependiente de la dosis. La eliminación de la expresión de TGF- 1 interrumpió las actividades proliferativas y citoprotectoras de ECH, lo que se confirmó aún más mediante la neutralización de la actividad de TGF- 1 mediante el uso de anticuerpos anti-TGF- 1. Estos datos sugieren que la ECH, como uno de los ingredientes bioactivos de la C. deserticola a base de hierbas y otras, puede mejorar la reparación del tejido de la mucosa al estimular la proliferación de células epiteliales intestinales y prevenir la muerte celular a través de la regulación positiva de TGF-.

Palabras clave: Cistanche deserticola, epitelio intestinal, proliferación celular, apoptosis celular, factor de crecimiento transformante (TGF)-

Introducción

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) se conoce comúnmente como Rou Cong Rong en la medicina herbaria china, y se ha convertido en un nuevo cultivo en China debido a su uso médico (1). Su beneficio clínico ha sido reportado en el tratamiento de muchos problemas de salud incluyendo el estreñimiento crónico (2, 3) y sus efectos beneficiosos están asociados a su actividad laxante en el intestino; mejora la humectación de las heces, promoviendo el movimiento intestinal en pacientes (4, 5), así como en modelos animales (6, 7). Nuestro estudio reciente demuestra que la administración oral de un extracto acuoso de C. deserticola reduce significativamente la cantidad de hiperplasia inflamatoria en el intestino de ratones propensos al cáncer colorrectal (8).

Echinacósido de cistanche (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50 por ciento del total de PhG) aislado de C. deserticola (9) y se ha utilizado como biomarcador para el control de calidad del fármaco laxante Ronggui Tongbian Capsule (10) que contiene C. deserticola o para el control de calidad de la producción de C. deserticola cultivada (11). Se ha demostrado que la ECH es citoprotectora tanto en un modelo animal de enfermedad de Parkinson (12, 13) como en un modelo de lesión pulmonar (14) y en células de feocromocitoma cultivadas (PC12) (15, 16); y se ha demostrado que mejora la división celular de las células fibroblásticas humanas (MRC-5) (17). En este estudio, se examinó el efecto de ECH como ingrediente bioactivo principal de C. deserticola en la proliferación celular y la supervivencia en células epiteliales intestinales cultivadas para comprender la acción farmacológica de la medicina herbal que contiene C. deserticola en el tratamiento de trastornos intestinales. .

Materiales y métodos

Cultivo de células

MODE-K es una línea de células epiteliales intestinales derivadas de ratones C3H/HeJ (18) proporcionadas amablemente por el Dr. Theodore Steiner (Vancouver Coastal Health Research Institute, Vancouver, Canadá). Las células MODE-K se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 por ciento a 37 grados bajo una atmósfera de aire con CO2 al 5 por ciento.

echinacoside de cistanche (ECH) preparación

EC (echinacoside de cistanche) se purificó aún más a partir de extracto comercial de C. tubulosa (que contiene un 70 % o más de ECH, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China) mediante extracción repetida con etanol, seguida de aire- secado en una campana de humos químicos. La sustancia restante se secó adicionalmente mediante liofilización. La ECH en el producto final se confirmó mediante cromatografía líquida de alta resolución (Fig. 1).

Eliminación de la expresión del factor de crecimiento transformante (TGF)- 1

La expresión de TGF- 1 en células MODE-K fue eliminada por la expresión estable de shRNA específicamente contra la transcripción de TGF- 1 (19). En resumen, las secuencias de oligonucleótidos para la generación de ARNhc dirigido a ARNm de TGF- 1 de ratón (5′-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3′) y control no específico (codificado) (5′-AAT CGC ATA GCG TAT GCC GTT-3′) se describieron previamente (19, 20), y fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, EE. UU.). Cada secuencia se ligó en un vector pHEX-siRNA (21). Los vectores se transfectaron en células MODE-K utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. Se cultivaron células transfectadas con shRNA anti-TGF- 1 (MODE-Ktgfb) y transfectadas con shRNA codificadas (MODE-Kscr) en presencia de Zeocin (hasta 500 ug/mL) (Invitrogen-Gibco) y se seleccionaron por clasificación de células usando citometría de flujo para la proteína de fluorescencia verde (GFP). Más del 95 por ciento de las células transfectadas mostraron una fuerte fluorescencia verde en citometría de flujo o microscopía.

Ensayo de metiltiazol tetrazolio (MTT)

El ensayo MTT se usó para medir la proliferación o viabilidad celular en cultivos. Las células se sembraron a razón de 2500 por pocillo en 96-microplacas de pocillos y cada condición se probó al menos por cuadruplicado. En resumen, 10 μL de 0,5 mg/mL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Canadá) a cada pocillo y se incubaron a 37 grados durante 4 h. A continuación, los cristales de formazán de las células viables se disolvieron en 100 μl/pocillo de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich Canada). La absorbancia del color en cada pocillo se cuantificó como unidades de absorbancia (AU) a una longitud de onda de 560 nm utilizando un lector de ultramicroplacas ELx808 (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.). El porcentaje de cambio de proliferación celular en cultivos tratados con fármaco frente al control no tratado con fármaco se calculó de la siguiente manera: porcentaje=(control tratado con fármaco) / Control × 100 por ciento. La tasa de crecimiento se calculó de la siguiente manera: tasa de crecimiento (AU/día)=(AUend - AUbegin) / tiempo (día), donde el tiempo representó el período de examen, AUend representó las unidades de absorbancia al final del examen , y AU comienza representan las unidades de absorbancia al comienzo del examen.

Análisis de apoptosis por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

Se utilizó el análisis FACS con tinción de anexina-V-ficoeritrina (Anexina-V-PE) y 7-amino-actinomicina D (7-AAD) para la determinación de la apoptosis celular (positivo para anexina-V: apoptosis temprana ; 7-AAD: apoptosis tardía/necrótica) siguiendo el protocolo del fabricante (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). Por lo tanto, en el gráfico FACS, las células viables estaban en el cuadrante inferior izquierdo, las células apoptóticas tardías en el cuadrante superior izquierdo (7-AAD positivo únicamente), las células apoptóticas en el cuadrante superior derecho (tanto anexina-V como {{ 10}}AAD positivo) y células apoptóticas tempranas en el cuadrante inferior derecho (solo anexina-V positiva). En resumen, después del tratamiento, las células se liberaron mediante una incubación breve con solución de tripsina-EDTA (Sigma Aldrich Canada) y luego se incubaron con anexina-V-PE en tampón de unión 1 × durante 15 min. Después de lavarlas con PBS, las células se tiñeron con 7-AAD. La intensidad de la fluorescencia de las células apoptóticas se midió mediante citometría de flujo y se analizó en comparación con los controles de fondo mediante el software CELLQUEST (BD Biosciences) o FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EE. UU.).

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa semicuantitativa (RT-PCR)

Los niveles de ARNm de TGF{{0}} se determinaron semicuantitativamente en comparación con los de gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno utilizando kits de RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU. ) como se describió anteriormente (19). Las transcripciones de TGF- 1 y GAPDH en la misma preparación de ADNc se amplificaron mediante PCR con 35 ciclos de 94 grados durante 1 min, 57 grados durante 1 min y 15 s, y 72 grados durante 1 min y 30 s después de la inicial. paso de desnaturalización a 94 grados durante 1 min. Se añadió un paso de extensión final a 72 grados durante 10 min. Los pares de cebadores específicos para TGF- 1 y GAPDH se derivaron de un informe anterior (19) (mTGF- 1: sentido, 5′-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC y antisentido, 5 ′- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: sentido, 5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G, y antisentido, 5′-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). El producto de PCR resultante (25 μL) se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % en tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) que contenía 0,5 ug/mL de bromuro de etidio y se visualizó bajo luz ultravioleta. Los niveles de expresión de TGF- 1 se compararon semicuantitativamente con los de GAPDH.

mancha occidental

Los niveles celulares de TGF- 1 se examinaron mediante transferencia Western como se describió anteriormente (19). Las bandas de proteína TGF- 1 en la transferencia se identificaron con anti-TGF- 1 monoclonal (A75-3) (BD Biosciences). La misma transferencia se volvió a sondear utilizando anti-actina IgG (Sigma-Aldrich Canada) para confirmar la proteína cargada en cada muestra.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) Los niveles de TGF- 1 secretado en sobrenadantes de cultivo se determinaron mediante ELISA. Células MODE-K (1,8 × 105 células/pocillo en 0,5 ml de medio DMEM) en 24-placas de pocillos por triplicado se cultivaron durante la noche, seguido de incubación en ausencia o presencia de ECH(echinacoside de cistanche). Los sobrenadantes de cultivo se recolectaron después de 24 h de tratamiento y se determinó la cantidad de liberación de TGF- 1 usando el sistema de inmunoensayo TGF 1 Emax® siguiendo el protocolo del fabricante (Promega, Madison, WI, EE. UU.).

Análisis estadístico

Se usó el análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías según fuera apropiado para las comparaciones entre grupos. Se recopilaron datos de 3 a 4 experimentos individuales en cada estudio para el análisis estadístico. Un valor P menor o igual a 0.05 se consideró significativo.

Resultados

Estimulación de la proliferación celular en cultivos celulares MODE-K

La proliferación celular es esencial para la reparación de tejidos. El efecto de ECH(echinacoside de cistanche)sobre la proliferación celular se examinó en células MODE-K cultivadas. Como se muestra en la Fig. 2A, la adición de ECH estimuló la proliferación celular, medida por el aumento de la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT, de forma dependiente de la dosis. En comparación con el número de células en cultivos no tratados con fármacos, el número de células en cultivos tratados con ECH aumentó un 25,6 % ± 14,82 % en cultivos con 6,26 ug/mL de ECH, 33,6 % ± 14.0 % con 25 ug/ml de ECH, 64,4 % ± 9,0 % con 50 ug/ml de ECH y 99,4 % ± 11,7 % con 100 ug/ mL de ECH después de 48-h de incubación (P < 0.0{{50}}01).="" para="" confirmar="" aún="" más="" esta="" observación,="" se="" examinó="" el="" efecto="" de="" ech="" en="" la="" curva="" de="" crecimiento="" celular="" mode-k="" en="" un="" período="" de="" tiempo="" de="" {{30}}días.="" como="" se="" muestra="" en="" la="" fig.="" 2b,="" la="" adición="" de="" 10="" ug/ml="" optimizados="" de="" ech="" aumentó="" significativamente="" el="" número="" de="" células="" viables="" después="" del="" tiempo="" de="" incubación="" en="" comparación="" con="" los="" cultivos="" no="" tratados="" con="" fármacos="" (un="" control="" basal),="" indicado="" por="" el="" aumento="" en="" au="" para="" cultivos="" con="" ech="" desde="" 0.3{{70}}="" ±="" 0.02="" al="" comienzo="" del="" tratamiento="" con="" ech="" (0-punto="" de="" tiempo)="" hasta="" 1,49="" ±="" 0,08="" después="" de="" 2="" días="" de="" incubación="" y="" 2,20="" ±="" 0,11="" después="" de="" 4="" días="" de="" incubación,="" mientras="" que="" para="" los="" cultivos="" no="" tratados="" con="" fármacos="" (solo="" medio)="" el="" aumento="" fue="" de="" 0,24="" ±="" 0,01="" al="" principio="" a="" 1,22="" ±="" 0,12="" después="" de="" 2="" días="" y="" 1,68="" ±="" 0,11="" después="" de="" 4="" días="" (medio="" vs.="" ech,="" p="">< 0,0001).="" las="" tasas="" de="" crecimiento="" en="" estos="" dos="" cultivos,="" calculadas="" en="" base="" a="" la="" curva="" de="" crecimiento="" (fig.="" 2b),="" indicaron="" que="" ech="" mejoró="" significativamente="" las="" tasas="" de="" crecimiento="" en="" cultivos="" tanto="" en="" el="" día="" 2="" (0,56="" en="" cultivos="" tratados="" con="" ech="" frente="" a="" 0,35="" en="" controles="" no="" tratados="" con="" fármacos)="" y="" día="" 3="" (0,43="" en="" cultivos="" tratados="" con="" ech="" frente="" a="" 0,22="" en="" controles="" no="" tratados="" con="" fármacos)="" (fig.="" 2c).="" en="" conjunto,="" estos="" datos="" indican="" que="" ech="" estimula="" la="" proliferación="" celular="" en="" células="" epiteliales="" intestinales="">

Fig. 2. Estimulación del crecimiento celular en células epiteliales intestinales cultivadas por ECH. Se sembraron células MODE-K (2,500 células/pocillo) en 96-placas de pocillos durante la noche, seguido de incubación en presencia o ausencia de ECH. El número de células viables en los cultivos se midió mediante ensayo MTT. A) Los cultivos se trataron con varias concentraciones de ECH durante 48 h. El aumento (porcentaje) en el número de células en cultivos tratados con ECH se calculó en base a los cultivos no tratados con fármacos como referencia basal. P < 0,0001="" (anova="" de="" una="" vía).="" b)="" los="" cultivos="" se="" trataron="" con="" 10="" ug/ml="" de="" ech="" durante="" 4="" días.="" las="" curvas="" de="" crecimiento="" de="" los="" cultivos="" tratados="" con="" ech="" frente="" a="" los="" no="" tratados="" con="" fármacos="" (solo="" medio)="" se="" determinaron="" mediante="" las="" unidades="" de="" absorbancia="" (au)="" a="" 560="" nm="" en="" el="" ensayo="" mtt.="" p="">< 0,0001="" (medio="" frente="" a="" ech,="" anova="" de="" dos="" vías).="" los="" datos="" se="" presentan="" como="" la="" media="" ±="" derivación="" estándar="" (sd)="" de="" experimentos="" independientes.="" c)="" la="" tasa="" de="" crecimiento="" (cambio="" de="" au/día)="" se="" calculó="" en="" base="" al="" crecimiento="">e, el número medio de cada día.

Protección de las células MODE-K de la apoptosis

Proteger las células de la apoptosis es un mecanismo para prevenir un mayor daño tisular. La actividad citoprotectora de ECH(echinacoside de cistanche)se examinó en células MODE-K cultivadas estimuladas con peróxido de hidrógeno (H2O2) o una mezcla de citocinas proinflamatorias (TNF- e IFN-). El H2O2 es una especie reactiva de oxígeno generada por el metabolismo oxidativo y representa un escenario de estrés oxidativo, mientras que el TNF- y el IFN- son citoquinas prominentes producidas por células inmunitarias activadas que reflejan la situación bajo la inflamación mediada por el sistema inmunitario. Como se muestra en la Fig. 3, la adición de ECH (50 ug/mL) redujo significativamente la apoptosis, incluido su nivel basal en cultivos tratados con H2O2, evidenciado por una disminución en la apoptosis desde los niveles basales de 5,3{{47 }} por ciento ± 1,24 por ciento en cultivos no tratados con fármacos a 3,76 por ciento ± 1,01 por ciento en cultivos tratados con ECH, de 26,93 por ciento ± 1,86 por ciento en cultivos no tratados con fármacos a 14,08 por ciento ± 1,30 % en cultivos tratados con ECH en presencia de 0,3 μM de H2O2, y de 38,90 % ± 1,76 % en cultivos no tratados con fármacos a 19,88 % ± 1,02 % en cultivos tratados con ECH en presencia de 0,6 μM de H2O2 (P < 0,0001="" ,="" medio/tratado="" sin="" fármaco="" frente="" a="" tratado="" con="" ech).="" se="" observó="" un="" efecto="" citoprotector="" similar="" de="" ech="" en="" los="" cultivos="" estimulados="" con="" la="" mezcla="" de="" citoquinas="" (fig.="" 4);="" la="" apoptosis="" (51,5="" por="" ciento="" ±="" 6,30="" por="" ciento)="" en="" cultivos="" sin="" la="" adición="" de="" ech="" (controles="" medios/no="" tratados="" con="" fármacos)="" fue="" significativamente="" mayor="" que="" (38,50="" por="" ciento="" ±="" 5,60="" por="" ciento)="" en="" cultivos="" tratados="" con="" ech="" (p="0.0204," medio/no="" tratado="" con="" fármacos="" frente="" a="" tratado="" con="" ech),="" lo="" que="" sugiere="" que="" ech="" protegió="" a="" las="" células="" mode-k="" de="" la="" apoptosis="" inducida="" por="" citocinas="" proinflamatorias.="" en="" conjunto,="" ech="" tiene="" actividad="" citoprotectora="" contra="" la="" apoptosis="" celular="" inducida="" por="" la="" oxidación="" de="" h2o2,="" así="" como="" la="" citotoxicidad="" de="" las="" citocinas="">

Regulación positiva de la expresión de TGF- en células MODE-K cultivadas

La evidencia en la literatura sugiere que el TGF- 1 juega un papel importante en la lesión y reparación de tejidos (22, 23) y en la recuperación del tracto gastrointestinal de colitis o enfermedad inflamatoria intestinal (24). Para examinar si TGF- 1 juega un papel en la proliferación celular inducida por ECH y la citoprotección en células epiteliales intestinales cultivadas como se demostró anteriormente, el efecto de ECH(echinacoside de cistanche)Se examinó la expresión de TGF{{0}} en células MODE-K cultivadas. Los niveles de transcripción de TGF- 1 se examinaron mediante RT-PCR semicuantitativa, mientras que sus niveles de proteína se determinaron mediante transferencia Western (niveles celulares totales) o mediante ELISA (niveles de proteína secretada). Como se muestra en la Fig. 5A, la regulación al alza dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de TGF- 1 se observó en cultivos tratados con ECH tanto a las 24 como a las 48 h después de la adición de ECH. Una tendencia similar de aumento en los niveles de proteína TGF{{10}} dentro de las células se demostró mediante análisis de transferencia Western (Fig. 5B). Después de 24-h de incubación en 0,5 ml de medio de cultivo que contenía varias concentraciones de ECH, los niveles secretados de TGF- 1 también aumentaron de manera independiente de la dosis; de 186,4 ± 18,39 pg/mL en cultivos no tratados con fármacos (niveles basales) a 186,4 ± 18,39 pg/mL en cultivos con 25 ug/mL de ECH, 263,4 ± 14,14 pg/mL con 50 ug/mL de ECH y 266,4 ± 15,56 pg/mL con 100 ug/mL de ECH (P < 0,0001).="" todos="" estos="" datos="" indican="" claramente="" que="" ech="" aumenta="" la="" producción="" de="" tgf-="" 1="" en="" células="" epiteliales="" intestinales="" en="">

Pérdida de estimulación del crecimiento y citoprotección de echinacósido por eliminación genética de la expresión de TGF- 1

Para aclarar si TGF- 1 contribuyó a la estimulación del crecimiento y la reducción de la apoptosis en ECH(echinacoside de cistanche)-Células tratadas, la expresión de TGF- 1 en células MODE-K se anuló mediante la expresión estable de shRNA anti-TGF- 1, por lo que se generó una nueva línea celular MODE-Ktgfb. La expresión de la proteína TGF- 1 se redujo en gran medida en las células MODE-Ktgfb en comparación con las células MODE-Kscr que expresaban de manera estable shRNA codificado (Fig. 6A). Como se muestra en la Fig. 6B, la estimulación proliferativa de ECH se vio significativamente afectada en las células MODE-Ktgfb; similar a la respuesta proliferativa a ECH en células MODE-K parentales (Fig. 2), el número de células viables aumentó en células MODE-Kscr después de la estimulación con ECH, 28,3 por ciento ± 12,4 por ciento de aumento en cultivos con 25 ug/mL de ECH, 54,2 por ciento ± 6,8 por ciento de aumento con 5{{30}} ug/mL de ECH, y 122,7 por ciento ± 20,8 por ciento de aumento en cultivos con 100 ug/mL de ECH. Por el contrario, el número de células disminuyó en presencia de ECH en cultivos de células MODE Ktgfb, 12,0 por ciento ± 5,0 por ciento de disminución en cultivos con 25 ug/mL de ECH, 18,3 por ciento ± 4,1 por ciento de disminución con 50 ug/mL de ECH, y 30.4 por ciento ± 3.3 por ciento disminuyó con 100 ug/mL de ECH. El análisis estadístico con ANOVA de dos vías indicó la diferencia significativa de respuesta proliferativa a ECH entre estos dos grupos (P < 0,0001).="" estos="" datos="" sugieren="" que="" la="" pérdida="" de="" expresión="" de="" tgf-="" 1="" en="" las="" células="" epiteliales="" intestinales="" perjudica="" la="" estimulación="" del="" crecimiento="" de="">

Para examinar más a fondo si la expresión TGF- 1 regulada al alza en ECH(echinacoside de cistanche)Las células tratadas dieron como resultado una reducción de la apoptosis, la actividad antiapoptótica de ECH se examinó en células MODE-Ktgfb frente a células MODE-Kscr. Como se muestra en la Fig. 6C, en comparación con los cultivos de células MODE-Kscr, los niveles de apoptosis fueron más altos en los cultivos de células MODE-Ktgfb en ausencia de citocinas (11,2 por ciento ± 0,42 por ciento en MODE-Ktgfb frente a .9.6 por ciento ± 0.99 por ciento en MODE-Kscr) y en presencia de citoquinas (20.95 por ciento ± 0.07 por ciento en MODE- Ktgfb frente a 15,4 por ciento ± 1,56 por ciento en MODE-Kscr) (P=0.0{{60}}13), lo que sugiere que TGF- 1 es un anti -factor apoptótico en células MODE K. La adición de ECH (50 ug/mL) a los cultivos de células MODE-Kscr redujo significativamente los niveles basales de apoptosis (9,6 % ± 0,99 % en pacientes sin tratamiento con fármacos frente a 8,3 % ± 0,43 % en los tratados con ECH) y se encontró un 30,2 % de reducción de la apoptosis en cultivos estimulados con citocinas (15,4 % ± 1,56 % en los tratados sin fármacos frente a 10,75 % ± 1,05 % en los tratados con ECH). Sin embargo, en cultivos celulares MODE-Ktgfb, ECH no redujo los niveles basales de apoptosis (11,2 % ± 0,42 % en los tratados sin fármacos frente a 12,0 % ± 0,43 % en los tratados con ECH) y solo redujo el 16,71 % de la apoptosis, en comparación con El 30,2 % en cultivos celulares MODE-Kscr se observó en cultivos estimulados con citocinas (20,95 % ± 0,07 % en los tratados sin fármacos frente al 17,45 % ± 0,35 % en los tratados con ECH). Estos datos indican que la caída de la expresión de TGF- 1 en las células epiteliales intestinales empeora la apoptosis y disminuye la actividad citoprotectora de ECH.

Pérdida de estimulación del crecimiento y citoprotección de ECH(echinacoside de cistanche)por neutralización de la actividad de TGF- 1 usando anticuerpos

Para confirmar aún más que TGF- 1 podría ser necesario para la estimulación del crecimiento y la citoprotección de ECH(echinacoside de cistanche)en células epiteliales intestinales como se describió anteriormente (Fig. 6), el efecto de neutralizar el anticuerpo anti-TGF- 1 (Clon 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, EE. UU.) en ECH mediada por la proliferación celular y la supervivencia se examinaron en cultivos celulares MODE-K. Como se muestra en la Fig. 7A, la adición de ECH (25 ug/ml) estimuló un aumento del 44,3 % ± 8,2 % en el número de células en los controles no tratados con anticuerpos, pero en presencia de anticuerpos anti-TGF- 1 , 11,3 por ciento ± 9,10 por ciento de pérdida en el número de células se observó en los mismos cultivos tratados con ECH, lo que sugiere que la actividad neutralizante de TGF- 1 disminuyó la estimulación del crecimiento de ECH en las células epiteliales intestinales. Los experimentos posteriores demostraron que el anticuerpo anti-TGF- 1 también neutralizaba la actividad citoprotectora de ECH en cultivos de células MODE-K; la adición de ECH disminuyó la apoptosis del 4,37 % ± 1,19 % en cultivos no tratados con fármacos al 1,72 % ± {{50}},01 % en cultivos tratados con ECH después de 24 h de incubación y del 11,13 % ± 1,12 por ciento en cultivos no tratados con fármaco a 9,13 por ciento ± 0,02 por ciento en cultivos tratados con ECH después de 48 h de incubación (sin fármaco/medio frente a ECH, ANOVA bidireccional, P=0,0001). Sin embargo, en presencia de anticuerpos anti-TGF- 1, la apoptosis en cultivos tratados con ECH (2,88 % ± 0,01 % después de 24-h de incubación; 12,58 % ± 0,02 % después de 48-h de incubación ) no fue significativamente diferente de aquellos en cultivos de control (no tratados con fármacos) (ANOVA de dos vías, P=0.9427), lo que implica que el anticuerpo anti-TGF- 1 interfiere con la supervivencia mediada por ECH en intestino células epiteliales.

Discusión

ECH(echinacoside de cistanche)no es solo un importante PhG en el extracto de hierbas Cistanche spp. pero también se encuentra en muchas otras plantas medicinales como Echinacea spp. (25, 26). Se ha informado que este compuesto natural tiene actividad antioxidante in vitro e in vivo (13, 27, 28). Sin embargo, el(los) mecanismo(s) de su acción siguen siendo desconocidos. Nuestros resultados del presente estudio demuestran por primera vez en un modelo in vitro que ECH estimula la proliferación y supervivencia de células epiteliales intestinales, que depende de TGF- 1.

La adición de ECH(echinacoside de cistanche)reduce la apoptosis celular en células MODE-K tratadas con H2O2- o mezcla de citoquinas proinflamatorias (TNF- e IFN-) (Figs. 3 y 4) y también en otros tipos de células (16, 29), y La eliminación de la expresión de TGF- 1 o el bloqueo de su actividad da como resultado la supresión de su actividad antiapoptótica (Figs. 6 y 7), lo que indica que la citoprotección de ECH depende de la producción de TGF- 1 (Fig. 5). Nuestro estudio anterior ha demostrado que TGF- 1 induce la expresión antiapoptótica de Bcl-2 y previene la apoptosis mediada por TNF en células epiteliales tubulares renales (19). Se han informado hallazgos similares en otros tipos de células; la adición de TGF- 1 en células endoteliales de arteria pulmonar cultivadas aumenta el nivel inicial de Bcl-2 y previene la apoptosis inducida por la privación de suero y el bloqueo del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (30); y en células progenitoras neurales cultivadas (NPC), mejora (en aproximadamente un 76 por ciento) la supervivencia celular frente al tratamiento con H2O2, lo que se correlaciona con la regulación positiva de la expresión de Bcl-2 (31). Aunque el efecto de ECH en la expresión de Bcl-2 en células MODE-K no se examina en este estudio, se ha informado la correlación de la regulación positiva de Bcl-2 con la actividad antiapoptótica de ECH en TNF. - células neuronales SHSY5Y tratadas (29) o células PC12 tratadas con H2O2-(15). En conjunto, estos datos sugieren que la actividad antiapoptótica de ECH puede estar mediada por TGF- 1 a través de una vía Bcl-2.

Es posible que la citoprotección de ECH(echinacoside de cistanche)podría contribuir a un ligero aumento en el número de células viables al disminuir la muerte celular espontánea al final de la incubación, pero la adición de ECH (100 ug/mL) casi duplica las células viables después de 48- h de tratamiento (Fig. 2A) , lo que sugiere que ECH de hecho estimula la proliferación celular que se confirma aún más por los datos en la Fig. 2, B y C. Se ha informado un efecto similar de ECH en células fibroblásticas humanas, MRC-5 (17): en MRC{ {6}} cultivos celulares, ECH podría retardar la senescencia celular al inducir el ciclo celular desde la fase G1 a la fase S y la fase G2. Al igual que la actividad antiapoptótica de ECH, la actividad proliferativa de ECH depende de TGF- 1 (Figs. 6 y 7) que ha sido bien documentado como una citoquina multifuncional (32, 33). El TGF- puede estimular la proliferación celular o inducir la detención del crecimiento según el tipo de célula o el microambiente extracelular; activa múltiples vías de señalización que incluyen Smads y no Smads (p. ej., las proteínas quinasas activadas por mitógenos) (34, 35), pero qué vía media en la proliferación celular estimulada por ECH/TGF en células MODE-K necesita más investigación.

Hasta la fecha, se sabe poco sobre la(s) proteína(s) objetivo de ECH(echinacoside de cistanche)o la(s) vía(s) de señal que regula. Un estudio muestra que el tratamiento con ECH aumenta los niveles celulares de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) en las células endoteliales (36), y la adición de 8-Bromo-cGMP aumenta modestamente la expresión de TGF- 1 en los fibroblastos cardíacos (37 ). Sin embargo, si el tratamiento con ECH eleva el cGMP y por qué ECH estimula la expresión de TGF- 1 en células epiteliales intestinales cultivadas necesita más investigación.

En conclusión, nuestro estudio demuestra que ECH(echinacoside de cistanche)induce la producción de TGF- 1 que media la proliferación celular y la supervivencia celular en células epiteliales intestinales cultivadas. La señalización de TGF- en el epitelio intestinal es necesaria para la reparación o curación de lesiones en la mucosa en ratones con colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (38), lo que sugiere que la ECH, tal vez la C. deserticola a base de hierbas que contiene ECH u otras, puede tener un potencial terapéutico para promover la lesión de la mucosa reparación en pacientes.

Reconocimiento

YJ recibió el apoyo de una beca para estudiantes de posgrado del Consejo de Becas de China, China.

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