El equinacósido suprime la inhibición del crecimiento inducida por dexametasona y la apoptosis en células osteoblásticas MC3T3-E1

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Resumen.

Los glucocorticoides (GC) se utilizan ampliamente para tratar enfermedades crónicas. La administración prolongada y/o sobredosis de GC tiene muchos efectos secundarios en la salud humana, incluida la osteoporosis inducida por GC (GIOP). En esta investigación, el objetivo fue evaluar la influencia queechinacoside de cistanche(ECH) ejerce sobre las células MC3T3-E1 osteoblásticas murinas tratadas con dexametasona. Encontramos que ECH(echinacoside de cistanche) (5, 10, 20, and 40 mg/l) inhibited dexamethasone (1,000 nM)-suppressed cell viability as demonstrated by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The dose of 10 mg/l was selected for the following experiments because this dose had a better effect than the dose of 5 mg/l, and the doses >10 mg/l tuvo un efecto similar a esta dosis. ECH(echinacoside de cistanche)(10 mg/l) o pifitrin‑ (PFT- ) (un inhibidor de p53, 20 µM) suprimió la apoptosis de MC3T3-E1 inducida por dexametasona como se ilustra en el análisis de citometría de flujo de doble marcaje con anexina V/yoduro de propidio (PI) . ECH(echinacoside de cistanche)o el tratamiento con PFT también alivió la acción de la dexametasona de inhibir la expresión de Bcl-2 así como la acción de la dexametasona de estimular la expresión de p53 y Bax. Además, la sobreexpresión de p53 mediada por lentivirus revirtió los efectos de ECH(echinacoside de cistanche)en células MC3T3-E1 tratadas con dexametasona, lo que sugiere que ECH(echinacoside de cistanche)indujo efectos antiapoptóticos en osteoblastos tratados con dexametasona a través de la vía dependiente de ap53-. En resumen, ECH(echinacoside de cistanche)tiene un efecto protector contra la apoptosis de células osteoblásticas inducida por dexametasona, lo que sugiere que ECH(echinacoside de cistanche)puede tener el potencial de aplicación clínica en el tratamiento de GIOP.

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Introducción

Glucocorticoides(GC) se utilizan con frecuencia para tratar un amplio espectro de enfermedades crónicas, incluidas la inflamación, el cáncer y los trastornos autoinmunes (1). Sin embargo, la administración prolongada y/o sobredosis de GC tiene muchos efectos secundarios, como hipertensión, hiperglucemia, glaucoma, osteonecrosis y osteoporosis (2-4). Está claro que el uso de GC aumenta la pérdida ósea y el riesgo de fractura (3-6). Los GC pueden inducir la apoptosis de los osteoblastos y alterar la función de estas células. Por ejemplo, la dexametasona, una hormona GC, puede regular al alza la expresión de p53 en células osteoblásticas MC3T3-E1, provocando así la apoptosis celular (7,8). La apoptosis de los osteoblastos conduce a una disminución de la formación ósea. Se ha introducido el uso oral de bisfosfonatos (alendronato y risedronato) (9,10) para el tratamiento de la osteoporosis inducida por GC (GIOP). Sin embargo, las bajas tasas de adherencia limitan la eficacia de los bisfosfonatos orales. Otros medicamentos también tienen limitaciones como la administración incómoda [ácido zoledrónico (11)] y el alto costo [PTH 1-34 (teriparatida) (12,13)]. En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar nuevas opciones de tratamiento para GIOP.

Echinacósido de cistanche (ECH)es un glucósido feniletanoide aislado de la medicina tradicional chinaHerbaCistanches(14). ECH(echinacoside de cistanche)tiene efectos protectores en el sistema neuronal (15-20), el hígado (21,22) y los pulmones (23) mediante la promoción de la proliferación celular y la inhibición de la respuesta inflamatoria, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la apoptosis celular. Aunque ECH(echinacoside de cistanche)también puede promover la regeneración ósea osteoblástica y tiene una extraordinaria actividad antiosteoporótica en los modelos de rata (24,25), no existen registros que describan los efectos de ECH(echinacoside de cistanche)sobre la apoptosis de células osteoblásticas inducida por GC. Por lo tanto, investigamos la influencia que ECH(echinacoside de cistanche)ejerce sobre la apoptosis de células osteoblásticas inducida por dexametasona y dilucida el mecanismo preliminar en células MC3T3-E1.

materiales y métodos

Cultivo de células. El Banco de células de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) proporcionó las células osteoblásticas murinas MC3T3-E1. El crecimiento de las células tuvo lugar en medio esencial mínimo (-MEM) (Hyclone; GE Healthcare, Logan, UT, EE. UU.) que contenía un 10 % de suero bovino fetal (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Grand Island, NY, EE. UU. ) y penicilina/estreptomicina (Beijing Solar Science and Technology Co., Ltd., Beijing, China). El mantenimiento de las celdas se llevó a cabo en un entorno con un 95 % de aire y un 5 % de dióxido de carbono a una temperatura de 37 °C.

losproduccióndelentivirussobreexpresión de p53. Para crear la construcción de expresión de p53, la región de la secuencia codificante de proteínas (CDS) del gen p53 murino se sintetizó y se insertó enecológicoRHODE ISLAND/BamSitios de restricción HI del vector de expresión lentiviral pLVX-puro (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, EE. UU.) de Genewiz, Inc. (Beijing, China). La construcción se verificó mediante secuenciación de ADN. Se transfectaron células 293T (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China) con una mezcla de plásmidos, incluidos plásmidos de empaquetamiento viral y plásmido de expresión p53 (pLVX-p53) o plásmido de control (pLVX) a través de Lipofectamine 2000 (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. El sobrenadante viral se recogió a las 48 h después de la transfección y se usó para infectar células MC3T3-E1. La evaluación de la expresión de p53 se realizó a las 48 h después de la infección viral.

Cuantitativopolimerasacadenareacción(qPCR). Utilizamos el reactivo TRIzol (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc.) para separar el ARN total y las células MC3T3-E1, y el kit de síntesis de ADNc RevertAid™ First Strand (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para transcribir de forma inversa el ARN total. El nivel de ARNm de p53 se detectó mediante qPCR en el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7300 (Applied Biosystems: Thermo Fisher Scientific, Inc., Foster City, CA, EE. UU.). Los cebadores fueron los siguientes: 5'-CCC CTGTCATCTTTTGTCCCT-3' y 5'-AGCTGGCAGAAT AGCTTATTGAG-3' para p53, 5'-CTGCCCAGAACATCA TCC-3' y 5'-CTCAGATGCCTGCTTCAC{{ 18}}' para GAPDH.

Luego, evaluamos los niveles de ARNm de p53 a través de los 2^-Método ΔΔCT (26) con GAPDH como control interno.

Transferencia occidental. La lisis de las células MC3T3-E1 tuvo lugar en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación con inhibidores de proteasa (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) y la centrifugación de los lisados ​​continuó durante 15 min a una temperatura de 4˚C a 9600 xg para que la precipitación pueda ser eliminada. Posteriormente, evaluamos la cantidad de proteína con el kit de ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Se añadió una cantidad igual de proteína a una SDS-PAGE al 10 o 15 por ciento y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (EMD Millipore, Bradford, MA, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 por ciento y se probaron con anticuerpos primarios. Después de lavar 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se llevó a cabo la incubación de las membranas con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:1,000; nº de cat. A0208; Instituto de Biotecnología Beyotime, Shanghái, China). . Realizamos pruebas de transferencia Western a través de un kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (EMD Millipore). Se utilizó GAPDH como estándar interno. Las fuentes de anticuerpos primarios fueron las siguientes: Bax (Sc-493) y Bcl-2 (Sc-492), ambos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EE. UU.); p53 (n.º 2524) y GAPDH (n.º 5174), ambos de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE. UU.).

Experimental agrupamiento. Para determinar la dosis adecuada de dexametasona, se realizó el tratamiento de las células MC3T3-E1 con una serie de cantidades de dexametasona (0, 1, 10, 100 y 1,000 nM; Sigma -Aldrich; Merck KGaA, St. Louis, MO, EE. UU.). A las 48 h después de incubar las células, se realizaron ensayos con el kit de recuento celular-8 (CCK-8) para detectar la proliferación celular.

Para seleccionar la dosis adecuada de ECH(echinacoside de cistanche), el tratamiento de las células MC3T3-E1 se realizó con 1,000 nM de dexametasona y varias dosis de ECH (0, 2,5, 5, 10, 20 y 40 mg/l; Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Las células cultivadas en condiciones normales (simuladas) sirvieron como control. El ensayo CCK-8 se realizó después de 48 h de cultivo.

Para todos los demás experimentos, las células MC3T3-E1 se dividieron en cinco grupos: grupo 1 (simulacro), las células se cultivaron en condiciones normales; grupo 2, las células se transdujeron con lentivirus pLVX; grupo 3, células cultivadas con 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche); grupo 4, células con 20 µM de pifitrina- (PFT-; Selleck Chemicals, Houston, TX, EE. UU.); grupo 5, células transducidas con lentivirus pLVX-p53 y tratadas con 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche). Las células de los grupos 2-5 se trataron con dexametasona 1,000 nM. La apoptosis celular y la expresión de proteínas se midieron después de 48 h de cultivo.

Célulaensayo de proliferacionSembramos células MC3T3-E1 en 96-placas de pocillos a 3x10³células/pocillo y se cultivaron en condiciones normales durante la noche. Las células se trataron como se indica. Después de 48 h de cultivo, se realizó el ensayo CCK8 (Signalway Antibody LLC, College Park, MD, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el medio de cultivo en cada pocillo se reemplazó con 100 µl de solución CCK-8 al 10 por ciento en el medio. Después de incubar las células durante 1 h a una temperatura de 37 °C, evaluamos la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm con un lector de microplacas. Se calculó la viabilidad celular relativa (porcentaje) con conexiones a pozos de control.

Célulaevaluación de la apoptosis. Utilizamos el kit de apoptosis celular Anexina V-FITC (Beyotime Institute of Biotechnology) para cuantificar las células que están experimentando una apoptosis temprana siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, la recogida de células tratadas se realizó mediante tripsinización. Las células se lavaron mediante PBS y se resuspendieron con tampón de unión anexina. La incubación de las células se realizó mediante anexina V-FITC durante 15 min a una temperatura de 4 °C, seguido de incubación con yoduro de propidio (PI) durante 5 min a 4 °C. Se consideró que las células en el cuadrante inferior derecho (Anexina V-FITC positivas y PI negativas) experimentaban activamente una apoptosis temprana.

Estadísticoanálisis. Los datos son las medias ± SD para los tres experimentos independientes. Se realizaron la prueba de comparaciones múltiples de Tukey y el análisis de varianza unidireccional para analizar las diferencias entre los grupos a través del software GraphPad Prism (versión 6.0; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultados

Establecimientodea dosis adecuadadedexametasonaPara determinar la dosis adecuada de dexametasona, las células MC3T3-E1 se expusieron a cantidades crecientes de dexametasona (0, 1, 10, 100 y 1,000 nM) durante 48 h . Como se muestra en la Fig. 1, la viabilidad celular relativa determinada por el ensayo CCK-8 aumentó en las células tratadas con bajas concentraciones de dexametasona (1 y 10 nM) y se redujo significativamente en las células expuestas a altas concentraciones de dexametasona (100 nM). y 1,000 nM).

La reducción más significativa se observó en las células con 1,000 nM de dexametasona. Por tanto, se seleccionó 1,000 nM de dexametasona en los ensayos posteriores.

Efecto de ECH(echinacoside de cistanche)sobre la inhibición del crecimiento celular inducida por dexametasona. Luego exploramos el efecto de ECH(echinacoside de cistanche)sobre la inhibición del crecimiento celular inducida por dexametasona. El tratamiento de las células MC3T3-E1 se realizó con 1,000 nM de dexametasona y varias dosis de ECH(echinacoside de cistanche)(0, 2,5, 5, 10, 20 y 40 mg/l; Fig. 2). A las 48 h postratamiento, la adición de ECH(echinacoside de cistanche)a dosis de 5, 10, 20 y 40 mg/l disminuyó notablemente el daño celular inducido por la dexametasona. ECH(echinacoside de cistanche)a una dosis de 10 mg/l tiene un efecto más evidente que a una dosis de 5 mg/l. La viabilidad celular fue similar en las células tratadas con 10, 20 y 40 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche). Por tanto, 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche)se usó en los siguientes experimentos.

Sobreexpresión de p53 mediante la construcción de lentivirus. La dexametasona puede regular al alza p53, lo que induce la apoptosis de los osteoblastos (8). Para estudiar los efectos de ECH(echinacoside de cistanche) on dexamethasone-induced p53 expression, we constructed a lentivirus encoding p53 (pLVX-p53) and transduced the virus into MC3T3-E1 cells. The expression of p53 was analyzed at 48 h after transduction. Fig. 3 shows that p53 mRNA and protein levels were increased to >2 veces en células transducidas con pLVX-p53- en comparación con células con virus de control (pLVX). p53 estuvo involucrado en el efecto de ECH (echinacoside de cistanche) sobre la apoptosis inducida por dexametasona. Las células MC3T3-E1 se trataron con Plavix o pLVX-p53, 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche), 20 µM de PFT- (un inhibidor de p53) y 1,000 nM de dexametasona, y luego se midió la apoptosis celular mediante el kit de apoptosis de Anexina V-FITC. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento con dexametasona indujo notablemente la apoptosis celular en comparación con las células cultivadas en condiciones normales (simulacro). ECH(echinacoside de cistanche) y el tratamiento con PFT protegieron significativamente a las células MC3T3-E1 frente a la apoptosis inducida por dexametasona. Además, la sobreexpresión de p53 revirtió los efectos protectores de ECH (echinacoside de cistanche).

Se sabe que Bcl-2 y Bax, como importantes reguladores de la apoptosis, están regulados por p53 (27). La transferencia de Western indicó que los cambios en la expresión de la proteína p53 y Bax eran consistentes con las alteraciones de la apoptosis celular, mientras que la expresión de Bcl-2 cambió en la dirección opuesta (Fig. 4B y C). En particular, los niveles de proteína de p53 fueron significativamente suprimidos por ECH(echinacoside de cistanche)y tratamiento con PFT en células que sobreexpresan p53 y tratadas con dexametasona (Fig. 4C). Estos datos sugieren que ECH(echinacoside de cistanche)podría ejercer efectos protectores sobre la apoptosis inducida por dexametasona mediante la inhibición de la expresión de p53.

Efectos del equinacósido de cistanche

Discusión

La función anti-apoptosis de ECH(echinacoside de cistanche)se ha descrito en el modelo de lesión hepática aguda inducida por D-galactosamina (D-GalN) y lipopolisacárido (LPS) y en células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) inducidas por factor de necrosis tumoral o 1-metil{{6 }}fenilpiridinioion (MPP plus) (17,22,28). Se ha informado que el tratamiento con dexametasona puede inhibir la proliferación e inducir la apoptosis de las células MC3T3-E1 (8,29). En el estudio actual, la viabilidad celular relativa se redujo significativamente en las células expuestas a altas concentraciones de dexametasona (100 y 1,000 nM), lo que concuerda con un estudio anterior (8). El tratamiento adicional con ECH (5-40 mg/l) inhibió notablemente la viabilidad celular suprimida con dexametasona. Además, la exposición a dexametasona (1,000 nM) estimuló la apoptosis de las células MC3T3-E1, que el tratamiento con ECH restringió en gran medida. El informe brindó una primera descripción de cómo se protege la ECH contra la apoptosis de las células osteoblásticas inducida por dexametasona y sugirió que la ECH puede tener el potencial de aplicación clínica en GIOP.

Además, tratamos de explorar el mecanismo preliminar de los efectos protectores de ECH(echinacoside de cistanche). La dexametasona puede mejorar la transcripción de p53, lo que induce la apoptosis de los osteoblastos y la detención del ciclo celular (8). p53 está regulado a la baja por ECH en células SH-SY5Y (28). Aquí, PFT- (un inhibidor de p53) tuvo efectos protectores similares a los de ECH, mientras que la sobreexpresión de p53 revirtió los efectos protectores de ECH. Los cambios en la expresión de la proteína p53 bajo diferentes condiciones estuvieron de acuerdo con las alteraciones de la apoptosis celular. Estos resultados indican que ECH podría ejercer efectos protectores sobre la apoptosis de células osteoblásticas inducida por dexametasona mediante la inhibición de la expresión de p53. Las proteínas de la familia Bcl-2, como Bcl-2 y Bax, pueden alterar la permeabilidad de la membrana mitocondrial, activar las caspasas efectoras y provocar la apoptosis celular (30). Es bien sabido que p53 puede regular Bcl-2 y Bax (27). Aquí, el tratamiento con PFT- o ECH(echinacoside de cistanche) atenuaron los efectos inhibidores de la dexametasona sobre los niveles de la proteína antiapoptosis Bcl-2, así como los efectos estimulantes que la dexametasona tiene sobre los niveles de la proteína proapoptosis Bax, mientras que la sobreexpresión de p53 revirtió los efectos de la ECH. Estos resultados demostraron además la participación de p53 en la función protectora de ECH.

En resumen, demostramos que ECH(echinacoside de cistanche)tiene un efecto protector prometedor sobre la apoptosis de las células osteoblásticas inducida por la dexametasona, lo que sugiere que la ECH puede tener potencial para la aplicación clínica en el tratamiento de la GIOP.

Efectos del equinacósido de cistanche

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