La proteína J 1 que interactúa con EDS1- es un regulador negativo esencial de la inmunidad innata de las plantas en Arabidopsis

Abstracto

Las plantas han desarrollado mecanismos precisos para optimizar las respuestas inmunes contra los patógenos. LA SUSCEPTIBILIDAD MEJORADA A LAS ENFERMEDADES 1 (EDS1) desempeña un papel vital en la inmunidad innata de las plantas al regular la resistencia basal y la inmunidad activada por efectores. Se requiere el tráfico nucleocitoplasmático de EDS1 para reforzar la resistencia, pero el mecanismo molecular sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, mostramos que EDS1-INTERACTING J PROTEIN1 (EIJ1), que actúa como una chaperona similar a la proteína DnaJ en respuesta a la infección por patógenos, funciona como un regulador negativo esencial de la inmunidad de las plantas al interactuar con EDS1. La mutación de pérdida de función de EIJ1 no afectó el crecimiento de las plantas, pero mejoró significativamente la resistencia a los patógenos. Tras la infección por patógenos, EIJ1 se relocalizó del cloroplasto al citoplasma, donde interactuó con EDS1, restringiendo así el tráfico de EDS1 desencadenado por patógenos al núcleo y comprometiendo la resistencia en una etapa temprana de la infección. Durante el desarrollo de la enfermedad, EIJ1 se degradó gradualmente, permitiendo la acumulación nuclear de EDS1 para reforzar la resistencia transcripcional. La cepa avirulenta Pst DC3000 (AvrRps4) abolió la acción represiva de EIJ1 al inducir rápidamente su degradación en la respuesta de inmunidad desencadenada por efectores. Por lo tanto, nuestros hallazgos muestran que EIJ1 es un regulador negativo esencial dependiente de EDS1-de la inmunidad innata de las plantas y proporciona una comprensión mecanicista de cómo se regula la distribución nuclear versus citoplásmica de EDS1 durante la respuesta inmune.

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Introducción

Las plantas han desarrollado una red complicada para modular sus respuestas inmunes. Para defenderse de los patógenos, las plantas emplean dos estrategias reguladoras principales: inmunidad desencadenada por patrones (PTI) e inmunidad desencadenada por efectores (ETI). PTI se rige por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos o microbios (Zipfel, 2008). Para facilitar la infección, los patógenos virulentos suprimen la PTI al secretar efectores patógenos y manipulan las células huésped para facilitar la adquisición de nutrientes y, en última instancia, la reproducción (Tsuda y Katagiri, 2010). El bajo nivel de resistencia que muestra la planta a estos patógenos virulentos se denomina resistencia basal (Jones y Dangl, 2006; Klessig et al., 2018). Por otro lado, la ETI está mediada por proteínas de resistencia a enfermedades (R) codificadas por plantas, que pueden reconocer directa o indirectamente la presencia de efectores secretados por patógenos (Tsuda y Katagiri, 2010). La mayoría de las proteínas R contienen un sitio de unión a nucleótidos y un dominio repetido rico en leucina (NB-LRR). Las proteínas NB-LRR que contienen un dominio de interacción proteína-proteína del receptor N-terminal Toll/interleucina -1 (TIR) ​​se conocen como proteínas TIR-NB-LRR (TNL) y comprenden el grupo más grande de proteínas NB-LRR. Proteínas LRR (Caplan et al., 2008). En comparación con la resistencia basal, la ETI induce una respuesta de defensa más fuerte y rápida contra patógenos y a menudo va acompañada de muerte celular local, un rasgo característico de la respuesta hipersensible (HR; Dodds y Rathjen, 2010). LA SUSCEPTIBILIDAD MEJORADA A LAS ENFERMEDADES 1 (EDS1), un regulador central de la inmunidad de las plantas, ayuda a controlar la resistencia basal al restringir la invasión de patógenos biotróficos y hemibiotróficos (Wiermer et al., 2005). EDS1 también juega un papel importante en ETI, que está mediado principalmente por la clase TNL de proteínas R (Heidrich et al., 2012). EDS1 trabaja en estrecha colaboración con sus correguladores PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 y GEN 101 ASOCIADO A LA SENESCENCIA en el citoplasma y/o núcleo para regular la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares, la acumulación de ácido salicílico (SA) y otros procesos, reforzando así la resistencia a patógenos (Ruste ´rucci et al., 2001; Rietz et al., 2011; Wagner et al., 2013). En consecuencia, el mutante Arabidopsis eds1 es altamente susceptible a Pseudomonas syringae pv. cepa de tomate (Pst) DC3000 y muestra una ETI mediada por TNL comprometida, en la que se inhiben la expresión de ISOCORISMATO SINTASE1 (ICS1; un gen biosintético de SA) y la biosíntesis de SA (Parker et al., 1996; Feys et al., 2001; Bartsch et al. otros, 2006). Además, EDS1 exhibe tráfico de proteínas entre el citoplasma y el núcleo mediado por receptores de transporte nuclear (García et al., 2010). Aunque las funciones nucleares de EDS1 implican resistencia basal y producción de ROS, la muerte celular programada y el refuerzo de la resistencia requieren la coordinación de la localización nuclear versus citoplásmica de EDS1 (Heidrich et al., 2011). Un equilibrio entre la cantidad de EDS1 en el citosol y la cantidad en el núcleo es importante para una resistencia basal eficiente y una inmunidad desencadenada por TNL (García et al., 2010). Sin embargo, aún no está claro cómo EDS1 mantiene el patrón de distribución nucleocitoplasmática durante las respuestas inmunes innatas de las plantas. Las proteínas DnaJ (o proteínas J) son proteínas chaperonas (Pulido y Leister, 2018) que pertenecen a la superfamilia de dominios ricos en cisteína (Cys) y participan en el plegamiento y ensamblaje de proteínas nacientes, el transporte de proteínas a través de membranas con el replegamiento posterior y eliminación de proteínas desplegadas o defectuosas (Bukau et al., 2006). Estos procesos son necesarios para el funcionamiento normal de la mayoría de las proteínas celulares en diferentes etapas del desarrollo (Pulido y Leister, 2018). La investigación en varios organismos muestra que las proteínas DnaJ también desempeñan diversas funciones en las respuestas al estrés biótico y abiótico, especialmente en las respuestas inmunes. En Nicotiana benthamiana, la proteína DnaJ Nb-MIP1 funciona como cochaperona en la respuesta a patógenos virales (Du et al., 2013). La proteína de choque térmico Gm 40 (HSP40.1) de soja (Glycine max L.), una proteína DnaJ localizada en el núcleo, es un regulador positivo de la resistencia al virus del mosaico de la soja (Liu y Whitham, 2013). En tomates (Solanum lycopersicum), se informó que la proteína DnaJ localizada en el cloroplasto, Le-CDJ2, mejora la resistencia al patógeno bacteriano Pseudomonas solanacearum (Wang et al., 2014). Además, se informó que la proteína1 que interactúa con Tsi1- (Tsip1), una proteína DnaJ del tabaco (Nicotiana tabacum), regula la activación transcripcional mediada por Tsi1-en respuesta al estrés (Ham et al., 2006). Estos resultados indican claramente que las proteínas DnaJ desempeñan un papel importante en la inmunidad de las plantas, aunque los mecanismos subyacentes requieren más investigación. En este estudio, aislamos Arabidopsis thaliana EDS1 INTERACTING J PROTEIN 1 (EIJ1), una proteína DnaJ similar a HSP40-, y demostramos que EIJ1 interactuaba con EDS1 en la planta. Las plantas mutantes eij1 con pérdida de función mostraron un crecimiento normal, una mayor resistencia a los patógenos y una mayor expresión de genes relacionados con la resistencia tras la infección por patógenos en comparación con las plantas de tipo salvaje. Sin embargo, la mutación de pérdida de función de EIJ1 no rescató el fenotipo susceptible del mutante eds1 tras la exposición a Pst DC3000. Además, la proteína EIJ1, que normalmente se localiza en el cloroplasto, se liberó del cloroplasto al citoplasma tras la inoculación del patógeno, donde interactuó con EDS1, impidiendo así su tráfico al núcleo desencadenado por el patógeno y, en consecuencia, comprometiendo la respuesta de resistencia en una etapa temprana. etapa de infección. Estos hallazgos aclaran detalles importantes del mecanismo regulador subyacente al patrón de distribución nucleocitoplasmática de EDS1 y proporcionan un objetivo potencialmente eficaz para el mejoramiento de la resistencia a enfermedades en los cultivos.

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Resultados

EIJ1 interactúa con EDS1 in vitro e in vivo

Como componente esencial de las respuestas de defensa de las plantas, EDS1 está ubicado en un nodo clave de la red de señalización de inmunidad innata de la planta. Para identificar posibles socios proteicos de EDS1 que interactúan, realizamos una detección de dos híbridos de levadura. EDS1 mostró una fuerte interacción con una proteína chaperona similar a Arabidopsis HSP40- (AT2G24860) con una función desconocida (Figura 1, A y B), perteneciente a la superfamilia DnaJ (Figura 1A complementaria); esta proteína se denominará en lo sucesivo EIJ1. El análisis de secuencia demostró que EIJ1 contiene 144 residuos de aminoácidos, incluidos cuatro motivos de dedos de Zn ricos en Cys (CXXCXGXG; Figura 1A complementaria). Aunque otras especies de angiospermas tienen homólogos de EIJ1, los homólogos más cercanos parecen estar limitados a Brassicaceae (Figura 1B complementaria y archivo S1). En particular, EIJ1 mostró similitud de secuencia con la proteína Tsip1 de N. tabacum, que participa en la resistencia a patógenos (Figura 1B complementaria; Ham et al., 2006). Para identificar los dominios funcionales responsables de la interacción entre EDS1 y EIJ1, se utilizaron dos versiones truncadas de estas proteínas en ensayos de dos híbridos en levadura (Figura 1A; Figura 1A complementaria). El extremo N de EIJ1 mostró una fuerte interacción con el EDS1 de longitud completa, así como con el extremo N de EDS1, pero una interacción débil con el extremo C de EDS1 (Figura 1B). Esto sugiere que el extremo N de EDS1, que contiene un dominio similar a lipasa, y el extremo N de EIJ1 son necesarios y suficientes para su interacción. Aunque el extremo C de EIJ1 contiene un dominio de dedo de Zn rico en Cys conservado que puede facilitar su unión al ADN u otras proteínas, no contribuye a la interacción con EDS1. Los ensayos desplegables verificaron aún más la interacción entre EDS1 y EIJ1 in vitro (Figura 1C), mientras que los ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP) utilizaron plantas transgénicas 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3FLAG. confirmó su interacción en planta (Figura 1D). En conjunto, estos resultados demuestran que EDS1 interactúa con EIJ1 tanto in vitro como in vivo. Caracterización de EIJ1 Para determinar la localización subcelular de EIJ1, fusionamos el marco de lectura abierto de EIJ1 con el gen indicador mCherry bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor para generar la construcción 35Spro:EIJ1-mCherry. Esta construcción se transformó transitoriamente en hojas de N. benthamiana mediante agroinfiltración. La microscopía de fluorescencia mostró que EIJ1-mCherry estaba localizado tanto en el cloroplasto como en el núcleo (Figura 2A). Este patrón de localización se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia de plantas transgénicas 35Spro:EIJ1-6HA (Figura 2 complementaria). Para investigar el patrón de expresión de EIJ1, la secuencia genómica de EIJ1 se fusionó con el gen indicador de ß-glucuronidasa (GUS) para generar líneas transgénicas de Arabidopsis EIJ1pro: EIJ1-GUS. Se detectó una fuerte actividad de GUS en hojas y raíces en roseta; sin embargo, la actividad de GUS fue débil en silicuas e indetectable en tallos y flores (Figura 2B). Estos resultados fueron consistentes con los resultados de expresión de EIJ1, que se examinó mediante PCR con transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR) en varios tejidos (Figura 2C). Dado que EDS1 es un regulador central de la inmunidad de las plantas (Saikat et al., 2011), investigamos si EIJ1, un supuesto cofactor de EDS1, también participa en la respuesta a la infección por patógenos. El nivel de transcripción de EIJ1 se indujo mediante tratamiento con bacterias hemibiotróficas Pst DC3000 o SA (Figura 2D). La tinción con GUS reveló que EIJ1 fue inducido y notablemente concentrado alrededor de los tricomas en hojas inoculadas con Pst DC3000- (Figura 2E-G), lo que implica una posible relevancia biológica de EIJ1 en la respuesta de defensa (Xin y He, 2013). A continuación, examinamos el nivel de EIJ1 en plantas 35Spro: EIJ1-HA tratadas con Pst DC3000 o SA. Curiosamente, tras el tratamiento con Pst DC3000 o SA, EIJ1 se degradó gradualmente después de una inducción rápida (Figura 2, H e I). Este resultado no fue consistente con el patrón de expresión estable de EIJ1-HA observado en plantas 35Spro: EIJ1-HA durante la infección por patógenos (Figura 3 complementaria), lo que indica una regulación postranscripcional de EIJ1. En conjunto, estos resultados sugieren que EIJ1 está involucrado en la respuesta inmune de las plantas.

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Una mutación con pérdida de función de EIJ1 aumenta la resistencia a Pst DC3000 a través de la vía SA

Para investigar el papel de EIJ1 en la inmunidad de las plantas, identificamos un mutante de Arabidopsis (SALK_142975) que contiene una inserción de ADN-T en el tercer exón de EIJ1 (Figura 3, A y B). El análisis cuantitativo de RT-PCR mostró que EIJ1 se expresaba pobremente en este mutante de inserción de ADN T eij1; por lo tanto, llamamos a este alelo EIJ1 eij{{10}} (Figura 3C). Posteriormente, evaluamos el fenotipo de resistencia a enfermedades de plantas mutantes eij1-1 de 3-semanas de edad y plantas ecotipo Columbia (Col-0) de Arabidopsis (A. thaliana) mediante inoculación con Pst DC3000. La evaluación de las hojas infectadas 5 días después de la inoculación (dpi) reveló menos lesiones necróticas en las hojas de eij1-1 que en las hojas de Col-0 (Figura 3D). Consistentemente, las hojas de eij1-1 mostraron un título bacteriano significativamente más bajo que las hojas de Col-0 a 5 ppp, aunque el título bacteriano no mostró diferencias entre las hojas de Col-0 y eij1-1 a 5 ppp. 0 ppp (Figura 3E). A continuación, generamos líneas de complementación eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA transformando un fragmento genómico EIJ1 fusionado con una secuencia de etiqueta 6xHA en el fondo eij1-1. Las líneas de complementación rescataron por completo el fenotipo de resistencia al patógeno de eij1-1 (Figura 3E), lo que respalda que eij1-1 es un mutante con pérdida de función. Para determinar el efecto de EIJ1 sobre la inmunidad apoplásica, también se evaluó el fenotipo de resistencia a enfermedades de estas líneas de complementación mediante infiltración a presión de Pst DC3000, y se obtuvieron resultados similares (Figura 4A complementaria). Para confirmar la función de EIJ1, luego identificamos otro mutante de Arabidopsis eij1-2 (WiscDsLox343G09), que contenía una inserción de ADN-T en la región promotora de EIJ1 (Figura 5 complementaria, A y B). Las transcripciones de EIJ1 apenas fueron detectables en el mutante eij1-2, lo que indica que eij1-2 es un alelo nulo de EIJ1. De manera similar a eij1-1, los ensayos de crecimiento bacteriano revelaron que eij1-2 estaba presente en un título bacteriano significativamente más bajo que Col-0 (Figura complementaria 5, D y E). En resumen, estos resultados indican que EIJ1 juega un papel represor importante en la respuesta inmune de la planta.

Figura 1 EIJ1 interactúa con EDS1 in vitro e in planta. (A) Diagrama esquemático que muestra los dominios encontrados en EIJ1, EDS1 y sus versiones truncadas. (B) Los ensayos de dos híbridos de levadura muestran las interacciones entre EIJ1, EDS1 y sus versiones truncadas. Las células de levadura transformadas se cultivaron en medio SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade y SD/-Trp/-Leu. Controles vacíos, sólo vectoriales; AD, dominio de activación; BD, dominio de unión al ADN. (C) Ensayo desplegable que muestra la interacción directa entre las proteínas de fusión His-EIJ1 y GST-EDS1 in vitro. Las proteínas His-EIJ1 se incubaron con proteína GST o GST-EDS1 inmovilizada. Las fracciones inmunoprecipitadas se detectaron mediante anticuerpos anti-His y anti-GST, respectivamente. (D) Co-IP que muestra la interacción de EIJ1 y EDS1 en hojas de Arabidopsis. Las proteínas totales extraídas de hojas de 35Spro: EIJ1-6HA (como control de genotipo) y 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG de 3-semanas de edad1-6HA 35Spro:EDS1-3FLAG se inmunoprecipitaron mediante ya sea un anticuerpo anti-FLAG o un suero preinmune (IgG). Las proteínas coinmunoprecipitadas se detectaron utilizando anticuerpos anti-FLAG y anti-HA, respectivamente. Los resultados representativos presentados en (B – D) se repitieron de forma independiente tres veces.

La producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), un tipo de especie reactiva de oxígeno, es un sello distintivo del reconocimiento exitoso de patógenos y la posterior activación de las respuestas de defensa de las plantas, incluida la muerte celular programada relacionada con la HR (Lam et al., 2001; Torres et al., 2006; Nanda et al., 2010). Por lo tanto, monitoreamos el nivel de H2O2 en 3-Col-0, eij1-1 y eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA inoculados con patógenos de una semana de edad. plantas utilizando el método de tinción con 3,3-diaminobencidina (DAB). Los resultados mostraron que el H2O2 se acumuló a niveles altos en las plantas infectadas pero no se detectó en las plantas no inoculadas (simulacros) (Figura 3F). Se detectó un mayor nivel de H2O2 en hojas de eij1-1 que en las hojas de Col- 0 y líneas de complementación inoculadas con Pst DC3000 (Figura 3F). Además, si bien la tinción con azul tripano reveló que la muerte celular (microHR, Alvarez et al., 1998) se produjo en las hojas de eij1-1 a las 24-h post-inoculación (HPI) con Pst DC3000, pero no Se observó microHR en plantas Col-0 y eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA (Figura 3G). La inoculación con el avirulento Pst DC3000 (AvrRps4) resultó en una mayor acumulación de H2O2 y más microHR, aunque no se observaron diferencias visibles entre estos tres genotipos (Figura 3, F y G). Estos resultados implicaron un papel esencial de EIJ1 en la resistencia basal a patógenos.

Figura 2 Patrón de expresión del ARNm y la proteína de EIJ1. (A) Localización de cloroplasto y núcleo de EIJ1. Se expresó transitoriamente una proteína de fusión EIJ1-mCherry en hojas de N. benthamiana y se analizó mediante microscopía confocal. La fluorescencia DAPI indica el núcleo. La fluorescencia de la clorofila se indica en color verde. Barra=10 lm. (B) Tinción GUS que muestra la expresión de EIJ1 en raíces, tallos, hojas en roseta, flores, silicuas y plántulas de 10-días (de izquierda a derecha). Barra=1 mm. (C) Patrón de expresión de EIJ1 en varios tejidos de plantas Col, incluidas raíces, tallos, hojas en roseta, flores y silicuas, según lo detectado por qRT-PCR. La expresión relativa se calculó normalizando el nivel de transcripción del gen examinado frente al de ACTIN2 (lo mismo que a continuación). Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas. Las letras minúsculas indican diferencias significativas (ANOVA unidireccional, P 5 0.01; Conjunto de datos suplementarios 1). (D) Análisis de expresión de EIJ1 utilizando plantas Col de 3-semanas de edad inoculadas por inmersión con Pst DC3000 (OD600=0.1) o rociadas con SA 0,05 mM. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas (Conjunto de datos suplementarios 1). (E – G) La tinción con GUS muestra la inducción de la expresión de EIJ1 por parte de patógenos. Se inocularon plantas pEIJ1:EIJ1-GUS de tres semanas de edad (MgCl2 10 mM; E) o se inocularon por inmersión con Pst DC3000 (OD600=0.1; F). Barra=1 mm. La imagen ampliada indica que EIJ1-GUS se concentra en la región de los tricomas en (G). Barra=100 lm. Se cosecharon hojas a 4 hpi y se incubaron con una solución de tinción GUS. (H) y (I) Patrón de expresión de EIJ1 después del tratamiento con Pst DC3000 o SA. Las proteínas totales se extrajeron de plantas 35Spro: EIJ1-6HA de 3-semanas de edad inoculadas por inmersión con Pst DC3000 (OD600=0.1; H) o rociadas con SA (I) 0,05 mM. y se detecta utilizando un anticuerpo anti-HA. Los paneles inferiores muestran la tinción con Coomassie Brilliant Blue (CBB) como control de carga. Los análisis de inmunotransferencia presentados en (H) y (I) se repitieron de forma independiente tres veces.

Figura 3 Identificación del alelo mutado eij1-1 de Arabidopsis EIJ1. (A) Diagrama esquemático que muestra el sitio de inserción del ADN-T en eij1-1 (SALK_142975). Los exones están representados por cajas y los intrones por líneas entre las cajas. Los cuadros negros presentan las regiones de codificación EIJ1 y los cuadros blancos representan la región no traducida. El triángulo indica el sitio de inserción del ADN-T. (B) La amplificación por PCR del ADN genómico confirma que eij1-1 es un mutante de inserción homocigótico. Los cebadores utilizados (P1, P2) se muestran en (A). LB indica el cebador del borde izquierdo del ADN-T y M indica los marcadores moleculares del ADN. (C) Análisis qRT-PCR de la expresión de EIJ1. El ARN total se extrajo de hojas de eij1 y Col de 3-semanas de edad. La expresión relativa de EIJ1 en eij1-1 se estableció en 1. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas (Conjunto de datos suplementarios 1). (D) El fenotipo de resistencia a enfermedades de Col, eij1-1 y dos líneas transgénicas de complementación EIJ1 representativas eij1 EIJ1pro: EIJ1-6HA. Se inocularon plantas de tres semanas de edad con Pst DC3000 (OD600=0.05). Las hojas mostradas fueron fotografiadas a 5 ppp. Barras=5 mm. (E) Crecimiento bacteriano de Pst DC3000 en plantas descritas en (D) a 0 y 5 ppp. ufc/g, unidades formadoras de colonias por g de peso fresco. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas. Las letras minúsculas indican diferencias significativas (ANOVA unidireccional, P 5 0.01, conjunto de datos suplementarios 1). (F) Examen de los niveles de H2O2 en hojas de Col,

EIJ1 media la inmunidad de las plantas al reprimir la actividad de EDS1

Para comprender la relación genética entre EDS1 y EIJ1, generamos líneas mutantes dobles eij1-1 eds1-22 cruzando el mutante eij1-1 con eds1-22, una pérdida de- alelo mutante de función de EDS1-90 (AT3G48090; fondo Col-0), que exhibe una resistencia a patógenos comprometida (Yang y Hua, 2004). No se observaron diferencias morfológicas entre las plantas mutantes eij1-1, eds1-22 y eij1-1 eds1-22 en condiciones normales de crecimiento (Figura 4, A y B). Después de la inoculación con Pst DC3000, las plantas mutantes eij1-1 mostraron una resistencia más fuerte que las plantas Col-0 a 5 ppp (Figura 4, A y B). Sin embargo, el doble mutante eij1-1 eds1-22 presentó lesiones necróticas notables y un alto título bacteriano, comparable con el mutante único eds1-22, lo que indica que el alelo eij1-1 no pudo para rescatar el fenotipo susceptible a la enfermedad de eds1-22 (Figura 4, A y B). También se evaluó la resistencia a las enfermedades después de la infiltración a presión de Pst DC3000, y se obtuvieron resultados similares (Figura 4B complementaria). Además, utilizamos el alelo nulo EDS1, eds1-2; fondo de la columna -0; Bartsch et al., 2006), para generar las plantas doblemente mutantes eij1-1 eds1-2 para análisis genético. Al igual que eij1-1 eds1-22, las plantas doblemente mutantes eij1-1 eds1-2 también mostraron lesiones necróticas notables y un título bacteriano más alto que eij1-1, que fue comparable con el mutante único eds1-2 (Figura 6 complementaria). Esta evidencia genética sugiere que EDS1 es epistático con EIJ1. De acuerdo con las observaciones anteriores, el H2O2 se acumuló a niveles altos en las hojas de eij1-1 pero a niveles bajos en las hojas de eds1- 22 y eij1-1 eds1-22, en comparación con Col{{ 53}} hojas, tras la inoculación de Pst DC3000 (Figura 4C). Además, microHR en eij1-1 fue claramente suprimida por la pérdida de función de EDS1 a 24 hpi con Pst DC3000 o Pst DC3000 avirulento (AvrRps4; Figura 4D). De acuerdo con este resultado, los niveles de expresión de ICS1 y PR1 en las plantas eij1-1 eds1-22 y eds1-22 fueron comparables pero sustancialmente más bajos que los de eij1-1 y Col{ {71}} plantas (Figura 4E). Estos resultados respaldan que la respuesta inmune innata mediada por EIJ1-depende de EDS1. Para investigar el papel de la interacción EIJ1-EDS1 en la respuesta inmune de la planta, realizamos un análisis de secuencia de ARN de las hojas de eij1-1, eds1-22 y Col-0 a 24 hpi con Pst DC3000. ; con hojas de Col-0 sin inocular se utilizaron como tratamiento simulado. Se identificaron un total de 2762, 923 y 622 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en Col_Pst DC3000 frente a Col_mock, eij1-1_Pst DC3000 frente a Col_ Comparaciones de Pst DC3000 y eds1-22_Pst DC3000 versus Col_Pst DC3000. En adelante, estos genes se denominarán genes que responden a patógenos, regulados por EIJ1- y regulados por EDS1-, respectivamente (Figura 7A complementaria y conjunto de datos 2). Entre estos genes, 471 estaban regulados por EIJ1; 396 estaban regulados por EDS1 (Figura 4F; Conjunto de datos suplementarios 2); y 124 fueron co-regulados por EIJ1 y EDS1 (Figura 4F). El análisis de conglomerados mostró que el 93,5% (116) de los genes corregulados (124) estaban regulados positivamente por EDS1 y regulados negativamente por EIJ1 (Figura 4F; Figura 7B complementaria y conjunto de datos 2), lo que respalda el papel represivo de EIJ1 en Función EDS1. El análisis de ontología genética (GO) reveló además que la mayoría de los genes regulados antagónicamente por EIJ1 y EDS1 están involucrados principalmente en respuestas al estrés y respuestas inmunes innatas (Figura 4G; Tabla complementaria S1). Estos análisis sugieren que EIJ1 y EDS1 regulan los genes relacionados con la resistencia de manera contrastante durante la infección por patógenos. Una porción considerable de los genes regulados por EDS1-(272/396) no estaban regulados por EIJ1, probablemente debido al cambio menor (52) o a la función independiente de EIJ1-de EDS1.

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EIJ1 interactúa con EDS1 en el citoplasma e inhibe el tráfico nuclear de EDS1

EIJ1 se localiza en el cloroplasto y el núcleo de las células de las hojas (Figura 2A), mientras que la proteína EDS1 exhibe un patrón de distribución nucleocitoplasmática, ocurriendo en ambos lugares (García et al., 2010). Para investigar dónde y cómo interactúa EIJ1 con EDS1 in planta, realizamos ensayos de expresión transitoria utilizando protoplastos de Arabidopsis. Curiosamente, aunque EIJ1 mantuvo su patrón de localización subcelular original en el cloroplasto y el núcleo en presencia de la proteína verde fluorescente (GFP; control), EIJ1-mCherry localizado en el cloroplasto se difundió en el citoplasma cuando se coexpresó con EDS{ {9}}GFP en protoplastos (Figura 5A, ver réplicas en el archivo complementario 2). Este fenómeno se confirmó en células epidérmicas de N. benthamiana, en las que EIJ1-mCherry se coexpresó transitoriamente con EDS1-GFP o el control de GFP (Figura 8 complementaria, ver réplicas en el Archivo complementario 2) . Estas observaciones indican que la sobreexpresión de EDS1 puede conducir a la relocalización subcelular de EIJ1. A continuación, para determinar la ubicación subcelular donde interactúan EDS1 y EIJ1, realizamos un ensayo desplegable utilizando la proteína de fusión recombinante glutatión S-transferasa (GST) -EDS1 (cebo) y extracto de proteína total, fracciones con núcleos empobrecidos y núcleos. fracciones enriquecidas de líneas transgénicas 35Spro:EIJ1-HA (proteínas presa). Nuestros resultados mostraron que EDS1 inmunoprecipitó con EIJ1-HA cuando se usó el extracto de proteína total y fracciones empobrecidas en núcleos de hojas de 35Spro: EIJ1-HA, pero no cuando se usaron fracciones enriquecidas con núcleos (Figura 5B), lo que sugiere que la interacción entre EIJ1 y EDS1 ocurre en el citoplasma.

Figura 4 EIJ1 y EDS1 regulan de manera opuesta la resistencia de las plantas a los patógenos. (A) El fenotipo de resistencia a enfermedades de Col, eij1-1, eds1-22 y eij1-1 eds1-22. Se inocularon plantas de tres semanas de edad con Pst DC3000 (OD600=0.05). Las hojas mostradas fueron fotografiadas a 5 ppp. Barra=5 mm. (B) Crecimiento bacteriano de Pst DC3000 en plantas descritas en (A) a 0 y 5 ppp. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas. Las letras minúsculas indican diferencias significativas (ANOVA unidireccional, P 5 0.01, conjunto de datos suplementarios 1). (C) Examen de los niveles de H2O2 en plantas Col, eij1-1, eds1-22 y eij1-1 eds1-22. Se inocularon plantas de tres semanas de edad con Pst DC3000 o Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) y luego se tiñeron con DAB a 24 hpi. Barra=500 lm. (D) Análisis de muerte celular de plantas Col, eij1-1, eds1-22 y eij1-1 eds1-22. Se dipinocularon plantas de tres semanas con Pst DC3000 o Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) y luego se tiñeron con azul tripán a 24 hpi. Barra=500 lm.

Dado que EIJ1 regula negativamente la respuesta inmune de las plantas de una manera dependiente de EDS1-(Figura 4), a continuación examinamos el efecto de los patógenos en la interacción entre EIJ1 y EDS1. Sorprendentemente, la infección por Pst DC3000 mejoró la interacción EDS1-EIJ1 en el citoplasma en lugar de tanto en el cloroplasto como en el núcleo (Figura 5C, ver réplicas en el archivo complementario 2). Este hallazgo, junto con el patrón de distribución núcleo-citoplasmática de EDS1 y el papel de la localización nuclear de EDS1 en el refuerzo de la resistencia a patógenos a nivel transcripcional (García et al., 2010), nos obligó a investigar el papel de EIJ1 en el tráfico subcelular de EDS1 durante la infección por patógenos. Cuando expresamos transitoriamente EDS1-3FLAG en protoplastos de Arabidopsis aislados de plantas eij1-1, sobreexpresión de EIJ1 y Col-0, EIJ1 reprimió notablemente el tráfico de EDS1 hacia el núcleo (Figura 9 suplementaria). . Además, el análisis de inmunotransferencia reveló poca diferencia en la abundancia de proteína EDS1 total entre eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG y eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} }Plantas transgénicas FLAG (Figura 5D, ver réplicas en el Archivo Suplementario 2). Sin embargo, en comparación con las plantas transgénicas eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG, las plantas inoculadas con Pst DC3000- eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS13FLAG mostraron un marcado aumento. en el nivel de proteína EDS1 enriquecida en núcleos y una reducción en el nivel de EDS1 localizado en el citoplasma (Figura 5D, ver réplicas en el Archivo complementario 2), lo que confirma el papel represivo de EIJ1 en el tráfico de EDS1 del citoplasma al núcleo. A continuación, probamos si este proceso de redistribución mediado por la interacción EIJ1-EDS1 afectaba la regulación transcripcional de genes relacionados con la resistencia en las plantas. Las construcciones efectoras 35Spro: EIJ1-mCherry y 35Spro: EDS1-3FLAG se transformaron individualmente o junto con las construcciones informadoras en células epidérmicas de hojas de N. benthamiana (Figura 5E). A las 24 hpi con Pst DC3000, EDS1 activó la expresión de PR1 e ICS1 (Figura 5F), mientras que EIJ1 inhibió notablemente la expresión génica inducida por EDS1-(Figura 5F). A diferencia del EIJ1 de longitud completa, el extremo N-terminal de la proteína EIJ1, que no se ve afectado en eij1-1, no pudo inhibir la expresión de PR1 inducida por EDS1- (Figura 10 complementaria, A y B). ), lo que indica que la estructura proteica intacta de EIJ1 es necesaria para su función represiva. En conjunto, estos resultados respaldan que EIJ1 funciona como un represor esencial en la respuesta de resistencia mediada por EDS1-al regular el tráfico nucleocitoplasmático de EDS1. Debido a que la proteína EIJ1 se degradó gradualmente en plantas inoculadas con Pst DC3000-o tratadas con SA después de una rápida inducción inicial (Figura 2, H e I), investigamos si EDS1, a su vez, desencadena la degradación de EIJ1 a través de una interacción proteína-proteína. Los ensayos de degradación libre de células y los ensayos de detección de proteínas in vivo utilizando plantas transgénicas eds1-22 35Spro: EIJ1-HA mostraron que ni la ausencia ni la presencia de EDS1 afectaron la degradación de EIJ1 (Figura 11 complementaria), lo que sugiere que EDS1 no participa en la degradación de EIJ1 provocada por patógenos.

Beneficios de la cistanche tubulosa-fortalecer el sistema inmunológico

La infección por patógenos altera la localización subcelular de EIJ1

La interacción mejorada entre EIJ1 y EDS1 en el citoplasma tras la inoculación de patógenos (Figura 5, B y C) implicó una posible relocalización de EIJ1 desencadenada por patógenos en células vegetales. Para probar esta posibilidad, examinamos la localización subcelular de EIJ1 en hojas de N. benthamiana inoculadas con Pst DC3000. En condiciones no infectadas, EIJ1-mCherry se localizó en el cloroplasto y el núcleo. Sin embargo, a 24 ppp, las señales de fluorescencia disminuyeron considerablemente en los cloroplastos y aumentaron en el citoplasma (Figura 6A). Para determinar más a fondo si los patógenos desencadenan la disociación de EIJ1 del cloroplasto al citoplasma en las hojas, se realizó un análisis de inmunotransferencia de la proteína EIJ1 utilizando plantas transgénicas 35Spro:EIJ1-6HA. Se aislaron proteínas totales, proteínas de cloroplasto y proteínas citoplasmáticas de plantas transgénicas 35Spro:EIJ1-6HA a 0 y 4 hpi con Pst DC3000. La abundancia de EIJ1 aumentó notablemente en la fracción citoplasmática pero disminuyó en la fracción de cloroplasto a 24 ppp (Figura 6B, ver réplicas en el Archivo complementario 2), lo que indica una correlación negativa entre los niveles de proteína EIJ1 en el cloroplasto y el citoplasma.

Figura 5 EIJ1 interactúa con EDS1 en el citoplasma para mediar el tráfico nuclear de EDS1. (A) Análisis de expresión transitoria que muestra la localización de EDS1 y EIJ1 en protoplastos de Arabidopsis. Barra=10 lm. (B) Ensayo desplegable de interacción entre EIJ1 y EDS1. Las proteínas totales, las fracciones con núcleos empobrecidos y las fracciones con núcleos enriquecidos extraídas de plantas transgénicas eij1-1 35Spro:EIJ1-6HA de 3-semanas de edad se incubaron con proteínas GST-EDS1 o GST inmovilizadas. , respectivamente. Las IP se detectaron utilizando anticuerpos anti-HA o anti-GST. Se utilizaron PEPC e histona H3 como marcadores citoplasmáticos y nucleares, respectivamente. Los asteriscos indican las bandas de proteínas GST-EDS1. (C) La infección por Pst DC3000 mejora la interacción proteica de EDS1 y EIJ1 en el citoplasma. Las proteínas totales, las fracciones con núcleos empobrecidos, las fracciones con núcleos enriquecidos y las proteínas del cloroplasto se extrajeron de plantas EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG de 3-semanas de edad inoculadas por inmersión con Pst DC3000 (OD600=0.1) o inoculado de forma simulada a 4 hpi e inmunoprecipitado utilizando un anticuerpo anti-FLAG o un suero preinmune (IgG). Las proteínas coinmunoprecipitadas se detectaron utilizando anticuerpos anti-HA y anti-FLAG. fracciones empobrecidas en N y en núcleos; Fracciones enriquecidas con N y núcleos. Se utilizaron PEPC e histona H3 como marcadores citoplasmáticos y nucleares, respectivamente. (D) El análisis de inmunotransferencia muestra que EIJ1 media la distribución citoplasmática versus nuclear de EDS1. Las proteínas totales, las fracciones con núcleos empobrecidos y las fracciones enriquecidas con núcleos se extrajeron de 3-eds1-22 EDS1pro de 3-semanas de antigüedad: EDS1- 3FLAG y eij1-1 eds{{59 }} EDS1pro: plantas transgénicas EDS1-3FLAG inoculadas por inmersión con Pst DC3000 (OD600=0.1) o inoculadas de forma simulada a 4 hpi y detectadas usando un anticuerpo anti-FLAG. La intensidad relativa de las proteínas de eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG con el tratamiento de inoculación simulado establecido en 1. M, simulado; P, Pst DC3000. Se utilizaron PEPC e histona H3 como marcadores citoplasmáticos y nucleares, respectivamente. Los resultados presentados en (A), (C) y (D) se repitieron de forma independiente tres veces (Archivo complementario 2). (E) y (F) Análisis transitorio de la actividad del promotor PR1 e ICS1 regulada por EIJ1 y EDS1. En (E) se muestran varias construcciones utilizadas en ensayos de expresión transitoria. Se cotransformó PR1pro: GUS o ICS1pro: GUS con efectores o el vector vacío (Control) en hojas de N. benthamiana esterilizadas con Pst DC3000 (OD600=0.1) durante 24 h. En (F) se muestra la actividad relativa de GUS (GUS/luciferasa) que indica el nivel de expresión de PR1 e ICS1 regulado por varios efectores. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas (Conjunto de datos suplementarios 1). Las letras minúsculas indican diferencias significativas (ANOVA unidireccional, P 5 0.01).

La disociación de EIJ1 del cloroplasto provocada por patógenos sugiere una función potencial de EIJ1 en el citoplasma. Para probar esta posibilidad, inmovilizamos la proteína EIJ1 en los cloroplastos uniendo la secuencia dirigida al cloroplasto (CTS; Lee et al., 2008) al extremo N-terminal del gen informador EIJ1-mCherry. La fusión CTS-EIJ1-mCherry se expresó luego en hojas de N. benthamiana bajo el control del promotor nativo. Se detectó fluorescencia solo en los cloroplastos, pero no en el citosol y el núcleo de las hojas de N. benthamiana inoculadas con Pst DC3000- (Figura complementaria 12A). Esta observación confirmó que el EIJ1 CTStagged fue retenido en el cloroplasto y no fue forzado hacia el citoplasma por la infección por patógenos. Posteriormente generamos líneas transgénicas de Arabidopsis EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA para evaluar la función biológica de CTS-EIJ1 en la respuesta inmune de la planta. Como era de esperar, a diferencia de eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA, las líneas eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA no mostraron diferencias significativas en la resistencia a patógenos en comparación con eij1-1, lo que indica que EIJ1 inmovilizado en el cloroplasto no puede rescatar el fenotipo de resistencia a enfermedades de eij1-1 (Figura 6C). De acuerdo con esta observación, la expresión de PR1 se mantuvo en un nivel alto en plantas transgénicas eij1-1 EIJ1pro:CTSEIJ1-6HA, similar a eij1-1 (Figura 12B complementaria). Además, CTS-EIJ1 mostró menos capacidad para reprimir la actividad de transcripción de EDS1 que EIJ1 (Figura 6, D y E). Estos resultados nos llevaron a concluir que la respuesta temprana del huésped a la infección por patógenos desencadena la relocalización subcelular de EIJ1, que a su vez modula la respuesta inmune al reprimir el tráfico de EDS1 hacia el núcleo.

EIJ1 regula la respuesta desencadenada por el efector de virulencia

La proteína efectora AvrRps4 de P. syringae secretada por el sistema de secreción tipo III es reconocida por el receptor RPS4 TIR-NB-LRR para iniciar ETI, que depende de EDS1 (Gassmann et al., 1999; Wirthmueller et al., 2007; Heidrich et al., 2012). Inoculamos hojas de eij1-1 con el avirulento Pst DC3000 (AvrRps4) o el virulento Pst DC3000 para evaluar si EIJ1 está involucrado en ETI. Las hojas de eij1-1 mostraron mayor resistencia al virulento Pst DC3000 que las hojas de Col-0 (Figura 7A). Sin embargo, no se observó diferencia significativa entre las hojas de Col-0 y eij1-1 en la resistencia al avirulento Pst DC3000 (AvrRps4), aunque ambos genotipos mostraron mayor resistencia al avirulento Pst DC3000 (AvrRps4) que a Pst DC3000 ( Figura 3, F y G; Figura 7, A), lo que indica que EIJ1 puede no ser necesario para la ETI inducida por RPS4-. También determinamos la resistencia de las plantas a Pst DC3000 hrcC, que alberga un sistema de secreción tipo III defectuoso y no inyecta efectores en las células huésped para suprimir la PTI (Gassmann et al., 1999; Gloggnitzer et al., 2014). Tanto el mutante eij1-1 como las hojas de Col-0 mostraron una resistencia similar a Pst DC3000 hrcC (Figura 13 complementaria), lo que sugiere que EIJ1 no participa en PTI.

Dado que la acumulación nuclear de EDS1 es indispensable para la reprogramación de la expresión de genes de defensa y resistencia inducida por TIR-NB-LRR (García et al., 2010), examinamos si EIJ1 regula la distribución subcelular de EDS1 en respuesta a ETI. Se inocularon hojas de plantas 3-eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG y eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG de una semana de edad1-1eds1-22EDS1-3FLAG. con Pst DC3000 o Pst DC3000 (AvrRps4), y las fracciones con núcleos empobrecidos y enriquecidos se extrajeron a 0 y 4 hp. De acuerdo con el estudio anterior (García et al., 2010), se observó un aumento en la localización nuclear de EDS1 en plantas eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG inoculadas con Pst DC3000 (AvrRps4), pero no en los inoculados con Pst DC3000. Sin embargo, la pérdida de función de EIJ1 no afectó la acumulación nuclear de EDS1 inducida por ETI (Figura 7B; ver réplicas en el Archivo complementario 2). Esto sugiere que el avirulento Pst DC3000 (AvrRps4) desencadena el tráfico de EDS1 hacia el núcleo evitando EIJ1 o suprime la función de EIJ1 de una manera desconocida. Para probar estas posibilidades, examinamos el efecto del avirulento Pst DC3000 (AvrRps4) en el nivel de EIJ1. De manera similar a los resultados obtenidos usando líneas de sobreexpresión de EIJ1 (Figura 2H), las plantas eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA inoculadas con Pst DC3000 mostraron una mayor acumulación de EIJ1 en una etapa temprana de la infección, aunque EIJ1 fue disminuyendo gradualmente. degradado después de 8 hpi (Figura 7C; ver réplicas en el Archivo complementario 2). La acumulación de EIJ1 es suficiente para prevenir el tráfico de EDS1 desencadenado por Pst DC3000- hacia el núcleo en una etapa temprana de la infección (Figuras 5, D y 7, B). De acuerdo con este resultado, la pérdida de función de EIJ1 aceleró la translocación nuclear de EDS1 en plantas infectadas (Figura 14 complementaria). Por el contrario, Pst DC3000 (AvrRps4) abolió la función EIJ1 al inducir rápidamente la degradación de la proteína EIJ1, pero no al reprimir la transcripción del gen EIJ1 (Figura 7C; Figura 15 complementaria), promoviendo así una mayor translocación nuclear de EDS1 en la etapa temprana de la infección (Figura 7B). ). La observación de que las plantas eij1-1 inoculadas con Pst DC3000 exhibieron una resistencia comparable a la de las plantas Col-0 y eij1-1 inoculadas con el avirulento Pst DC3000 (AvrRps4) respalda esta hipótesis. Esto puede explicar, al menos hasta cierto punto, por qué la cepa avirulenta, pero no la virulenta, puede generar una resistencia reforzada para desencadenar una respuesta ETI. Por lo tanto, estas observaciones sugieren que EIJ1 está involucrado en la respuesta desencadenada por efectores de virulencia en las células huésped.

Figura 6 La relocalización de EIJ1 en el citoplasma es necesaria para la resistencia dependiente de EDS1-. (A) La infección por Pst DC3000 altera la localización subcelular de EIJ1. EIJ1-mCherry se expresó transitoriamente en hojas de N. benthamiana esterilizadas con Pst DC3000 (OD600=0.1) o inoculadas de forma simulada durante 24 h. Barra=10 lm. (B) La infección por Pst DC3000 desencadena la disociación de EIJ1 del cloroplasto. Las proteínas totales, las proteínas citoplasmáticas y las proteínas cloroplásticas se extrajeron de plantas EIJ1pro: EIJ1-6HA de 3-semanas de edad inoculadas por inmersión con Pst DC3000 (OD600=0.1) o inoculadas de forma simulada. a 4 hpi y detectado por el anticuerpo anti-HA. Se utilizaron PEPC, histona H3 y RbcL como marcadores citoplasmáticos, nucleares y cloroplásticos, respectivamente. La intensidad relativa de las proteínas con tratamiento simulado se establece en 1. Los resultados presentados en (A) y (B) se repitieron de forma independiente tres veces (Archivo complementario 2). (C) EIJ1 inmovilizado en cloroplastos no puede restaurar la resistencia de eij1-1. Se inocularon plantas de tres semanas de edad con Pst DC3000 (OD600=0.05). Se determinó el título bacteriano de Pst DC3000 a 0 y 5 ppp. CTS, señales de localización de cloroplastos. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas (Conjunto de datos suplementarios 1). (D) y (E) Análisis transitorio de la actividad del promotor PR regulada por EIJ1, CTS-EIJ1 y EDS1. En (D) se muestran varias construcciones utilizadas en ensayos de expresión transitoria. PR1pro: GUS se cotransformó con efectores o el vector vacío (Control) en hojas de N. benthamiana esterilizadas con Pst DC3000 (OD600=0.1) durante 24 h. En (E) se muestra la actividad relativa de GUS (GUS/luciferasa) que indica el nivel de expresión de PR1 regulado por varios efectores. Las barras de error representan la desviación estándar de muestras independientes por triplicado. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas. Las letras minúsculas indican diferencias significativas (ANOVA unidireccional, P 5 0.01, conjunto de datos suplementarios 1).

Figura 7 EIJ1 y EDS1 modulan la resistencia basal de la planta. (A) Crecimiento bacteriano del mutante Col y eij1-1. Se inocularon plantas de tres semanas de edad con Pst DC3000 o Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.05). Se determinó el título bacteriano de Pst DC3000 a 0 y 5 ppp. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas. Las letras minúsculas indican diferencias significativas (ANOVA unidireccional, P 5 0.01, conjunto de datos suplementarios 1). (B) EIJ1 apenas afecta la acumulación de EDS1 desencadenada por Pst DC3000 (AvrRps4) en los núcleos. Se extrajeron fracciones con núcleos empobrecidos y fracciones enriquecidas de 3-eds1-22 EDS1pro de 3-semanas de antigüedad: EDS1-3FLAG y eij1-1 eds1-22 EDS1pro: Plantas transgénicas EDS1-3FLAG inoculadas por inmersión con Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1), o inoculadas simuladamente a 4 hpi, y detectadas usando un anticuerpo anti-FLAG. Se utilizaron PEPC e histona H3 como marcadores citoplasmáticos y nucleares, respectivamente. La intensidad relativa de proteínas de plantas con tratamiento simulado se fijó en 1, M, simulado; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) La infección por Pst DC3000 (AvrRps4) promueve la degradación de la proteína EIJ1. Las proteínas totales se extrajeron de plantas eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA de 3-semanas de edad inoculadas por inmersión con Pst DC3000 o Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1). , y se detecta mediante un anticuerpo anti-HA. El panel inferior muestra la tinción con Coomassie Brilliant Blue (CBB) como control de carga. Los resultados representativos presentados en (B) y (C) se repitieron de forma independiente dos veces más y se sondaron con un anticuerpo anti-ACTINA como control de carga (Archivo complementario 2). (D) Modelo hipotético de EIJ1 que regula la resistencia basal de la planta dependiente de EDS1-. Cuando las plantas son invadidas por patógenos, EIJ1 se libera rápidamente del cloroplasto al citoplasma donde interactúa con EDS1. La interacción EIJ1-EDS1 impide el transporte de EDS1 desde el citoplasma al núcleo y, por lo tanto, restringe la resistencia nuclear de EDS1, lo que permite la modulación de las respuestas inmunitarias mediadas por EDS1-. Las líneas con flechas y romas indican activación y represión, respectivamente.

Discusión

Para maximizar la supervivencia, las plantas han desarrollado un mecanismo preciso para optimizar el crecimiento y defenderse contra patógenos invasores, aunque numerosos detalles de estos mecanismos aún no están claros. EDS1 ocupa una posición clave en la red de señalización de inmunidad innata de la planta, ya que regula la resistencia a patógenos biotróficos y hemibiotróficos (Wiermer et al., 2005). En este estudio, identificamos un gen, EIJ1, que codifica una proteína acompañante DnaJ, y demostramos que EIJ1 responde a la infección temprana por patógenos y desempeña un papel en la inmunidad innata de las plantas al interactuar directamente con EDS1. Con base en estos hallazgos, proponemos un modelo regulatorio para EIJ1 (Figura 7D). Cuando las plantas son invadidas por patógenos, EIJ1 se libera rápidamente del cloroplasto al citoplasma, donde interactúa con EDS1. Esta interacción EIJ1-EDS1 evita el transporte de EDS1 desde el citoplasma al núcleo, y esto restringe la resistencia nuclear de EDS1, lo que permite la modulación de las respuestas inmunes mediadas por EDS1-, como la inducción de la biosíntesis de SA y la expresión de resistencia. -genes relacionados. Cuando las plantas sufren estímulos continuos de patógenos invasores, EIJ1 se degrada gradualmente, lo que lleva a una mayor acumulación nuclear de EDS1 para reforzar la resistencia. Estos hallazgos ilustran un papel represivo esencial de EIJ1 durante la respuesta temprana del huésped a la invasión de patógenos, llenando el vacío en nuestra comprensión de cómo se regula la localización subcelular de EDS1 para conferir resistencia.

El análisis de secuencia reveló que EIJ1 es una proteína DnaJ. El genoma de Arabidopsis codifica siete tipos clásicos diferentes de proteínas DnaJ (Pulido y Leister, 2018). Estudios anteriores muestran que las proteínas DnaJ desempeñan funciones importantes y distintas en la inmunidad de las plantas. Por ejemplo, la GmHSP40 de soja (Glycine max) regula positivamente la muerte celular y la resistencia a enfermedades (Liu y Whitham, 2013). Por el contrario, la proteína Os-DjA6 del arroz (Oryza sativa L.) regula negativamente la inmunidad innata de las plantas a través de la vía de degradación del proteosoma mediada por la ubiquitinación (Zhong et al., 2018). El efector de virulencia Hopl1 específico de P. syringae, que contiene un dominio J, está dirigido al cloroplasto, donde interactúa con la maquinaria de respuesta al estrés de la planta (Jelenska et al., 2007). Estos estudios demuestran que las proteínas DnaJ desempeñan diversas funciones en la respuesta de defensa de las plantas. Tsip1, una proteína DnaJ de N. tabacum homóloga a EIJ1, regula la activación transcripcional de genes mediada por Tsi1-en respuesta al estrés (Ham et al., 2006). Tsi1 codifica un factor de transcripción de tipo APETALA2 (AP2) que funciona como un regulador importante en las respuestas al estrés tanto biótico como abiótico en N. tabacum (Park et al., 2001). SA desencadena la relocalización de Tsip1 desde el cloroplasto al citoplasma, lo que facilita la interacción entre Tsip1 y Tsi1 y la posterior entrada del complejo Tsip1-Tsi1 al núcleo para la activación transcripcional de genes relacionados con el estrés (Ham et al., 2006). . A diferencia de Tsip1, EIJ1 se localizó en el cloroplasto y el núcleo en condiciones normales en este estudio. Demostramos que la infección por patógenos desencadena la relocalización de EIJ1 desde el cloroplasto al citoplasma y que la interacción entre EIJ1 y EDS1 en el citoplasma inhibe la resistencia nuclear mediada por EDS1-. De acuerdo con este hallazgo, el mutante eij1 con pérdida de función mostró una mayor resistencia a los patógenos que el tipo salvaje (Col-0). Esto confirma que EIJ1 desempeña un papel negativo en la inmunidad innata de las plantas. Según estudios previos, las actividades nucleares y citoplasmáticas coordinadas de EDS1 son esenciales para que las plantas completen la respuesta inmune innata a los patógenos (García et al., 2010; Heidrich et al., 2011). La localización nuclear de EDS1 es necesaria para que la reprogramación transcripcional de resistencia inducida por TNL induzca respuestas de defensa de las plantas relacionadas con SA y otras respuestas (Wirthmueller et al., 2007). El conjunto citoplasmático de EDS1 también se mantiene durante el proceso de infección para lograr una resistencia completa a los patógenos (García et al., 2010). Estas observaciones plantean una preocupación significativa sobre cómo las plantas regulan con precisión la asignación de EDS1 entre el citoplasma y el núcleo para respuestas de defensa adecuadas cuando se enfrentan a una infección por patógenos. Aquí, mostramos que la asignación precisa de EDS1 a diferentes compartimentos subcelulares está regulada en parte por EIJ1 mediante la interacción proteína-proteína. La mutación de pérdida de función de EIJ1 promovió notablemente el tráfico de EDS1 al núcleo (Figuras 5, D y 7, B), lo que llevó a una mayor resistencia a la enfermedad.

Debido a que EIJ1 se indujo rápidamente en una etapa temprana de la infección por patógenos y posteriormente se degradó durante el desarrollo de la enfermedad, especulamos que EIJ1 es un importante regulador negativo de la inmunidad que permite a las plantas refinar sus defensas óptimas. La represión mediada por EIJ1-de la actividad de EDS1 podría prevenir la provocación de respuestas inmunes innecesarias a la estimulación a corto plazo, como un ataque ocasional de bacterias patógenas. Alternativamente, las bacterias patógenas pueden manipular la inmunidad del huésped al desencadenar la disociación de EIJ1 del cloroplasto, probablemente mediante la secreción de efectores virulentos. No pudimos excluir la posibilidad de que EIJ1 realice una función desconocida en el cloroplasto. Como sabemos, la SA, una hormona vegetal y molécula de señalización implicada en la resistencia a patógenos biotróficos, se biosintetiza principalmente en el cloroplasto y luego se exporta al citoplasma mediante EDS5, un transportador de toxinas y multifármacos (Serrano et al., 2013). Es probable que EIJ1 sea un regulador negativo de la acumulación de SA, ya que reguló negativamente la expresión del gen biosintético de SA ICS1 tras la inoculación del patógeno (Figura 4E). Además de la represión transcripcional mediada por EIJ1-a través de su interacción con EDS1, es posible que EIJ1 también desempeñe un papel directo en la biosíntesis de SA o el transporte de SA desde el cloroplasto de una manera no identificada. No sería sorprendente que en un estudio futuro se descubriera que EIJ1 y el proceso de biosíntesis de SA están conectados. Curiosamente, EIJ1 también estaba localizado en el núcleo. Aunque EIJ1 no interactuó con EDS1 en el núcleo, probablemente debido a la falta de cofactores o modificaciones esenciales, la función de EIJ1 localizado en el núcleo merece una mayor investigación.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Las bacterias patógenas producen efectores intracelulares para subvertir la PTI del huésped al atacar proteínas de resistencia a patógenos como las PRR, mientras que los receptores citoplasmáticos tipo NOD de las plantas detectan estos efectores para iniciar la ETI (Dou y Zhou, 2012; Khan et al., 2016). Estudios anteriores y nuestros resultados mostraron que el avirulento Pst DC3000 (AvrRps4) promueve el tráfico del EDS1 citoplasmático hacia el núcleo (García et al., 2010). Además, nuestros resultados no mostraron diferencias significativas en la acumulación nuclear de EDS1 desencadenada por Pst DC3000 (AvrRps4) y la posterior resistencia a patógenos entre las plantas mutantes Col-0 y eij1-1 (Figura 7, A y B). . Además, la resistencia exhibida por el mutante eij1-1 fue comparable a la exhibida por las plantas Col-0 inoculadas con la cepa Pst DC3000 hrcC con sistema de secreción defectuoso tipo III (Figura 12 complementaria). Además, la acumulación de EIJ1 fue notablemente menor en plantas inoculadas con Pst DC3000 avirulento (AvrRps4) que en plantas inoculadas con Pst DC3000 virulento (Figura 7C), lo que indica que EIJ1 es un regulador esencial de la respuesta inmune desencadenada por efectores de virulencia en las células huésped. Debido a que las plantas eij1-1 inoculadas con Pst DC3000- imitaron el fenotipo de resistencia de las plantas Col-0 inoculadas con Pst DC3000 (AvrRps4) (Figuras 3, F, G, 4, C, D y 7, A), EIJ1 puede funcionar como una barrera para prevenir la inducción de ETI por cepas virulentas. En conclusión, hemos identificado EIJ1, una proteína acompañante DnaJ, y hemos demostrado que participa en una respuesta inmune temprana a patógenos vegetales. La interacción entre EIJ1 y EDS1 reprime el tráfico nuclear de EDS1, probablemente para evitar la estimulación a corto plazo por respuestas inmunes innecesarias de las plantas, para facilitar la invasión patógena mediante un mecanismo de manipulación, o ambos. Independientemente del mecanismo subyacente, el alelo EIJ1 podría emplearse como un objetivo potencial eficaz para la modificación de la inmunidad innata de las plantas en el mejoramiento de la resistencia a enfermedades. Debido a que EIJ1 no afecta el crecimiento normal de las plantas, la atenuación de la función de EIJ1 mediante la edición del genoma podría elevar de manera destacada el nivel de resistencia de los cultivos a las enfermedades con poco efecto sobre el crecimiento.

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