PARTE Ⅰ: Efecto de los extractos de Cistanche Tubulosa sobre la función reproductora masculina en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina-nicotinamida

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Zwe-Ling Kong® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He y Shu-Chun Cheng

Resumen:La diabetes es un trastorno crónico caracterizado por hiperglucemia debido a la disminución de los niveles de insulina oa la ineficiencia del tejido para usarla de manera efectiva. La infertilidad es conocida como un resultado importante de la diabetes y afecta el sistema reproductivo masculino al causar deterioro de los espermatozoides y disfunción gonadal.Cistanche tubulosaes una planta parásita que tiene la capacidad de mejorar la memoria, la inmunidad y la capacidad sexual, reducir la impotencia y minimizar el estreñimiento. Este estudio se centró en la investigación de los efectos antiinflamatorios y protectores del equinacósido (ECH) enExtracto de Cistanche tubulosa(CTE) en el sistema reproductor masculino de ratas diabéticas. Los efectos antioxidantes, antiinflamatorios y protectores de la CTE se evaluaron mediante métodos in vitro e in vivo. Los resultados in vitro muestran que la ECH inhibió la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y mejoró la expresión de las proteínas StAR, CYP11A1, CYP17A1 y HSD17p3. El análisis in vivo se realizó con tres dosis de equinacósido (ECH) (80, 160 y 320 mg/kg) en CTE. En total, se administraron 0,571 mg/kg de rosiglitazona (RSG) como control positivo. La diabetes fue inducida por estreptozotocina (STZ) (65 mg/kg) y nicotinamida (230 mg/kg) en combinación con una dieta rica en grasas (45 por ciento). Los estudios in vivo confirmaron que la ECH mejoró los niveles de azúcar en la sangre, la resistencia a la insulina, la resistencia a la leptina y la peroxidación lipídica. Puede restaurar la kisspeptina 1 (KiSS1), el receptor acoplado a proteína G GPR 54, el supresor de la señalización de citocinas 3 (SOCS-3) y la expresión del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de la sirtuina 1 (SIRT1) en el hipotálamo y recuperar el sexo nivel hormonal Por lo tanto, este estudio confirmó los efectos antioxidantes, antiinflamatorios y esteroidogénicos de la ETC.

Palabras clave:diabetes; esterilidad;Extracto de Cistanche tubulosa (CTE); equinacósido (ECH); actividad antiinflamatoria; actividad antioxidante; efectos de la esteroidogénesis

Tratamiento para la diabetes:Extracto de Cistanche tubulosa(CET)

1. Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una condición en la que hay un aumento de los niveles de glucosa en la sangre debido a la ineficiencia del páncreas para producir suficiente insulina, o la incapacidad del cuerpo para usarla de manera efectiva. Según la OMS, el número de personas con diabetes aumentó de 108 millones en 1980 a 422 millones en 2014 [1]. Hay cuatro categorías principales: prediabetes (una etapa anterior a la diabetes), tipo 1 (donde el páncreas no produce insulina), tipo 2 (el cuerpo no usa insulina) y diabetes gestacional (que ocurre durante el embarazo). El estrés oxidativo ocurre debido al desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y antioxidantes [2] que finalmente conducen a la condición diabética. Las complicaciones de la diabetes incluyen insuficiencia renal, daño a los nervios, ceguera, accidente cerebrovascular, ataque al corazón, muerte fetal e infertilidad. [1]. Los estudios muestran que los núcleos espermáticos, el ácido desoxirribonucleico (ADN) y las mitocondrias se dañaron significativamente en pacientes diabéticos masculinos [3]. El estrés oxidativo durante el transporte de esperma alterará el proceso del sistema reproductivo masculino [4,5].

El proceso de espermatogénesis está controlado por el eje hipotálamo-pituitario-gonadal (HPG). La hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) producida por el hipotálamo estimula la producción de la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH). Las células de Leydig se encuentran adyacentes al túbulo seminífero y producen testosterona bajo el control de la LH. FSH desencadena la producción de proteína de unión a antígeno (ABP) que ayuda a pasar la hormona masculina. Así, la infertilidad y otros problemas surgen principalmente debido a las alteraciones que se producen en el eje HPG. La administración de la combinación de estreptozotocina-nicotinamida induce diabetes en ratas de experimentación. La estreptozotocina es un compuesto químico tóxico para las células p productoras de insulina en el páncreas y la nicotinamida es una vitamina soluble en agua que protege a las células p del daño total [6].

Cistanche tubulosa es una especie de planta del desierto también conocida como "Rou Cong-Rong" [7]. Es una planta parásita no clorofílica que crece principalmente en la raíz del árbol Calotropis Procera y está ampliamente distribuida en las tierras áridas de Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolia, Irán e India. El nombre común de Cistanche tubulosa es "Jacinto del desierto". Es ampliamente aceptado en la medicina tradicional china y se le ha dado el nombre de "Ginseng del Desierto". Es ampliamente utilizado en el campo de la medicina para tratar la leucorrea mórbida, la metrorragia profusa, las enfermedades renales crónicas, el estreñimiento, la impotencia y la infertilidad. Constituyentes químicos deCistanche tubulosaconsisten en glucósidos feniletanoides no volátiles (PHG), iridoides, lignanos, aceites volátiles, alditoles, oligosacáridos y polisacáridos [8]. Los estudios muestran que el equinacósido de esta hierba protege el fibroblasto dañado al regular los niveles de ROS [9]. Este compuesto produce actividades antioxidantes, vasorrelajantes y antiinflamatorias junto con neuroprotección y prevención de la osteoporosis [10,11].

Este estudio tuvo como objetivo investigar laefecto del extracto de Cistanche tubulosaque contiene ECH en la disfunción reproductiva de la rata diabética inducida por estreptozotocina-nicotinamida.

Cistanche tubulosa

2. Materiales y métodos

2.1.Materiales

ECH y CTE se adquirieron de Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwán). Los productos finales de glicación avanzada (AGE) se adquirieron de Biovision (San Francisco, CA, EE. UU.). Las líneas celulares LC-540 y TM3 se compraron del Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria (Hsinchu, Taiwán). Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de cinco semanas de edad del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Feed Lab Diet® se adquirió de PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwán). 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). El metanol y el ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) también se adquirieron de Sigma. El medio Eagle modificado por Dulbecco/F12 y la tripsina-EDTA se obtuvieron de GIBCO (Nueva York, NY, EE. UU.). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT), diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA), el dimetilsulfóxido (DMSO) y el nitroazul de tetrazolio (NBT) se adquirieron de Sigma. Los kits enzimáticos de glucosa se obtuvieron de Kyokutoseiyaku, Tokio, Japón. Los kits de insulina ELISA se adquirieron de Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Suecia). El reactivo de extracción de proteínas tisulares T-PER se adquirió de Thermo Scientific (Chicago, IL, EE. UU.). Los anticuerpos policlonales anti-humano/ratón/factor nuclear-kappa B NF-kB se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU. Los anticuerpos policlonales anti-ratón/receptor de rata para productos finales de glicación avanzada (RAGE), anticuerpos policlonales anti-humano/ratón/rata StAR y anticuerpos monoclonales anti-humano/ratón/rata citocromo P450 17A1 se adquirieron de Gene Tex (Irvine, CA, EE. UU.). Los anticuerpos policlonales anti-humano/ratón/rata CYP11A1 se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, PA, EE. UU.). El reactivo easy-Blue se adquirió de Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, EE. UU.). La agarosa y el marcador de ADN de 100 pb se obtuvieron de Promega, Corporation (Madison, WI, EE. UU.). El kit RNeasy Lipid Tissue Mini se adquirió de QIAGEN, Hilden, Alemania.

2.2.Métodos

2.2.1. Análisis in vitro

LC{{0}} y cultivo celular TM3: Las líneas celulares LC-540 se cultivaron a 37 °C en medio de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) suplementado con bicarbonato de sodio (1,5 g/L), L -glutamina (2 mM), aminoácidos no esenciales (0.1 mM), piruvato de sodio (1.0 mM) y suero bovino fetal (FBS) (10 por ciento) en un 5 por ciento de incubadora de CO2 (incubadora de CO2, Napco 5410, Taiwán). La línea celular TM3 se cultivó en medio Eagle modificado por Dulbecco/s (DMEM) suplementado con glucosa (4,5 g/L), piruvato de sodio (0,5 mM), L-glutamina (2,5 mM), bicarbonato de sodio (1,2 g/L), 4-(2-hidroxietil)-1-ácido piperazinaetanosulfónico (HEPES, 15 mM) y suero fetal de ternero (FCS, 10 por ciento) o suero de caballo (5 por ciento) a 37 °C en un 5 porcentaje de incubadora de CO2.

Determinación de la viabilidad celular del equinacósido (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- bromuro de difeniltetrazolio (MTT) fue utilizado para el ensayo de viabilidad celular. La concentración de células se ajustó a 2 x 105 células/mL en una placa de 96-pocillos. Luego, se agregaron 20 μL de ECH (diluidos en 2 por ciento de medio) y se incubaron durante 24 h a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 por ciento. Posteriormente, se agregaron 100 μL de reactivo MTT y se incubaron durante 4hat37 OC en condiciones de oscuridad. La absorbancia se midió a 570 nm (lector ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Suiza).

Restive CeH viabiHiy (porcentaje)=[(Amuestra a 570 nm — Ablanco a 570 nm)]/[(Acontrol a 570 — Ablanco a 570)] x 100.

Ensayo de reducción de nitroazul tetrazolio (NBT) y ensayo de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH): el número de células se ajustó a 1x 1{{10}}6 células/mL . Luego, se agregaron 50 mg/mL de ECH, resveratrol (RES) y productos finales de glicación avanzada (AGE) (control) y se cocultivaron durante 18 h a 37 °C. Luego, se agregaron 0,3 ml de solución de NBT (0,1 mg/ml de NBT, 5 % de FBS y 3 % de dimetilsulfóxido (DMSO) disueltos en 10 ml de DMEM) y se incubó a 37 °C en 5 % de CO2 durante 1 h. Después de la centrifugación (a 800 xg durante 3 min), se eliminó el sobrenadante y se agregaron 200 µL de DMSO y se agitó durante 5 min en un oscilador ultrasónico (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwán). La absorbancia se midió a 630 nm. Para el ensayo de radicales DPPH, se tomó Trolox (en alcohol al 95 por ciento) como estándar. Luego, se mezclaron 75 µL de solución de DPPH 0,5 mM con 25 µL de muestras y se dejó reaccionar a temperatura ambiente en un lugar oscuro durante 30 min. La mezcla se agitó y se midió la absorbancia a 517 nm.

Análisis del contenido de especies reactivas de oxígeno (ROS): el número de células se ajustó a 2 x 105 células/mL en una 12-placa de pocillos que contenía FBS al 2 por ciento. Luego, se agregaron a la placa 50 μL/mL de ECH, RES y AGE y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Después de 24 h, se añadió 2Z,7Z-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) y se incubó a 37 °C durante 30 min. Después de la centrifugación (400 x g, 5 min), se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después, las células se suspendieron en 1 ml de PBS y los niveles de ROS se determinaron utilizando un citómetro de flujo (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, EE. UU.).

Identificación y Análisis Cuantitativo de Proteínas: Las proteínas se extrajeron utilizando el reactivo de extracción de proteínas (T-PER). La densidad celular se ajustó a 2 x 105 células/ml en una placa de pocillos 12-y se añadieron 50 μl/ml de ECH, RES y un receptor para el antagonista del producto final de glicación avanzada (RAGE), y AGE. se incubaron a 37 OC en una incubadora con CO2 al 5 por ciento durante 24 h. Después, se añadieron 400 µl de T-PER, se rasparon las células y se centrifugaron a 125,000xg durante 20 min (4 OC). El sobrenadante se recolectó y almacenó en -80 OC (congelador -80 OC, Nuaire, Plymouth, MN, EE. UU.) para su posterior análisis. Se utilizó el kit de ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteínas. A continuación, se añadieron 10 µL de solución celular estándar y 200 µL de reactivo BCA a 8-placas de pocillos y se incubaron a 37 °C en un incubador con CO2 al 5 % durante 30 min. La absorbancia se midió a 562 nm. El análisis de identificación de proteínas se realizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS) (SDS-PAGE). Las muestras se prepararon añadiendo lisado de proteínas al tampón de carga de proteínas y se realizó un análisis de transferencia Western para detectar las proteínas específicas.

2.2.2.Análisis in vivo

Diseño de modelo animal: Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de {{0}}semanas de edad del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Cada rata se alojó individualmente en jaulas desinfectantes de acero inoxidable a temperatura controlada (23 °C 1 grado) y humedad (40-60 por ciento) con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se proporcionó alimento y agua ad libitum. Cada rata se domesticó en la primera semana y se le administró la dieta de roedores de laboratorio 5001 como dieta principal. Todos los procedimientos siguieron el estándar del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Aprobación IACUC No. 101026) de la Universidad Nacional del Océano de Taiwán, Taiwán. Después de la domesticación, las ratas se dividieron en dos grupos: el grupo de control (Con) que se alimentó con la dieta de laboratorio 5001 y el grupo diabético que se alimentó con una dieta alta en grasas (HFD, 40 por ciento) durante todo el experimento. Después de ser alimentadas con HFD durante 4 semanas, a las ratas del grupo diabético se les inyectó estreptozotocina (65 mg/kg) (STZ) para inducir diabetes mellitus (DM). Dentro de los 15 minutos de la inyección de STZ, se inyectó nicotinamida (230 mg/kg de peso corporal). Una semana después de la inyección, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) para determinar la inducción exitosa de Mellitus diabético (DM). Posteriormente, los animales se dividieron en seis grupos: el control (alimentado con dieta de laboratorio 5001); grupo DM (DM más 45 por ciento HFD); grupo DMR (DM más rosiglitazona: 0,571 mg/kg BW) más 45 por ciento HFD; grupo DME1 (DM más CTE: 80 mg/kg BW) más 45 por ciento HFD; grupo DME2 (DM más CTE: 160 mg/kg BW) más 45 por ciento HFD; y grupo DME4 (DM más CTE: 320 mg/kg BW) más 45 por ciento HFD. Como control positivo se tomó rosiglitazona (RSG). Se utilizaron tres dosis de CTE (80, 160 y 320 mg/kg) de acuerdo con la recomendación de las pautas de evaluación funcional de alimentos saludables de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Taiwán (TFDA). Los tratamientos se dieron hasta el final del experimento. Todas las ratas experimentales se sacrificaron después de 6 semanas. La sangre que se recogió de las ratas se centrifugó a 3000 rpm durante 15 min a 4 grados.

Mian ingredientes efectivos de cistanche tubulosa

El sobrenadante se examinó para el siguiente análisis

Determinación de glucosa total, triglicéridos y colesterol: La determinación de glucosa se realizó mediante kits enzimáticos de glucosa. Luego, se agregaron 20 \mu l de muestras de plasma sanguíneo a los reactivos y se mantuvieron a 37 °C durante 5 min. Los triglicéridos totales y la concentración de colesterol total se determinaron utilizando kits enzimáticos de triglicéridos y colesterol. Luego, se agregaron 10 ^L de plasma sanguíneo a los reactivos y el experimento se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 510 nm.

Glucosa/triglicéridos/colesterol totales en plasma (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200.

Una muestra: Absorbancia de muestras de sangre, ABlanco: Valor de absorbancia de kits sin muestra, A estándar: Valor de absorbancia del reactivo estándar, 200: reactivos estándar a una concentración de 200 mg/dL.

Insulina, leptina y evaluación del modelo homeostático: determinación de la resistencia a la insulina (HOMA-IR): El nivel de insulina se determinó mediante kits ELISA de insulina. Aquí, se añadieron 25 \mu l de plasma sanguíneo a los reactivos y se midió la absorbancia a 450 nm. El contenido total de leptina se determinó usando un kit de ensayo inmunométrico de enzima de leptina. Luego, se analizaron 100 plasmas y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector ELISA. Todo el experimento se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El valor HOMA-IR se determinó a partir de la ecuación de evaluación del modelo de homeostasis=concentración de insulina plasmática en ayunas (mU/mL) x concentraciones de glucosa en plasma en ayunas (mmol/L)/22,5.

Peroxidación de lípidos en plasma: Aquí, {{0}}.5 mL de plasma sanguíneo se mezclaron con 1 mL de reactivo (15 por ciento, p/v de ácido tricloroacético en 0.25 N ácidos clorhídricos (HCl ) y 0,375 por ciento, p/v de ácido tiobarbitúrico en HCl 0,25 N) y se colocó en un baño de agua (Water Bath, BUCHI461, Zúrich, Suiza) a 100 grados C durante 15 min. Después de enfriar, se añadió 1 mL de n-butanol, se agitó vigorosamente y se centrifugó a 1500 xg durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y se midió la absorbancia a 532 nm [12].

Concentración de malondialdehído (MDA) (nM/mL)=[(Amuestra a 532 nm - Ablanco a 532 nm)/ (Aestándar a 532 nm - Ablanco a 532 nm)] x 5.

Determinación de los niveles plasmáticos de testosterona y hormona luteinizante (LH): Se usó el kit ELISA de testosterona para medir el nivel de testosterona en el plasma sanguíneo. Se utilizó el kit RIA para determinar la concentración de LH. Luego, se agregaron 50 µL de plasma y los cálculos se basaron en la concentración de la hormona LH-RP-3 (estándar). Los pasos posteriores se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Determinación del factor de necrosis tumoral (TNF)-a y la concentración de interleucina-6 (IL-6): el anticuerpo capturado se diluyó 250 veces en tampón de recubrimiento, se agregó a un {{4} placa de pocillos (100 µl/pocillo) y se mantuvo a 4 grados C durante la noche. El sobrenadante se aspiró y se lavó cinco veces con tampón de lavado (1 vez PBS, 0,05 por ciento de Tween 20). Después de la incubación (1 h) con 200 ^g de diluyente de ensayo, las células se lavaron 5 veces con tampón de lavado y se añadieron 100 ^L de solución estándar de TNF-a o muestras de prueba a cada pocillo y se incubaron durante 2 h. Después del lavado, se añadieron 100 μl de anticuerpos detectados por IL-6 y se incubaron a temperatura ambiente. El sobrenadante fue aspirado y lavado 5 veces. Luego, se añadieron 480 RL de la enzima avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró y se lavó cinco veces con tampón de lavado. Luego, se agregaron 100 RL de solución de sustrato y se incubaron por 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregaron a cada pocillo 50 RL de solución de parada (ácido fosfórico 1 M) y se midió la absorbancia a 450 nm.

El beneficio de Cistanche Echinacoside: Anti-oxidación

Análisis de Parámetros de Espermatozoides y Testículos

Recolección de muestras de esperma: La recolección de muestras de esperma se realizó de acuerdo con el método informado anteriormente en [13]. Los espermatozoides se recogieron del sobrenadante y se usaron para análisis posteriores.

La cantidad de espermatozoides, la motilidad de los espermatozoides y los espermatozoides anormales: la cantidad de espermatozoides se calculó utilizando el hemocitómetro y la solución de azul tripán. Luego, 100 RL de líquido de esperma se mezclaron con una solución de azul de tripano y se calculó el número de espermatozoides, la motilidad y los espermatozoides anormales utilizando un hemocitómetro y un microscopio [14].

Reducción de NBT de tetrazolio azul nitro y peroxidación lipídica de esperma y testículos: La peroxidación lipídica y la reducción de NBT se analizaron de acuerdo con el mismo procedimiento de análisis de plasma.

Determinación de la actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa: Se analizó la actividad de superóxido dismutasa (SOD) utilizando el kit RANSEL. Aquí, se agregaron {{0}}.05 ml de homogeneizados testiculares a 1,7 ml de solución de reacción (0xantina 0,05 mM, 0,025 mM 2-({ {9}}yodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-cloruro de feniltetrazolio (INT)). Después de mezclar, se añadieron 0,25 ml de xantina oxidasa (80 U/L) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 sa temperatura ambiente. La absorbancia se midió a 505 nm. La concentración de proteínas del homogeneizado testicular se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad DC y se calculó su actividad específica (U/mg de proteína). La actividad de catalasa (CAT) se determinó de acuerdo con un método informado previamente [15].

Tinción H&E (hematoxilina y eosina)

Los testículos se empaparon en formalina al 10 por ciento durante 24 horas y se almacenaron a 4 grados C. Se cortaron los tejidos en micro y se adhirieron al portaobjetos. Después de la fijación (metanol al 95 % más ácido acético al 5 %), los portaobjetos se sumergieron en hematoxilina durante 3 min, se lavaron con agua corriente durante 5 min y luego se empaparon con alcohol al 50 %, 70 % y 90 % durante un minuto. Después de eso, los portaobjetos se tiñeron con eosina durante 10 s y se empaparon en alcohol al 100 % durante un minuto hasta que se desvanecieron. Finalmente, el portaobjetos se empapó en xileno durante un minuto. Posteriormente, el portaobjetos se secó al aire y se selló. El tubo teñido se colocó en un microscopio de contraste de fase invertido (Microscopio de diferencia de fase invertida, Olympus CK-2, Tokio, Japón) para observar la morfología.

Análisis del Hipotálamo

El KISS1 de ratón, el receptor acoplado a proteína G (GPR) 54, el supresor de la señalización de citocinas 3 (SOCS-3) y las secuencias del gen sirtuina 1 (SIRT1) se identificaron a partir de la base de datos de genes del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) y se diseñó un primer específico utilizando Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EE. UU.). Los cebadores utilizados en el experimento se enumeran en la Tabla 1.

Extracción de ácido ribonucleico (ARN) del hipotálamo. La extracción de ARN del hipotálamo del cerebro se llevó a cabo utilizando el RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Los ARNm obtenidos se midieron cuantitativamente mediante transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN complementario obtenido del análisis RT se almacenó a -20 grados para su uso posterior. El ADN extraído se sometió a análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando polimerasa Taq. Luego, se tomaron 5~10 ^L del producto de PCR y se analizaron por electroforesis en un coloide de agar al 1,5 por ciento. La imagen fue tomada en un sistema de imágenes UVP BioDoc-It. Se tomó ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) transcrito de forma inversa y se realizó una PCR con el kit IQ SYBR Green Supermix. Posteriormente, se analizó con el Software del Sistema Óptico iQTM 5. Las proteínas se extrajeron utilizando un reactivo de extracción de proteínas (T-PER). Luego, se agregaron 20 mg de homogeneizado testicular a 400 ^L de T-PER y se centrifugaron (High Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Alemania) a 4 grados (125,000 xg) durante 20 minutos. El siguiente método fue similar al análisis in vitro de "identificación y análisis de cuantificación de proteínas".

2.3.Análisis estadístico

Los resultados experimentales se expresaron como la desviación estándar media 土 (Mean 土 SD) y los datos se analizaron utilizando el software Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, Nueva York, NY, EE. UU. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA). Se analizaron múltiples comparaciones de diferentes grupos mediante la prueba de Duncan al valor de p < 0.05="" como="" nivel="">

SIGUIENTE PARTE Ⅱ CONTINUARÁ