Efecto de los extractos de Cistanche tubulosa sobre la función reproductiva masculina en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina y nicotinamida-Ⅰ

1. Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una condición en la que hay un aumentoniveles de glucosaen la sangre debido a la ineficiencia del páncreas para producir suficiente insulina o a la incapacidad del cuerpo para utilizarla eficazmente. Según la OMS, el número de personas con diabetes aumentó de 108 millones en 1980 a 422 millones en 2014 [1]. Hay cuatro categorías principales: prediabetes (una etapa anterior a la diabetes), tipo 1 (donde el páncreas no produce insulina), tipo 2 (el cuerpo no usa la insulina) y diabetes gestacional (que ocurre durante el embarazo). El estrés oxidativo ocurre debido al desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y antioxidantes [2], lo que finalmente conduce a la condición diabética. Las complicaciones de la diabetes incluyen insuficiencia renal, daño a los nervios, ceguera, derrame cerebral, ataque cardíaco, muerte fetal e infertilidad. [1]. Los estudios muestran que los núcleos de los espermatozoides, el ácido desoxirribonucleico (ADN) y las mitocondrias sufrieron daños significativos en pacientes diabéticos masculinos [3]. El estrés oxidativo durante el transporte de esperma alterará el proceso del sistema reproductivo masculino [4,5].

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA MEJORAR LA FUNCIÓN SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

El proceso de espermatogénesis está controlado por el eje hipotálamo-hipófisis-gonadal (HPG). La hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) producida por el hipotálamo estimula la producción de la hormona luteinizante (LH) y la hormona folículo estimulante (FSH). Las células de Leydig se encuentran adyacentes al túbulo seminífero yproducir testosteronabajo el control de LH. La FSH desencadena la producción de proteína de unión a antígeno (ABP) que ayuda a pasar la hormona masculina. Así, la infertilidad y otros problemas surgen principalmente debido a las alteraciones que se producen en el eje HPG. La administración de la combinación de estreptozotocina-nicotinamida induce diabetes en ratas experimentales. La estreptozotocina es un compuesto químico tóxico para las células productoras de insulina en el páncreas y la nicotinamida es una vitamina soluble en agua que protege las células de un daño total [6].

Cistanche tubulosa es una especie de planta del desierto también conocida como "Rou Cong-Rong" [7]. Es una planta parásita no clorofílica que crece principalmente en la raíz del árbol Calotropis procera y está ampliamente distribuida en las tierras áridas de Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolia, Irán e India. El nombre común de Cistanche tubulosa es "Jacinto del desierto". Es ampliamente aceptado en la medicina tradicional china y se le ha dado el nombre de "Ginseng del Desierto". Se utiliza ampliamente en el campo medicinal para tratar la leucorrea mórbida, metrorragia profusa, enfermedades renales crónicas, estreñimiento, impotencia e infertilidad. Componentes químicos deCistanche tubulosa consiste en glucósidos feniletanoides no volátiles(PHG), iridoides, lignanos, aceites volátiles, alditoles, oligosacáridos y polisacáridos [8]. Los estudios demuestran queechinacósidode esta hierba protege los fibroblastos dañados regulando los niveles de ROS [9]. Este compuesto produce actividades antioxidantes, vasorelajantes y antiinflamatorias junto con neuroprotección y prevención de la osteoporosis [10,11].

Este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto deExtracto de cistanche tubulosaque contiene ECH sobre la disfunción reproductiva de la rata diabética inducida por estreptozotocina-nicotinamida.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

ECH y CTE se adquirieron de Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwán). Los productos finales de glicación avanzada (AGE) se adquirieron de Biovision (San Francisco, CA, EE. UU.). Las líneas celulares LC-540 y TM3 se adquirieron en el Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria (Hsinchu, Taiwán). Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de cinco semanas de edad en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Feed Lab Diet® se adquirió de PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwán). El 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). El metanol y el ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES) también se adquirieron de Sigma. El medio Eagle modificado por Dulbecco/F12 y tripsina-EDTA se obtuvieron de GIBCO (Nueva York, NY, EE. UU.). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT), diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA), dimetilsulfóxido (DMSO) y nitroazul de tetrazolio (NBT) se adquirieron de Sigma. Los kits enzimáticos de glucosa se obtuvieron de Kyokutoseiyaku, Tokio, Japón. Los kits de ELISA de insulina se adquirieron en Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Suecia). El reactivo de extracción de proteínas tisulares T-PER se adquirió de Thermo Scientific (Chicago, IL, EE. UU.). Los anticuerpos policlonales anti-factor nuclear humano/ratón/rata-kappa B NF-κB se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU. Los anticuerpos policlonales anti-receptor de ratón/rata para productos finales de glicación avanzada (RAGE), los anticuerpos policlonales anti-StAR humano/ratón/rata y los anticuerpos monoclonales anti-citocromo P450 17A1 anti-humano/ratón/rata se adquirieron de Gene Tex (Irvine, California, EE. UU.). Los anticuerpos policlonales anti-humano/ratón/rata CYP11A1 se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, PA, EE. UU.). El reactivo Easy-Blue se adquirió de Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, EE. UU.). La agarosa y el marcador de ADN de 100 pb se obtuvieron de Promega, Corporation (Madison, WI, EE. UU.). El mini kit RNeasy Lipid Tissue se adquirió en QIAGEN, Hilden, Alemania.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA MEJORAR LA FUNCIÓN SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Métodos

2.2.1. Análisis in vitro

Cultivo celular LC{{0}} y TM3: Las líneas celulares LC-540 se cultivaron a 37 ◦C en medio de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) suplementado con bicarbonato de sodio (1,5 g/L). L-glutamina (2 mM), aminoácidos no esenciales (0.1 mM), piruvato de sodio (1,0 mM) y suero fetal bovino (FBS) (10%) en un Incubadora de CO2 al 5% (incubadora de CO2, Napco 5410, Taiwán). La línea celular TM3 se cultivó en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con glucosa (4,5 g/l), piruvato de sodio (0,5 mM), L-glutamina (2,5 mM), bicarbonato de sodio (1,2 g/l), {{ Ácido 28}}(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES, 15 mM), y suero fetal de ternera (FCS, 10%) o suero de caballo (5%) a 37 ◦C en una solución al 5%. Incubadora de CO2.

Determinación de la viabilidad celular deEchinacósido (ECH): Se utilizó reactivo de bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) para el ensayo de viabilidad celular. La concentración celular se ajustó a 2 x 105 células/mL en una placa de pocillos 96-. Luego, se agregaron 20 µL de ECH (diluido en 2% de medio) y se incubaron durante 24 h a 37 ◦C en una incubadora con 5% de CO2. Posteriormente se agregaron 100 µL de reactivo MTT y se incubaron durante 4 h a 37 ◦C en condiciones de oscuridad. La absorbancia se midió a 570 nm (lector de ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Suiza).

Viabilidad celular relativa (%)=[(Una muestra a 570 nm − A en blanco a 570 nm)]/[(A control a 570 − A en blanco a 570)] × 100.

Ensayo de reducción de nitroazul tetrazolio (NBT) y ensayo de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH): el número de células se ajustó a 1 × 1{{10}}6 células/ ml. Luego, se agregaron 50 mg/mL de ECH, resveratrol (RES) y productos finales de glicación avanzada (AGE) (control) y se cocultivaron durante 18 h a 37 ◦C. Luego, se agregaron 0,3 ml de solución de NBT (0,1 mg/mL de NBT, 5 % de FBS y 3 % de dimetilsulfóxido (DMSO) disueltos en 10 ml de DMEM) y se incubaron a 37 ◦C en 5 % de CO2 durante 1 h. Después de la centrifugación (a 800 x g durante 3 minutos), se eliminó el sobrenadante y se agregaron 200 µl de DMSO y se agitó durante 5 minutos en un oscilador ultrasónico (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwán). La absorbancia se midió a 630 nm. Para el ensayo de radicales DPPH, se tomó como estándar Trolox (en alcohol al 95%). Luego, se mezclaron 75 µL de solución de DPPH 0,5 mM con 25 µL de muestras y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente en un lugar oscuro durante 30 minutos. La mezcla se agitó y se midió la absorbancia a 517 nm.

Análisis del contenido de especies reactivas de oxígeno (ROS): el número de células se ajustó a 2 × 105 células/ml en una placa de pocillos 12- que contenía FBS al 2 %. Luego, se agregaron a la placa 50 µL/mL de ECH, RES y AGE y se incubaron a 37 ◦C durante 24 h. Después de 24 h, se añadió 20,70 -diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) y se incubó a 37 ◦C durante 30 min. Después de la centrifugación (400 x g, 5 min), se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después, las células se suspendieron en 1 ml de PBS y los niveles de ROS se determinaron utilizando un citómetro de flujo (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, EE. UU.).

Identificación y análisis cuantitativo de proteínas: Las proteínas se extrajeron utilizando un reactivo de extracción de proteínas (T-PER). La densidad celular se ajustó a 2 × 105 células/mL en una placa de 12-pocillos y 50 µL/mL de ECH, RES y un receptor para el antagonista del producto final de glicación avanzada (RAGE), y se agregaron e incubaron AGE. a 37 ◦C en una incubadora con 5% de CO2 durante 24 h. Después, se agregaron 400 µL de T-PER, se rasparon las células y se centrifugaron a 125,000×g durante 20 min (4 ◦C). El sobrenadante se recogió y almacenó a -80 ◦C (congelador de -80 ◦C, Nuaire, Plymouth, MN, EE. UU.) para su posterior análisis. Se utilizó un kit de ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteínas. Luego, se agregaron 10 µL de solución celular estándar y 200 µL de reactivo BCA a las placas de pocillos y se incubaron a 37 ◦C en una incubadora con CO2 al 5 % durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 562 nm. El análisis de identificación de proteínas se realizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS) (SDS-PAGE). Las muestras se prepararon añadiendo lisado de proteínas a un tampón de carga de proteínas y se realizó un análisis de transferencia Western para detectar las proteínas específicas.

2.2.2. Análisis en vivo

Diseño de modelo animal: Se compraron ratas Sprague-Dawley (SD) macho de {{0}} semanas de edad en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Cada rata se alojó individualmente en jaulas desinfectantes de acero inoxidable bajo temperatura controlada (23 ± 1 ◦C) y humedad (40–60%) con un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad. Se proporcionó agua y comida ad libitum. Cada rata fue domesticada en la primera semana y se le administró dieta de laboratorio para roedores 5001 como dieta principal. Todos los procedimientos siguieron el estándar del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Aprobación IACUC No. 101026) de la Universidad Nacional Oceánica de Taiwán, Taiwán. Después de la domesticación, las ratas se dividieron en dos grupos: el grupo de control (Con), que fue alimentado con la dieta de laboratorio 5001, y el grupo diabético que fue alimentado con una dieta alta en grasas (HFD, 40%) durante todo el experimento. Después de ser alimentadas con HFD durante 4 semanas, a las ratas del grupo diabético se les inyectó estreptozotocina (65 mg/kg) (STZ) para inducir diabetes mellitus (DM). A los 15 minutos de inyectar STZ, se inyectó nicotinamida (230 mg/kg de peso corporal). Una semana después de la inyección, se realizó una prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) para determinar la inducción exitosa de diabetes mellitus (DM). Después de eso, los animales se dividieron en seis grupos: el control (alimentado con dieta de laboratorio 5001); grupo DM (DM + 45% HFD); Grupo DMR (DM + rosiglitazona: 0,571 mg/kg PC) + 45% HFD; Grupo DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg PC) + 45% HFD; Grupo DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg PC) + 45% HFD; y grupo DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Se tomó rosiglitazona (RSG) como control positivo. Se utilizaron tres dosis de CTE (80, 160 y 320 mg/kg) de acuerdo con las recomendaciones de las pautas de evaluación funcional de alimentos saludables de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Taiwán (TFDA). Los tratamientos se dieron hasta el final del experimento. Todas las ratas experimentales fueron sacrificadas después de 6 semanas. La sangre extraída de las ratas se centrifugó a 3000 rpm durante 15 min a 4 ◦C. El sobrenadante se examinó para el siguiente análisis:

Determinación de glucosa, triglicéridos y colesterol total: La determinación de glucosa se realizó mediante kits enzimáticos de glucosa. Luego, se agregaron 20 µL de muestras de plasma sanguíneo a los reactivos y se mantuvieron a 37 ◦C durante 5 min. La concentración de triglicéridos totales y colesterol total se determinó mediante el uso de kits enzimáticos de triglicéridos y colesterol. Luego, se agregaron 10 µL de plasma sanguíneo a los reactivos y el experimento se realizó según las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 510 nm.

Glucosa/triglicéridos/colesterol total en plasma (mg/dL)=(Una muestra − AB en blanco)/(Un estándar − AB en blanco) × 200.

Amuestra: Absorbancia de muestras de sangre, ABlank: Valor de absorbancia de kits sin muestra, Aestándar: Valor de absorbancia del reactivo estándar, 200: reactivos estándar a una concentración de 200 mg/dL.

Evaluación de insulina, leptina y modelo homeostático: determinación de la resistencia a la insulina (HOMA-IR):El nivel de insulina se determinó mediante kits ELISA de insulina. Aquí, 25µSe añadió L de plasma sanguíneo a lareactivos y se midió la absorbancia a 450 nm. El contenido total de leptina se determinó mediante el uso de unKit de ensayo inmunométrico de enzima leptina.Entonces, 100µSe analizó L de plasma y se determinó la absorbancia.se midió a 450 nm usando un lector de ELISA. Todo el experimento se llevó a cabo de acuerdo conlas instrucciones del fabricante. El valor HOMA-IR se determinó a partir del modelo de homeostasis.ecuación de evaluación=Concentración de insulina plasmática en ayunas (mg/mL)× glucosa plasmática en ayunasconcentraciones (mmol/L)/22,5.

Peroxidación lipídica plasmática: aquí, {{0}}.5 ml de plasma sanguíneo se mezclaron con 1 ml de reactivo (15%, p/v de ácido tricloroacético en 0.ácido clorhídrico 25 N (HCl). ) y 0.375%, p/v de ácido tiobarbitúrico en HCl 0,25 N) y se colocaron en un baño de agua (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Suiza) a 100 ◦C durante 15 min. Después de enfriar, se añadió 1 ml de n-butanol, se agitó vigorosamente y se centrifugó a 1500 x g durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y se midió la absorbancia a 532 nm [12].

Concentración de malondialdehído (MDA) (nM/mL)=[(Una muestra a 532 nm - Un blanco a 532 nm)/ (Un estándar a 532 nm - Un blanco a 532 nm)] × 5.

estándar a 532 nm − A en blanco a 532 nm)] × 5. Determinación de los niveles plasmáticos de testosterona y hormona luteinizante (LH): Se utilizó el kit ELISA de testosterona para medir el nivel de testosterona en el plasma sanguíneo. Se utilizó el kit RIA para determinar la concentración de LH. Luego, se agregaron 50 µL de plasma y los cálculos se basaron en la concentración de la hormona LH-RP-3 (estándar). Los pasos adicionales se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Determinación de la concentración del factor de necrosis tumoral (TNF) y de la interleucina-6 (IL-6): el anticuerpo capturado se diluyó 250 veces en tampón de recubrimiento y se añadió a un 96- placa de pocillos (100 µL/pocillo) y se mantuvo a 4 ◦C durante la noche. El sobrenadante se aspiró y se lavó cinco veces con tampón de lavado (1 vez PBS, Tween 20 al 0,05%). Después de la incubación (1 h) con 200 µg de diluyente de ensayo, las células se lavaron 5 veces con tampón de lavado y se agregaron 100 µl de solución estándar de TNF o muestras de prueba a cada pocillo y se incubaron durante 2 h. Después del lavado, se agregaron 100 µl de anticuerpos detectados con IL-6- y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró y se lavó 5 veces. Luego, se agregaron 480 µL de enzima avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró y se lavó cinco veces con un tampón de lavado. Luego, se agregaron 100 µL de solución de sustrato y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregaron 50 µL de solución de parada (ácido fosfórico 1 M) a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA REPARAR LA FUNCIÓN SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Análisis de los parámetros de espermatozoides y testículos.

Recolección de muestras de esperma: La recolección de muestras de esperma se realizó de acuerdo con el método informado anteriormente en [13]. Los espermatozoides se recogieron del sobrenadante y se utilizaron para análisis posteriores.

Número de espermatozoides, motilidad de los espermatozoides y espermatozoides anormales: el número de espermatozoides se calculó utilizando el hemocitómetro y una solución de azul tripán. Luego, se mezclaron 100 µL de líquido de esperma con una solución de azul tripán y se calculó el número de espermatozoides, la motilidad y los espermatozoides anormales utilizando un hemocitómetro y un microscopio [14].

Reducción de NBT de nitro azul tetrazolio y peroxidación lipídica de espermatozoides y testículos: La peroxidación lipídica y la reducción de NBT se analizaron de acuerdo con el mismo procedimiento de análisis de plasma.

Determinación de la actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa: La actividad de superóxido dismutasa (SOD) se analizó utilizando el kit RANSEL. Aquí, {{0}}.0Se agregaron 5 ml de homogeneizados testiculares a 1,7 ml de solución de reacción (0.xantina 05 mM, 2-({ 0,025 mM) {9}}yodofenilo)- 3-(4-nitrofenol)-5-cloruro de feniltetrazolio (INT)). Después de mezclar, se agregaron 0,25 ml de xantina oxidasa (80 U/l) y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 s. La absorbancia se midió a 505 nm. La concentración de proteína del homogeneizado testicular se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad DC y se calculó su actividad específica (U/mg de proteína). La actividad catalasa (CAT) se determinó según un método informado anteriormente [15].

Tinción H&E (hematoxilina y eosina)

El testículo se remojó en formalina al 10% durante 24 h y se almacenó a 4 ◦C. Los tejidos eran de tamaño micro y estaban adheridos al portaobjetos. Después de la fijación (95% metanol + 5% ácido acético), los portaobjetos se sumergieron en hematoxilina durante 3 minutos, se lavaron con agua corriente durante 5 minutos y luego se empaparon con alcohol al 50%, 70% y 90% durante un minuto. Después de eso, los portaobjetos se tiñeron con eosina durante 10 segundos y se sumergieron en alcohol al 100% durante un minuto hasta que se desvanecieron. Finalmente, el portaobjetos se sumergió en xileno durante un minuto. Posteriormente, el portaobjetos se secó al aire y se selló. El tubo teñido se colocó en un microscopio de contraste de fase invertida (Microscopio de diferencia de fase invertida, Olympus CK-2, Tokio, Japón) para observar la morfología.

Análisis del hipotálamo

Las secuencias de los genes KISS1, receptor acoplado a proteína G (GPR) 54, supresor de la señalización de citoquinas 3 (SOCS-3) y sirtuina 1 (SIRT1) de ratón se identificaron a partir de la base de datos de genes del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). y se diseñó un cebador específico utilizando Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EE. UU.). Los cebadores utilizados en el experimento se enumeran en la Tabla 1.

Extracción de ácido ribonucleico (ARN) del hipotálamo. La extracción de ARN del hipotálamo del cerebro se llevó a cabo utilizando el mini kit RNeasy Lipid Tissue. Los ARNm obtenidos se midieron cuantitativamente mediante transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN complementario obtenido del análisis de RT se almacenó a -20 ◦C para su uso posterior. El ADN extraído se sometió a análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando polimerasa Taq. Luego, se tomaron de 5 a 10 µl del producto de la PCR y se analizaron mediante electroforesis en un coloide de agar al 1,5%. La imagen fue tomada en un sistema de imágenes UVP BioDoc-It. Se tomó ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) con transcripción inversa y se realizó la PCR utilizando el kit IQ SYBR Green Supermix. Posteriormente se analizó con el software del sistema óptico iQTM 5. Las proteínas se extrajeron utilizando un reactivo de extracción de proteínas (T-PER). Luego, se añadieron 20 mg de homogenado testicular a 400 µL de T-PER y se centrifugaron (Centrífuga de alta velocidad, Hettich CR-12, Tuttlingen, Alemania) a 4 ◦C (125,000× g ) durante 20 min. El siguiente método fue similar al "análisis de identificación y cuantificación de proteínas" en análisis in vitro.

2.3. Análisis estadístico

Los resultados experimentales se expresaron como media ± desviación estándar (Media ± DE) y los datos se analizaron utilizando el software Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, Nueva York, NY, EE. UU. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Se analizaron comparaciones múltiples de diferentes grupos mediante la prueba de Duncan con el valor de p < 0.05 como nivel significativo.

3. Resultados

3.1. Análisis in vitro

3.1.1. Comparación de las actividades antioxidantes de ECH, CTE y RES

h a largo plazoEl alto estrés oxidativo y la inflamación crónica son las principales causas de diabetes.complicaciones [16]. Los CTE contienen variosglucósidos feniletanoides como el equinacósido(ECH) y actósido, con potencial de actividad antioxidante [17]. Eliminación de radicales DPPHSe realizó un ensayo para evaluar la actividad antioxidante de ECH. trolox y resveratrol(3,5,4'-trihidroxiestilbeno, RES) se tomaron como estándar y control positivo respectivamente. Como se muestraen la figura1, ECH mostró una mejor actividad eliminadora de radicales y la actividad fue significativamente mayorque el del control positivo (RES).

3.1.2. Viabilidad celular de ECH en células de Leydig LC-540 y TM3

Se realizó un ensayo MTT para evaluar la viabilidad celular de diferentes concentraciones de ECH. Las células de Leydig LC-540 y las células de Leydig TM3 mostraron más del 80% de viabilidad después de ser tratadas con ECH (Figura 2). En comparación con las otras concentraciones, una concentración 100- µM (diluciones de 100 µM en FBS al 2%) de ECH mostró una mejor viabilidad celular en células de Leydig TM3. El resultado indicó que el aumento de la concentración de ECH no aporta ninguna toxicidad significativa a las células.

3.1.3. Efecto de ECH sobre la producción de superóxido inducida por AGE mediante ensayo NBT en células de Leydig LC-540 y TM3

Los AGE causan daño oxidativo en el cuerpo debido a la oxidación de la glucosa y la formación de radicales libres como O2-, radicales hidroxilo y grupos carbonilo [18]. Después de ser estimuladas con 50 ug/ml de AGE, las células LC-540 (Figura 3a) y TM3 (Figura 3b) se trataron con ECH y RES (5 μM y 10 μM cada una). Los resultados mostraron que la producción de anión superóxido aumentó en el grupo de control (AGE estimulados), pero la producción de anión superóxido disminuyó después del grupo de control (AGE estimulados), pero la producción de anión superóxido disminuyó después de la producción de superóxido y protegió. las células del daño oxidativo. En el caso de las células LC-540, la ECH 10 µM mostró una actividad casi similar a la del grupo normal. La producción de superóxido en ambas células disminuyó con un aumento en la concentración de ECH y RES.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA MEJORAR LA FUNCIÓN SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Efecto de la ECH sobre la producción de H2O2 en células de Leydig LC-540 estimuladas por AGE

Se ejecutó el ensayo DCFH-DA para detectar la presencia de especies oxidativas. Después de entrar en las células, el colorante fluorescente DCFH-DA se oxida con H2O2 intracelular y forma diclorofluoresceína (DCF). Como se muestra en la Figura 4, hubo un aumento significativo en la producción de H2O2 intracelular en el grupo estimulado por AGE (control), mientras que la adición de ECH y RES 10 µM redujo significativamente la producción de H2O2 en las células. La administración de ECH 10 µM resultó en sólo alrededor del 47,1% de la producción de H2O2, significativamente menor que en el grupo de control.

3.1.5. Efecto de ECH sobre los niveles de expresión de las proteínas RAGE y NF-κB en células de Leydig LC-540 estimuladas por AGE

Se realizó un análisis de transferencia Western para confirmar la presencia de RAGE en células de Leydig LC-540. El efecto de ECH sobre los niveles de expresión de proteínas RAGE (Figura 5a) y NF-κB (Figura 5b) en células de Leydig estimuladas con AGE se muestra en la Figura 5. Los resultados mostraron que una concentración de 50 µg/mL de AGE indujo mayores RAGE y NF- La expresión de κB en células de Leydig LC-540 y una concentración de 10 µM de ECH y RES redujeron significativamente la expresión de RAGE y NF-κB. La expresión de NF-κB fue significativamente menor en RES y ECH que en los antagonistas de RAGE. Entonces, los resultados confirmaron que la ECH redujo el nivel de inflamación al disminuir el nivel de RAGE y NF-κB.

3.1.6. Efecto de la ECH sobre la vía de síntesis de testosterona en células de Leydig LC-540 estimuladas por AGE.

El proceso de espermatogénesis y de infertilidad masculina depende de la presencia de testosterona. Como se muestra en la Figura 6, las expresiones de las proteínas StAR (Figura 6a), CYP11A1 (Figura 6b), CYP17A1 (Figura 6c) y HSD17 3 (Figura 6d) disminuyeron significativamente en LC estimulada por AGE{{11 }} Células de Leydig (grupo control). Las expresiones de las proteínas StAR, CYP11A1, CYP17A1 y HSD17 3 aumentaron significativamente cuando se agregaron el antagonista de RAGE, RES y ECH. El aumento de la expresión de las proteínas StAR y CYP11A1 se observó tanto en el grupo tratado con ECH como en el tratado con RES. El nivel de expresión de CYP17A1 fue casi similar en los grupos RES y ECH. Las expresiones de la proteína HSD17 3 en las células de Leydig tratadas con ECH fueron mucho más altas que las de las células tratadas con antagonistas de RES y RAGE. El aumento de la expresión de las proteínas StAR, CYP11A1, CYP17A1 y HSD17 3 indicó la producción normal de testosterona.