Efecto de la terapia de protones sobre la destrucción de células tumorales y el microambiente inmunológico del carcinoma hepatocelular

Abstracto: La radioterapia con terapia de protones (PT) tiene ventajas dosimétricas sobre la terapia de fotones, lo que ayuda a ampliar la ventana terapéutica de la radioterapia para el carcinoma hepatocelular (CHC). Evaluamos la respuesta del HCC al PT y examinamos los mecanismos subyacentes. Se seleccionaron las líneas celulares de cáncer de hígado humano HepG2 y HuH7 y la línea celular de cáncer de hígado murino Hepa1–6 para experimentos con células y animales para examinar la respuesta inducida por la irradiación de PT. Se examinaron los cambios biológicos y la respuesta inmunológica después de la irradiación de PT. Los experimentos in vitro no mostraron diferencias significativas en la supervivencia celular después de la PT en comparación con la radioterapia con fotones. En un modelo de tumor murino, los tumores eran de menor tamaño 12 días después de la irradiación con PT. Los cambios subyacentes incluyeron un aumento del daño en el ADN, niveles de IL-6 regulados al alza y un microambiente tumoral inmunológico regulado. El análisis de proteínas in vitro e in vivo mostró que la PT aumentaba el nivel del ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1) expresado en células tumorales y reclutaba células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). El aumento de PD-L1 se correlacionó positivamente con la dosis de irradiación. En los modelos de ratón singénicos Hepa1–6, la combinación de PT con anti-PD-L1 aumentó el retraso en el crecimiento del tumor en comparación con el PT solo, lo que se asoció con un aumento de las células T infiltrantes de tumores y un reclutamiento atenuado de MDSC en el microambiente. Además, cuando se aplicó PT al tumor primario de CHC, los ratones tratados con anticuerpos anti-PD-L1 mostraron tumores sincrónicos no irradiados más pequeños. En conclusión, la respuesta del HCC al PT estuvo determinada por la destrucción de las células tumorales y la respuesta inmunológica en el microambiente del tumor. La combinación con el anticuerpo anti-PD-L1 para mejorar la inmunidad antitumoral fue responsable del sinergismo terapéutico para el CHC tratado con PT. Según nuestros resultados, sugerimos que la PT combinada con anti-PD-L1 puede ser una política terapéutica prometedora para el CHC.

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Palabras clave: CHC; terapia de protones; PD-L1; inmune

1. Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC) es un cáncer que ocurre a nivel mundial con una incidencia relativamente alta en el sudeste asiático [1]. La mayoría de los pacientes tienen un mal pronóstico debido a tumores avanzados y/o mala función hepática. Tradicionalmente, la radioterapia (RT) con una dosis definida para el tratamiento del cáncer de hígado se ha asociado con un alto riesgo de hepatitis inducida por la radiación. Las mejoras en las técnicas de administración de radioterapia han ayudado a ampliar la ventana terapéutica de RT para el CHC. El desarrollo de la RT con terapia de protones (PT) ha puesto de relieve su uso para el CHC [2,3]. La PT tiene ventajas dosimétricas sobre la terapia de fotones convencional para el tratamiento del cáncer, especialmente para el CHC, el cáncer de cabeza y cuello y el cáncer de mama. Estudios recientes sugirieron que puede haber diferencias en los cambios biológicos inducidos por la RT, incluida la inducción de daño en el ADN, el estrés oxidativo y la regulación de las células inmunes, entre PT y fotones en dosis equivalentes de efectividad biológica relativa [4–7]. Una mayor investigación del efecto radiobiológico del PT facilitará la oportunidad de brindar el desarrollo de estrategias de PT prometedoras para el tratamiento del cáncer. La combinación de RT e inmunoterapia en entornos clínicos es prometedora para muchas indicaciones [8,9]. Como la inflamación crónica produce una predisposición al desarrollo de CHC, el CHC es un objetivo potencial para la inmunoterapia [10]. La RT tiene efectos tanto proinmunógenos como inmunosupresores sobre el microambiente tumoral [9]. Aunque se ha demostrado que la RT desencadena la muerte celular inmunogénica y mejora la infiltración de células inmunitarias antitumorales [11,12], varios estudios demostraron que la RT puede inducir citocinas y células reguladoras inmunitarias, lo que da como resultado un microambiente tumoral más inmunosupresor. Se demostró que la combinación de inmunoterapia y RT mejora la respuesta tumoral en comparación con cualquiera de las modalidades solas y anula los efectos inmunosupresores inducidos por la RT [13,14]. Varios estudios preclínicos y clínicos demostraron que el tratamiento con RT de fotones e inmunoterapia tiene un efecto positivo en el control tumoral en el CHC [15,16]. Hasta donde sabemos, casi todos los informes sobre respuestas inmunes radioinducidas se han obtenido con irradiación basada en fotones. Una mejor comprensión de los mecanismos responsables de la respuesta al PT podría conducir a enfoques terapéuticos más potentes para el CHC. Es necesario investigar más a fondo los efectos biológicos del PT responsable del control tumoral y la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, nuestro objetivo fue evaluar el efecto de la radiación con PT y la respuesta inmune en el microambiente tumoral. También investigamos si la combinación de PT y el bloqueo de PD-L1 tiene un efecto sinérgico en el control del tumor CHC.

2. Materiales y métodos

2.1. Cultivo de células 

La línea celular de cáncer de hígado humano HepG2 y la línea celular de cáncer de hígado murino Hepa1–6 se obtuvieron del Centro de Investigación y Colección de Biorecursos. Además, el Dr. Yen-Hao, Chen (Hospital Conmemorativo Kaohsiung Chang Gung, Taiwán) proporcionó amablemente células HuH7, una línea celular de hepatoma humano. El uso de las líneas celulares fue aprobado por nuestro comité de ética de investigación institucional (No. 00464-2021120952922). Las líneas celulares se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Además, se mantuvieron células THP-1 monocíticas humanas en el medio de cultivo RPMI 1640. Los monocitos THP-1 se pueden diferenciar en macrófagos M1 o M2 cuando se incuban en un medio condicionado [17,18]. Para determinar los efectos de PT sobre la capacidad de las células cancerosas para inducir la diferenciación de macrófagos M2, se sembraron células HuH7 con o sin irradiación de PT en placas de pocillos 6- 24 h antes del final de la polarización de macrófagos M2. Después de 24 h de cocultivo, se analizó la expresión de CD163, un marcador de macrófagos M2, con macrófagos. El análisis de células activadas por fluorescencia multicolor (FACS) se realizó utilizando un citómetro de flujo de calibre FACS (BD Biosciences) en suspensiones de células individuales preparadas a partir de macrófagos diferenciados, y la inmunotinción para CD163 se llevó a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia. Los experimentos in vitro se realizaron en el Laboratorio Conjunto del Hospital Conmemorativo Chang Gung, que proporcionó las plataformas de servicios que incluían el clasificador de células, el analizador de células multicolor y la microscopía confocal.

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2.2. Irradiación

La eficacia biológica relativa de los protones se fijó en 1,1 y la dosis de eficacia biológica relativa (RBE) se calculó multiplicando la dosis de protones por este valor [19]. En el presente estudio, utilizamos la dosis de RBE para evaluar el efecto inducido por la RT. La dosis en radioterapia de protones se prescribe como Gy (RBE) aumentando la dosis física en un 10%, es decir, la dosis de RBE de protones=la dosis física de protones × 1,1. Las células y los ratones recibieron RT local mediante irradiación con fotones o PT con la dosis de RBE. La irradiación de fotones se realizó utilizando Varian 21EX y planificación de tratamiento Eclipse. In vitro, se irradiaron células en crecimiento exponencial con dosis únicas de 0, 3, 6 y 9 Gy utilizando un haz de 6 MV para el análisis de radiación de fotones. Para PT, la irradiación mediante escaneo con haz de lápiz (PBS) se realizó a diferentes dosis de protones (0, 3, 6, 9 y 12 Gy (RBE)), con una energía correspondiente a 93,6–109,2 MeV y 72–143,2 MeV para las células. y ratones, respectivamente. Las irradiaciones de células y ratones se realizaron colocando las células en el medio del pico de Bragg extendido (SOBP; 1 cm de ancho para PT celular, 6 cm de ancho para irradiación de PT de ratón) para simular condiciones clínicas (Figura 1a, b). La irradiación de protones fue administrada por el ciclotrón utilizado en nuestro hospital (Sumitomo Heavy Industries, Ltd., Tokio, Japón), que genera un haz de protones continuo y de alta intensidad. El tamaño del campo de RT fue de 20 × 10 cm2 para examinar el efecto abscopal, 20 × 15 cm2 para examinar el efecto tumoricida de PT in vivo o 20 × 20 cm2 para examinar el efecto de PT in vitro. Ray Station fue el sistema de planificación del tratamiento utilizado para el cálculo de la dosis de RT (versión 8.1, Ray Search Laboratories, Estocolmo, Suecia).

Figura 1. Modelo preclínico para PT. Los diseños experimentales de haces de protones para modelos de tumores in vitro (a) y animales (campo RT para irradiación de tumores hepáticos, línea azul; campo RT para examinar el efecto abscopal, línea roja) (b).

2.3. Ensayo de proliferación de células T

Para examinar si el PT era capaz de regular el efecto de las células cancerosas y las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) sobre la proliferación de células T CD8+, medimos la proliferación de células T CD8+ después de la estimulación. Las células T CD8+ aisladas usando microperlas anti-CD8 se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) y se sembraron en placas de 96-pocillos con células CD11b+ en presencia o ausencia de células cancerosas 48 h después del PT. La proliferación de células T CD8+ fue estimulada por perlas anti-CD3/CD28 (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). La tinción fluorescente CFSE se analizó mediante citometría de flujo 3 días después de la estimulación.

2.4. Inducción de CD14+HLA-DR a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Se identificó un nuevo subconjunto de MDSC basándose en la presencia de expresión de CD14 pero la ausencia de expresión del antígeno leucocitario humano (HLA)-DR (CD14+HLA-DR-) en la sangre periférica de pacientes con cáncer. Según se informa, la acumulación anormal de células CD14+HLA-DR− en PBMC contribuye a la evasión inmune del tumor y se correlaciona con el pronóstico del cáncer [20-22]. Para evaluar el papel de la irradiación de PT en la inducción de MDSC, se evaluó el porcentaje de células mieloides CD14+HLA-DR a partir de PBMC incubadas con células cancerosas irradiadas con PT durante 24 h. La proporción de células mieloides CD14+HLA-DR- y el nivel de expresión de PD-L1 se analizaron utilizando FACS (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.).

2.5. Ensayo clonógeno

Se utilizaron ensayos clonogénicos para examinar el efecto de la RT (PT frente a RT de fotones) sobre la pérdida de supervivencia de las células reproductivas. Los cultivos celulares se irradiaron y luego se incubaron a 37 ◦C para la formación de colonias. Después de 10 días, las colonias se fijaron y se tiñeron con cristal violeta para el recuento de colonias. Se puntuaron las colonias para determinar la eficiencia del cultivo en placas y las fracciones supervivientes a una dosis de RBE determinada. La fracción de supervivencia es el número de colonias después de la exposición a RT, con una corrección por la eficiencia del revestimiento.

2.6. Modelos de tumores singénicos (ectópicos y ortotópicos)

Todos los estudios con animales cumplieron con todas las normas éticas pertinentes para la investigación con animales y fueron aprobados por el comité de animales experimentales de nuestro hospital. Los experimentos con animales se realizaron en el Centro de Animales de Laboratorio del Hospital Memorial Chang Gung, que cuenta con la acreditación completa de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC). Utilizamos ratones C57BL/6J como modelo de implantación de tumor hepático. En el modelo de tumor ectópico y ortotópico, las células tumorales (Hepa 1–6 1 × 106 células) se implantaron por vía subcutánea en la región del muslo derecho y/o se implantaron intraoperatoriamente en el área de la cúpula hepática. Para examinar la respuesta de los tumores hepáticos al PT in vivo, se administró a los tumores una irradiación local de PT de 12 Gy (RBE) 14 días después de la implantación de células cancerosas Hepa1-6 (Figura 1b). Los ratones de control fueron sometidos a irradiación simulada. Para abordar el efecto abscopal del PT en huéspedes inmunocompetentes portadores de tumores, implantamos simultáneamente células cancerosas Hepa1-6 en el muslo derecho (tumor primario) y la parte superior de la espalda (tumor sincrónico secundario). Catorce días después de la implantación del tumor, se administró PT con 12 Gy (RBE) al tumor primario pero no al tumor sincrónico secundario. Luego observamos el crecimiento del tumor (incluidos los tumores primarios irradiados y sincrónicos no irradiados) en los momentos indicados. Para investigar los efectos de anti-PD-L1 sobre el control tumoral local mediado por PT y el efecto abscopal, a ratones portadores de tumores se les administró una dosis intraperitoneal de 250 µg de anticuerpo antiPD-L1 inmediatamente después de la irradiación de PT y cada 2 días hasta el final de los experimentos. El anticuerpo anti-ratón PD-L1 (B7-H1, 10F.9G2) se obtuvo de Bio X Cell (Líbano, NH, EE. UU.).

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2.7. Análisis de citometría de flujo MDSC in vivo

Las MDSC se caracterizan por la coexpresión de los antígenos de diferenciación del linaje de células mieloides Gr1 y CD11b. Por lo tanto, utilizamos un anticuerpo anti-Gr1 específico, que reacciona con un epítopo común en Ly-6G y Ly-6C, y un anticuerpo específico para CD11b (BD Pharmingen) para definir las MDSC de ratón como CD11b. +Gr1+ [23]. Además, el antígeno de diferenciación mieloide Gr-1 consta de dos epítopos reconocidos por anticuerpos anti-Ly-6G y anti-Ly6C. La población de MDSC CD11b+Gr-1+ constaba de dos subconjuntos principales: células con un fenotipo granulocítico que expresaba Ly-6G y células con un fenotipo monocítico que expresaba Ly6C. Se identificó un nuevo subconjunto de MDSC como MDSC monocíticas, definidas como CD11b+Ly6G- en ratones. Realizamos análisis de FACS y de inmunofluorescencia para examinar el efecto de la irradiación en el reclutamiento de MDSC después de que los ratones recibieron irradiación. FACS se llevó a cabo en suspensiones unicelulares preparadas a partir de tumores completos y bazo después de digestión e inmunotinción para CD11b, Gr1 y LY6G con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia (BD PharMingen). El porcentaje de MDSC se midió mediante citometría de flujo multicolor con los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente. Se utilizaron anticuerpos específicos de isotipo como controles negativos en FACS.

2.8. Análisis estadístico

Las muestras se analizaron mediante la prueba t de Student. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (DE). Todos los experimentos celulares comprendieron tres réplicas biológicas por condición [24] y se realizaron al menos tres veces de forma independiente. Para los experimentos in vivo, se utilizaron seis animales por grupo y se realizaron al menos dos experimentos independientes. Se tomó un nivel de probabilidad de p < 0.05 para indicar significación estadística a menos que se indique lo contrario.

3. Resultados:

3.1. Respuesta de HCC al PT Respuesta de HCC

Se expusieron células cancerosas humanas y murinas a una dosis única de PT de 0, 3, 6 o 9 Gy (RBE), y se examinaron y compararon la muerte celular a las 48 h y la fracción de supervivencia de las células formadoras de colonias. con fotón-RT. No hubo diferencias significativas en la supervivencia celular con RBE equivalente entre PT y RT de fotones (Figura 2a, b). La formación de p-H2AX es una respuesta celular a las roturas de la doble cadena del ADN, y la presencia de exposición a la calreticulina y el grupo Caja 1 de alta movilidad (HMGB1) sirven como características distintivas de la muerte celular por inmunogenicidad inducida por RT [25-27]. Como se muestra en la Figura 2c, PT mejoró la expresión de calreticulina y HMGB1 asociada con un mayor daño al ADN 24 h después de la RT. Un estudio anterior [28] informó que la RT de fotones regulaba positivamente la IL-6, lo que estaba relacionado con la resistencia del HCC a la RT. Los datos (Figura 2c, d) revelan que el PT aumentó el nivel de IL-6 en células de cáncer de hígado analizadas mediante IF y RT PCR en tiempo real a las 24 y 48 h después del PT. Para caracterizar aún más si el aumento de IL-6 por PT estaba relacionado con la actividad del promotor IL6, realizamos ensayos de actividad de luciferasa utilizando células HepG2 y HuH7 transfectadas de manera estable con un vector que expresa construcciones del promotor IL-6 (Figura 2e). . Los datos cuantitativos sugieren que PT aumentó la actividad del promotor IL-6 a las 48 h después de 6 Gy (RBE) en comparación con las células de control.

3.2. Respuesta al tratamiento PT en el huésped inmunocompetente

In vivo, los modelos de tumores animales son herramientas esenciales para predecir la eficacia de nuevas estrategias contra el cáncer. Utilizamos modelos de tumores de ratón singénicos para investigar los efectos del PT en el control del tumor CHC. Con base en la observación de la actividad tumoral mediante el ensayo de tomografía molecular fluorescente (FMT) in situ y la medición del tamaño del tumor, encontramos que hubo una disminución significativa de la actividad de absorción de glucosa del tumor y tumores más pequeños 12 días después de la PT en comparación con la RT simulada (Figura 3a, b). Para examinar más a fondo el mecanismo responsable de la respuesta al PT, realizamos análisis FACS y de inmunofluorescencia utilizando tumores 3 días después del PT o la irradiación simulada. Se ha informado que la exposición a la calreticulina es un indicador inmunogénico de la apoptosis inducida por RT en dosis más bajas, y HMGB1 está relacionada con la muerte celular inducida por RT en dosis más altas [29]. Además, se ha informado que la IL-6 desempeña un papel en la modulación inmune inducida por RT [30]. Anteriormente informamos que la expresión de IL-6 estaba regulada positivamente por la RT de fotones y que el aumento de IL6 se correlacionaba con la respuesta a la radiación de los tumores hepáticos [28]. Como se muestra en la Figura 3c, d, la PT aumentó la muerte de las células tumorales asociada con un mayor daño al ADN y la expresión de IL6 y HMGB1 en comparación con la irradiación simulada.

3.3. Los efectos inmunomoduladores inducidos por PT

Se ha informado que la inducción de la polarización de los macrófagos M2 es el componente inmunosupresor clave en el microambiente tumoral irradiado [17,18]. Para probar si PT mejoraba la diferenciación de monocitos en células M2, incubamos monocitos THP-1 en la etapa de reposo (M0) en el medio acondicionado durante 72 h para la polarización M2. Luego analizamos los niveles del marcador M2 en macrófagos de monocitos mediante cocultivo en sobrenadante de cultivo con o sin células HuH7 irradiadas con PT 24 h antes del final de la polarización de macrófagos M2. Como se muestra en la Figura 4a, la adición de células cancerosas irradiadas con PT al cultivo de macrófagos aumentó la expresión del marcador M2 CD163 en macrófagos in vitro. Además, investigamos el papel del PT en la capacidad de las células cancerosas para inducir MDSC a partir de monocitos en la sangre periférica de donantes mediante cocultivo con células cancerosas con o sin PT durante 48 h. Las células CD14+HLA-DR en las PBMC identificaron un nuevo subconjunto de MDSC. La Figura 4b revela que la irradiación PT se asoció con una mayor frecuencia de células mieloides CD14+ HLA-DR en comparación con el control. Además, hubo una mayor expresión de iNOS, un marcador funcional de inmunosupresión mediada por MDSC, en el subconjunto de células que se cultivaron conjuntamente con células cancerosas irradiadas con PT (Figura 4c). Además, se confirma que CD163 es un marcador fenotípico de macrófagos M2 que puede usarse para distinguir macrófagos M2 y M1. Como se muestra en la Figura 4d, e, PT condujo al aumento de células CD163+ en tumores irradiados con PT asociado con la inducción de MDSC monocíticas en ratones con tumores. Se ha informado que la RT desencadena la muerte celular inmunogénica y mejora la infiltración de células inmunes. Para probar más a fondo el papel de PT en las consecuencias funcionales de las células cancerosas en la supresión de células T mediada por MDSC, se evaluó la proliferación de células T CD8+ clasificadas en presencia de células tumorales con o sin 6 Gy (RBE ) Irradiación PT. Los datos revelan que las células MDSC-CD11b+ disminuyeron la proliferación de células T, y la incubación con células tumorales irradiadas con PT revirtió la proliferación de células T CD8+ después de la estimulación (Figura 4f).

Figura 2. Respuesta de HCC a PT in vitro. Efectos del tratamiento con PT sobre la muerte celular de células HuH7. (a) Clasificación de células activadas por fluorescencia con yoduro de propidio y tinción con anexina V 48 h después del PT para la dosis indicada (RBE), y (b) fracciones de supervivencia celular mediante ensayos clonogénicos presentados con la proporción normalizada por la fracción de supervivencia en condiciones de control. Los números de celdas de revestimiento para 0, 3, 6 y 9 Gy (RBE) fueron 500, 1000, 1500 y 3000 por pocillo, respectivamente. (c) La inmunofluorescencia para el daño del ADN inducido por PT y los marcadores de la muerte celular por inmunogenicidad se muestran mediante diapositivas representativas y datos cuantitativos (DAPI, azul; pH 2AX y calreticulina, verde; HMGB1 e IL6, rojo). El eje y representa los cambios relativos en las expresiones de la proteína diana. (d) Los niveles de IL-6 se examinaron mediante RT-PCR en tiempo real 48 h después del PT. (e) Transfección estable de células HepG2 y HuH7 con plásmidos que contienen construcciones promotor-informador IL-6. Los valores se representan como veces de activación de la actividad luciferasa del plásmido informador en la condición indicada. Los datos se presentan como medias ± errores estándar de la media. *p < 0,05

Figura 3. Respuesta al tratamiento con PT en ratones inmunocompetentes. Se determinaron imágenes representativas y datos cuantitativos mediante análisis FMT de la absorción de glucosa a los 0, 3 o 12 días con o sin irradiación PT (a). El eje y representa la proporción normalizada por el valor del tumor en 0 días con irradiación simulada. Se muestran imágenes representativas y datos cuantitativos de imágenes de tumores (b) de ratones con tumores sc 12 días después de 12 Gy (RBE) PT o irradiación simulada. El eje y representa el cambio relativo en el tamaño del tumor en el momento indicado después del PT. El daño al ADN por IF (c) y la muerte celular por FACS (d) se evaluaron 3 días después del PT. El eje y es el cambio relativo en las expresiones de la proteína diana y la tasa de muerte celular 3 días después del PT. Los datos se presentan como medias ± errores estándar de la media. *p<0.05

3.4. Papel del PT en la expresión del ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1)

PD-L1 es un determinante crítico del equilibrio en el microambiente tumoral inmunológico [31]. PT aumentó la expresión de PD-L1 en células tumorales hepáticas y el nivel de expresión se correlacionó positivamente con la dosis RBE de PT in vitro (Figura 5a, b). Para validar aún más los efectos de PT en PD-L1 in vivo, examinamos el nivel de expresión de PD-L1 en tumores de CHC murinos utilizando IF y FACS. Los datos de la Figura 5c, d revelan un aumento significativo de la expresión de PD-L1 en tumores 3 días después del PT. También examinamos si PT regulaba la expresión de PD-L1 en MDSC utilizando células mieloides CD11b+ clasificadas de tumores. Los resultados indicaron que PT aumentó la expresión de PD-L1 en las células CD11b+ clasificadas (Figura 5e, f).

3.5. Efecto de PD-L1 sobre la respuesta de HCC a PT in vivo

Para determinar si PD-L1 desempeña un papel en la radiosensibilidad de los tumores hepáticos al PT en huéspedes inmunocompetentes, se administró RT local con PT 12 Gy (RBE) a tumores implantados por vía subcutánea en ratones con o sin tratamiento anti-PD-L1. Como se muestra en las Figuras 6a a c, el anti-PD-L1 aumentó el efecto de inhibición tumoral inducido por PT asociado con una disminución de la proliferación celular y un aumento de la muerte celular después de la irradiación. Además, para validar los efectos reguladores del anti-PD-L1 en el microambiente del tumor inmune después del PT, examinamos la respuesta inmune utilizando un modelo de tumor ortotópico murino de HCC. Los datos muestran que el anti-PD-L1 atenuó el reclutamiento de MDSC y aumentó los CD3+ TIL asociados con tumores más pequeños en comparación con el PT solo (Figura 6d-f).

3.6. El bloqueo de PD-L1 mejora el efecto abscopal sobre el cáncer de hígado después de la PT

Se ha informado que la radiación induce efectos abscopales en sitios de cáncer distantes y no tratados que se amplifican mediante el uso de fármacos inmunomoduladores [32-34]. En consecuencia, examinamos más a fondo el efecto abscopal inducido por el PT en los tumores hepáticos y el impacto del tratamiento combinado con el anticuerpo anti-PD-L1. Como se muestra en la Figura 7a, by la Figura complementaria S1, la aplicación de PT local al tumor solo indujo tumores más pequeños con un menor metabolismo de la glucosa en los tumores irradiados en el muslo derecho, pero no mostró una inhibición tumoral significativa en los tumores secundarios no irradiados en la parte superior de la espalda. , en comparación con el grupo de RT simulada. El tratamiento combinado con el anticuerpo anti-PD-L1 inmediatamente después del PT mejoró el efecto tumoricida en el campo irradiado con PT y dio como resultado la regresión de los tumores secundarios fuera del campo irradiado. El análisis de las células inmunitarias infiltrantes de tumores mostró que el anti-PD-L1 atenuó el reclutamiento de MDSC, aumentó los CD3+ TIL y disminuyó la proliferación celular en tumores no irradiados (Figura 7c,d) de ratones que recibieron PT local para tumores primarios. Estos resultados sugieren que anti-PD-L1 mejoró la respuesta inmune antitumoral y aumentó el efecto abscopal en huéspedes inmunocompetentes después de la irradiación local de PT.

Figura 4. Respuesta inmune asociada al PT. La expresión del marcador CD163 en las células al final de la polarización de macrófagos M2 se analizó mediante FACS (a) (I: control; II: + sobrenadante de cultivo de células cancerosas; III: + células cancerosas; IV: +6 Gy (RBE) sobrenadante de cultivo de células cancerosas irradiadas con PT; V: +6 Gy (RBE) células cancerosas irradiadas con PT). Se analizó (b) el porcentaje de células CD14+HLA-DR- de PBMC incubadas con o sin células HuH7 irradiadas con 0, 3 o 6 Gy (RBE) durante 48 h, y la expresión de iNOS en las células CD14+HLA-DR- clasificadas se analizó mediante IF (DAPI, azul; iNOS, rojo) (c). La extensión de las células CD163+ en tumores irradiados 12 días después de la PT se examinó mediante IF (DAPI, azul; CD163, rojo) (d), y el efecto de la irradiación de PT sobre el reclutamiento de MDSC monocíticas se evaluó mediante FACS ( mi). Además, la tasa de proliferación de células T se examinó mediante FACS con o sin incubación con células cancerosas irradiadas con PT. Se muestran imágenes representativas y datos cuantitativos (f). El tratamiento indicó células T CD8+ con perlas de estimulación anti-CD3/CD28 en presencia de MDSC combinadas con células cancerosas con o sin irradiación PT. Los datos se presentan como medias ± errores estándar de la media. *p<0.05.

Figura 5. Efecto de PT sobre la expresión de PD-L1. Los niveles de PD-L1 se evaluaron utilizando (a) IF (DAPI, azul; PD-L1, verde), (b) tinción FACS para células de cáncer de hígado humano y murino a las 48 h después de PT in vitro y (c) FACS, y (d) IF para tumores hepáticos murinos en los momentos indicados después de PT durante 12 Gy (RBE) in vivo. El eje y es el cambio relativo en la expresión de PD-L1 en las condiciones indicadas después de PT. Los datos se presentan como medias ± errores estándar de la media. *p<0.05. Además, la expresión de PD-L1 en células CD11b+ murinas después de la irradiación con PT se evaluó mediante (e) análisis IF y (f) FACS (células CD11b+, manchas azules).

Figura 6. Efecto de PD-L1 sobre la respuesta de HCC a PT in vivo. (a) El efecto de la terapia anti-PD-L1 sobre el retraso del crecimiento del tumor. El eje y es el cambio relativo en el tamaño del tumor subcutáneo inducido por anti-PD-L1 después de la PT. Los datos representan las medias de los experimentos, * p < {{10}}.05. ( b ) Los efectos in vivo de la apoptosis inducida por el tratamiento evaluados utilizando FACS con tinción con anexina V-PI. El eje y es el cambio relativo en la tasa de muerte celular después del PT. Los datos se presentan como medias ± errores estándar de la media. *p < 0,05. (c) Inmunohistoquímica para daño al ADN inducido por RT y Ki-67 en tumores en los momentos indicados después de PT durante 12 Gy (RBE). (d) Se evaluó el efecto de la terapia anti-PD-L1 sobre la inhibición tumoral en un modelo de tumor ortotópico. Se muestran imágenes representativas y datos cuantitativos 12 días después de la irradiación PT local o la irradiación simulada. El eje y es el cambio relativo en el tamaño del tumor hepático. Los datos representan las medias de los experimentos, * p < 0,05. (e) La extensión de las células ki67+, CD3+TIL y CD11b+ en tumores irradiados 12 días después de la PT se examinaron utilizando IF (DAPI, azul; ki-67 y CD3, verde ; CD11b, rojo). (f) El efecto de anti-PD-L1 combinado con irradiación PT sobre el reclutamiento de MDSC se evaluó utilizando FACS

Figura 7. El efecto abscopal sobre el cáncer de hígado después del PT. El crecimiento de tumores no irradiados en la parte superior de la espalda se determinó mediante análisis FMT de la absorción de glucosa (a) e imágenes del tumor (b) en los momentos indicados de ratones que recibieron PT durante 12 Gy (RBE) en el tumor primario solo sobre el muslo derecho ( PT (+): los ratones recibieron 12 Gy (RBE) en el tumor primario sobre el muslo derecho, pero no en el tumor secundario sobre la parte superior de la espalda). Se muestran imágenes representativas y datos cuantitativos de tumores no irradiados 0, 3 y 12 días después de la irradiación PT con o sin terapia anti-PD-L1. El eje y representa el cambio relativo en el valor de FMT y el tamaño del tumor en el momento indicado después del PT. Además, se muestran imágenes representativas del nivel de ki-67 y la infiltración de células CD11b+ y CD3+ en tumores secundarios no irradiados 12 días después del PT local usando IF (DAPI, azul; ki{{16 }} y CD3, verde; CD11b, rojo) (c). La acumulación de MDSC (d) en el tumor secundario no irradiado se analizó mediante citometría de flujo. El eje y es el cambio de pliegue relativo. Los datos representan las medias de los experimentos, * p < 0.05

4. Discusión

Los resultados de este estudio muestran que la pérdida de células formadoras de colonias inducida por PT depende de la dosis y es similar a la causada por la irradiación de fotones. El nivel de daño no reparado del ADN causado por la radiación es un determinante importante de la respuesta a la radiación específica del tejido. Nuestros datos revelan que la muerte celular inducida por PT se correlaciona con el aumento en los niveles de marcadores de daño del ADN. Se informa que varias citoquinas asociadas a tumores están reguladas por la irradiación y son capaces de reclutar y polarizar subconjuntos inmunes en el microambiente tumoral [35,36]. Anteriormente informamos que la expresión de IL-6 estaba regulada positivamente por la RT de fotones y que el aumento de IL6 se correlacionaba con la respuesta a la radiación de los tumores hepáticos [28]. Los estudios preclínicos han demostrado que existe una regulación diferencial de los factores inflamatorios después de la PT frente a la radiación de fotones, incluida la IL-6 [6,7,37]. Mediante experimentos celulares, demostramos que la irradiación de PT también reguló positivamente el nivel de expresión de IL-6 de manera dependiente de la dosis. La capacidad de respuesta del tumor al tratamiento está influenciada por la proliferación de células tumorales y el microambiente del tumor. El uso de modelos de ratón es una estrategia óptima para evaluar la respuesta al tratamiento. Hasta donde sabemos, hasta ahora pocas series preclínicas han presentado la respuesta de los tumores hepáticos al TP. En el presente estudio se demostraron los datos in vivo de la muerte de células tumorales y el retraso del crecimiento tumoral inducido por PT en ratones con tumores hepáticos. Además de la radiosensibilidad celular intrínseca, el nuevo crecimiento del tumor después de la radioterapia in vivo puede verse sustancialmente afectado por varios factores inflamatorios y estromales [38,39]. La RT induce una variedad de efectos posteriores relacionados con el sistema inmunológico, incluidos efectos inmunoestimuladores e inmunosupresores. La RT estimula la inmunidad anticancerígena mediante la inducción de la muerte celular inmunogénica, liberando nuevos antígenos a los componentes del sistema inmunológico, lo que posteriormente conduce a una mejor preparación y activación de las células T efectoras. Por otro lado, la RT produce efectos inmunosupresores, como el reclutamiento de MDSC en el microambiente irradiado [39,40]. El reclutamiento de MDSC es un determinante del microambiente tumoral inmunosupresor después de la RT. Las MDSC se han convertido en importantes reguladores de las respuestas inmunitarias en el cáncer y otras afecciones patológicas. La evidencia respalda las contribuciones clave de las MDSC a la progresión tumoral. Anteriormente informamos que la RT podría desencadenar un aumento de MDSC y que el aumento se asoció con la resistencia a la RT en un modelo animal de CHC [28]. El estudio presentado demostró que la PT conduce a la activación del reclutamiento de MDSC asociado con la inducción de MDSC monocíticas en ratones con tumores. Un nuevo subconjunto de MDSC identificadas como MDSC monocíticas se define como monocitos CD14+HLA-DR- de la sangre periférica de pacientes y CD11b+Ly6G- en ratones [20,23,41]. La expresión de iNOS como marcador funcional de inhibición de células T es el estándar de oro para la evaluación de la función MDSC [42]. Los experimentos que utilizaron la incubación de PBMC con células cancerosas mostraron que la PT mejoraba la capacidad de las células cancerosas para inducir MDSC en monocitos y aumentaba la expresión de iNOS en el subconjunto de células. Además, nuestros datos revelan que el cocultivo con células CD11b+ disminuyó la proliferación de células T, y el cáncer irradiado con PT atenuó la capacidad supresora de las células CD11b+ sobre la proliferación de células T en experimentos de cocultivo.

Se informa que el linaje de células mieloides constituye una red de células inmunosupresoras que están presentes en la mayoría de los pacientes con cáncer y que inhiben profundamente la generación de inmunidad antitumoral. Los macrófagos, las abundantes células inmunitarias en el microambiente tumoral, son importantes reguladores de la inflamación crónica. Se ha sugerido que los macrófagos pueden polarizarse hacia el fenotipo M2, lo que contribuye al microambiente inmunosupresor [43]. Es probable que las células mononucleares en los tumores existan en varias fases de diferenciación, desde monocitos/MDSC monocíticas hasta macrófagos M2 asociados a tumores. Esta red entre las MDSC y los macrófagos M2 asociados a tumores revela que M2 se puede distinguir de las MDSC monocíticas. La evidencia sugiere que la RT desempeña un papel regulador en los macrófagos con polarización M1/M2 para modular la respuesta inmune [44,45]. Demostramos que el cocultivo con células irradiadas con PT dio como resultado una mayor expresión de marcadores M2 in vitro y tumores irradiados con PT in vivo. La activación de las respuestas inmunitarias anticancerígenas es fundamental para la eficacia de la RT.

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Múltiples mecanismos inmunitarios son importantes en el desarrollo y la progresión del CHC y se correlacionan con el pronóstico. Los inhibidores de puntos de control dirigidos a PD1 y PDL1 son activos, tolerables y clínicamente beneficiosos contra el CHC avanzado [46]. PD-L1, un importante biomarcador celular, desempeña un papel en la evasión inmunitaria, incluida la inhibición de la vigilancia inmunitaria mediada por células T y la regulación de la polarización de los macrófagos M2 [13,31,47]. Se observó que la regulación positiva del eje PD-1/PD-L1 suprime la acción citotóxica de las células T, lo que puede ser la causa de respuestas inmunes del huésped que evaden el tumor y de la destrucción incompleta de las células tumorales después de la irradiación. PD-L1 estaba ampliamente localizado en células hematopoyéticas, incluidas células T, macrófagos y células tumorales. PD-1/PD-L1 es un punto de control inmunológico notable que conduce a la anergia de las células T. Se han aprobado anticuerpos contra PD-L1, un bloqueo de puntos de control inmunológico, para la terapia adyuvante de algunos cánceres y como una inmunoterapia prometedora para pacientes con CHC avanzado [48,49]. Los inhibidores de PDL1 son una de las columnas vertebrales de las terapias sistémicas en la práctica clínica o en desarrollo para el CHC. Además, los efectos inmunosupresores inducidos por la RT revelan el potencial de combinar con éxito la radiación con diversas formas de inmunoterapia para anular estos efectos inmunosupresores. Las MDSC pueden contribuir a la resistencia del paciente a la inhibición de los puntos de control inmunológico. Demostramos que PT reguló positivamente la expresión de PD-L1 en tumores y MDSC de una manera dependiente de la dosis in vitro e in vivo. Los efectos inmunosupresores inducidos por la RT revelan el potencial de combinar con éxito la radiación con diversas formas de inmunoterapia para anular estos efectos inmunosupresores. La investigación preclínica ha demostrado que la combinación de RT de fotones e inmunoterapia exhibe sinergismo terapéutico para mejorar el control tumoral [15]. Como sabemos, la combinación de RT e inmunoterapia aún se encuentra en sus etapas preliminares y no existen especificaciones óptimas de dosis de RT, tipos de RT o secuenciación para RT e inmunoterapia. Para aclarar esta cuestión de la irradiación PT combinada con inmunoterapia, combinamos la terapia anti-PD-L1 con la irradiación PT de tumores hepáticos en modelos de tumores singénicos. Descubrimos que la combinación con el anticuerpo anti-PD-L1 sensibilizó el cáncer de hígado a la irradiación PT, como lo demuestra un tumor más pequeño asociado con un aumento de la muerte de las células tumorales. Además, la terapia anti-PD-L1 inhibió el reclutamiento de MDSC y aumentó la filtración de células T CD3+ en tumores irradiados con PT.

Clásicamente se piensa que la RT es una terapia local que mata las células tumorales mediante el daño intrínseco del ADN en el campo de radiación. Además, la respuesta abscopal a la radiación es un fenómeno bien establecido en el que los tumores fuera de un campo de radiación también responden al tratamiento. Se cree que el efecto abscopal está mediado inmunológicamente. Una parte de las células cancerosas dentro de un tumor morirá mediante muerte celular inmunogénica cuando se usa radiación en dosis terapéuticas. La muerte de las células tumorales inducida por RT se asocia con la generación de señales moleculares específicas y la presentación de más antígenos a los componentes del sistema inmunológico. Se ha informado que la RT puede desencadenar un efecto abscopal relacionado con el sistema inmunológico, lo que implica que la RT no solo tiene un efecto tumoricida en el tumor diana sino que también tiene un efecto antitumoral en sitios de cáncer distantes y no tratados [32,50,51]. Entre los factores inducidos por la RT, la capacidad de la radiación para promover el reconocimiento de las células cancerosas por parte de las células T es probablemente de particular importancia para el efecto abscopal. Este efecto está asociado con la muerte de las células tumorales para estimular la inmunidad antitumoral que puede amplificarse mediante el uso de agentes inmunomoduladores. Además, pembrolizumab produce una tasa de remisiones objetivas del 15 al 20% que se asocian con una supervivencia prolongada en el CHC [46]. Un punto crítico con respecto a los inhibidores de puntos de control es su eficacia y seguridad. Está claro que la inmunoterapia no aporta beneficios a todos los pacientes. Cómo superar la resistencia del tumor a la inmunoterapia es una cuestión importante. Las posibles causas de la resistencia tumoral incluyen la resistencia intrínseca y el desarrollo de anticuerpos antidrogas que neutralizan la actividad de la inmunoterapia. Para obtener una fuerte estimulación inmune, se pueden combinar diferentes terapias locales de forma secuencial o simultánea con inmunoterapia sistémica. Es probable que la inmunoterapia cree sinergia con las intervenciones locales en el CHC. El CHC suele ser multifocal y las áreas potencialmente precancerosas se desarrollan de forma metacrónica en todas partes. Aquí, examinamos más a fondo si la combinación de PT con anti-PD-L1 mejora el efecto abscopal de PT para aumentar el control de los tumores hepáticos metacrónicos. Nuestros datos revelan que la combinación de PT con anti-PD-L1 indujo tamaños tumorales más pequeños en los tumores secundarios no irradiados en comparación con los inducidos por PT o anti-PD-L1 solo. Nuestros datos también muestran que la combinación con anti-PD-L1 se asoció con TIL aumentados y reclutamiento atenuado de MDSC en tumores distantes no irradiados de ratones que recibieron PT local. Estos resultados sugieren que el anti-PD-L1 aumentó la inmunidad antitumoral, lo que medió el aumento de las actividades de destrucción de tumores primarios y el efecto abscopal en ratones portadores de tumores que recibieron irradiación PT local.

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5. Conclusiones

El fundamento para combinar radioterapia e inmunoterapia es que la radiación podría producir inmunidad antitumoral sinérgica y que la inmunoterapia supera las respuestas de supresión inmune en el microambiente del tumor irradiado. En resumen, sugerimos que además del efecto biológico sobre las células cancerosas, el PT también tiene un efecto de modulación inmune sobre el microambiente tumoral. Nuestros datos revelan que el anti-PD-L1 provocó inmunidad anticancerígena y posteriormente aumentó la respuesta de los tumores primarios y distantes a la irradiación de PT. La aplicación de anti-PD-L1 combinado con PT podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento del CHC.

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