Efecto de la vacunación de pollitas sobre el desarrollo y la longevidad de la inmunidad Parte 1
Mar 15, 2023
Abstracto:
La enfermedad respiratoria aviar provoca importantes pérdidas económicas en la avicultura comercial. Debido a la necesidad de proteger a las aves de corral de larga vida contra los patógenos del tracto respiratorio desde una edad temprana, los programas de vacunación para las pollitas generalmente implican la administración en serie de una variedad de vacunas, que incluyen el virus de la bronquitis infecciosa (IBV), el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y el virus de la enfermedad de Newcastle. virus de la laringotraqueítis (ILTV). A menudo, el intervalo entre las vacunas es solo una cuestión de semanas, pero se desconoce si estas aves desarrollan inmunidad y protección contra el desafío cuando las vacunas se administran en una sucesión corta, lo que se conoce como interferencia viral. Nuestro objetivo fue determinar si las vacunas vivas atenuadas administradas en serie contra IBV, NDV e ILTV influyen en el desarrollo y la longevidad de la inmunidad y la protección contra desafíos en aves de larga vida.
Sobre la base de un programa típico de vacunación de pollitas, se administraron varias vacunas vivas atenuadas contra IBV, NDV e ILTV a leghorns blancas libres de patógenos específicos hasta las 16 semanas de edad (WOA), después de lo cual ciertos grupos fueron desafiados con IBV, NDV o ILTV a los 20, 24, 28, 32 y 36 WOA. Cinco días después del desafío, se evaluaron la carga viral, los signos clínicos, la criostasis, la histopatología traqueal y los títulos de anticuerpos en suero y lágrimas. Demostramos que las pollitas a las que se les administraron en serie vacunas vivas atenuadas contra IBV, NDV e ILTV estuvieron protegidas contra la exposición homóloga con IBV, NDV o ILTV durante al menos 36 semanas, y concluimos que el intervalo entre las vacunas utilizado en este estudio (al menos 2 semanas ) no interfirió con la protección. Esta información es importante porque muestra que un programa típico de vacunación de pollitas que consiste en vacunas vivas atenuadas administradas en serie contra múltiples patógenos respiratorios puede resultar en el desarrollo de inmunidad protectora contra cada agente de la enfermedad.
Hablando de inmunidad, el cuerpo humano también tiene muchas cosas que pueden mejorar la inmunidad, como Cistanche, que también es rica en sustancias biológicamente activas, como péptidos, terpenos, ácidos fenólicos, etc., que pueden estimular la activación de las células inmunitarias y mejorar las células inmunes. y mejorar la inmunidad del cuerpo. Estas sustancias biológicamente activas también pueden regular y activar la función autoinmune del cuerpo, mejorando aún más la inmunidad humana.
Palabras clave:
virus de la bronquitis infecciosa; virus de la enfermedad de Newcastle; virus de la laringotraqueítis infecciosa; programa de vacunación; inmunidad; enfermedad respiratoria; criostasis; respuesta de anticuerpos
1. Introducción
La vacunación contra las enfermedades virales respiratorias es una práctica estándar en las operaciones avícolas comerciales. Tanto las vacunas vivas como las muertas se administran a las aves de corral, y las vacunas vivas se usan comúnmente para una variedad de patógenos porque son efectivas cuando se aplican en masa y son relativamente económicas [1]. En general, las vacunas vivas inducen inmunidad local y mediada por células y brindan una respuesta protectora más amplia que las vacunas muertas, mientras que las vacunas muertas inducen principalmente inmunidad humoral y tienden a ser específicas de antígeno. La duración de la inmunidad lograda después de la administración de la vacuna viva depende de la edad y el tipo de ave, los niveles de inmunidad materna, la enfermedad a la que se dirige la vacuna, la inmunogenicidad de la vacuna, el método de aplicación de la vacuna, el número y el intervalo entre los refuerzos, la virulencia y la similitud. del virus de desafío de campo, el intervalo entre la vacunación y el desafío, y la inmunocompetencia del huésped [1–3].
El virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV, por sus siglas en inglés) es un patógeno viral del tracto respiratorio superior de las aves de corral y conduce a una reducción del aumento de peso y la eficiencia alimenticia, caídas en la producción y la calidad del huevo, retraso en el crecimiento e infección bacteriana secundaria que resulta en aerosaculitis [4]. El virus inicialmente se replica en el tracto respiratorio superior, seguido de una replicación sistémica en el tracto reproductivo, y algunas cepas pueden causar lesiones en el riñón [4]. Las aves infectadas pueden presentar secreción nasal, tos, estornudos y estertores traqueales [4]. La enfermedad se previene mediante la vacunación, y las vacunas vivas se usan comúnmente para inducir inmunidad y protección local. Las vacunas vivas generalmente se administran a las aves jóvenes para lograr una protección temprana, y las ponedoras y reproductoras también reciben refuerzos con vacunas vivas o inactivadas, que varían según su similitud con los virus de campo circulantes [2].
La enfermedad de Newcastle (ND) está causada por cepas virulentas del paramixovirus aviar tipo 1, que recientemente se ha reclasificado como avulavirus aviar 1 (AAvV-1) [5]. Dependiendo de la cepa del virus, los signos clínicos de la infección por ND pueden estar ausentes o pueden incluir depresión, inapetencia, signos respiratorios (secreción nasal, estornudos, tos), reducción de la producción y calidad de los huevos, y signos neurológicos (tortícolis, círculos, parálisis). ) [3]. Las cepas del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se caracterizan como lentogénicas, mesogénicas y velogénicas, de acuerdo con su tiempo medio de muerte en los embriones [6]. Las cepas lentogénicas son de baja patogenicidad y causan infecciones respiratorias o entéricas leves, seguidas de las cepas mesogénicas, mientras que los aislamientos velogénicos son altamente patógenos y a menudo causan signos neurológicos y mortalidad [3]. Los regímenes de vacunación contra el VEN varían y pueden utilizar una combinación de vacunas vivas, inactivadas y vectorizadas por virus [7]. En los Estados Unidos, las cepas de vacunas tradicionales más utilizadas comprenden la B1 lentogénica (o clones de virus de la cepa B1) y las cepas LaSota [3].
La laringotraqueítis infecciosa (ILT) es una enfermedad respiratoria de las aves de corral causada por el alfaherpesvirus tipo I y es económicamente importante en todo el mundo [8]. Las manifestaciones clínicas de ILT incluyen aumento de la mortalidad, reducción de la producción de huevos, disminución del aumento de peso corporal, conjuntivitis, traqueítis con expectoración de moco sanguinolento en casos graves, depresión, disnea intensa y susceptibilidad a otros patógenos respiratorios. Las vacunas vivas contra el virus ILT (ILTV) pueden ser de origen de embrión de pollo (CEO) o de cultivo de tejido (TCO), en las que se pasan múltiples veces en huevos o cultivo de tejido, respectivamente. Aunque las vacunas recombinantes para ILT están disponibles comercialmente, la vacuna CEO es la vacuna contra ILTV más utilizada en todo el mundo.
Debido a la necesidad de proteger a los pollos contra diferentes patógenos virales desde una edad temprana, los programas de vacunación suelen incluir múltiples vacunas contra una variedad de patógenos. Los regímenes de vacunación de muestra en diferentes sectores avícolas se revisan en el Manual Veterinario de Merck, en el que el intervalo entre las vacunas a menudo es solo una cuestión de semanas.
Sin embargo, hay poca información que demuestre que los intervalos entre vacunas son suficientes para que las aves desarrollen una protección inmunológica adecuada contra los desafíos de cada virus. La literatura muestra que las infecciones virales secuenciales pueden resultar en una interferencia viral, en la que un virus bloquea la infección subsiguiente y/o la replicación de otro virus en el huésped [9,10], pero hasta ahora se desconoce si este fenómeno resulta en una protección reducida. de vacunas vivas atenuadas administradas en serie en pollos. Curiosamente, se ha informado que la administración simultánea de virus a pollos o pavos no produce interferencia viral [11]. En este estudio, investigamos cómo un programa de vacunación comercial típico que consiste en una combinación de vacunas contra enfermedades respiratorias virales atenuadas vivas administradas en serie afecta el desarrollo y la longevidad de la inmunidad y la protección contra desafíos homólogos.
2. Materiales y métodos
2.1. virus
En este estudio se utilizó una vacuna comercial contra el IBV MILDVAC-GA-98® (Merck Animal Health, Summit, NJ, EE. UU.). La vacuna se diluyó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El virus de desafío utilizado fue IBV GA98/CWL0474/98 y se preparó a una dosis infecciosa de embrión mediana (EID50) de 103,19. Los títulos de virus se calcularon mediante el método de Reed y Muench [12]. Se usó una vacuna comercial NDV B1 (NEWHATCH-C2, Merck Animal Health, Summit, NJ, EE. UU.) tanto para la vacunación como para el desafío y se reconstituyó siguiendo las instrucciones del fabricante.
Dado que las cepas mesogénicas y velogénicas de NDV requieren un nivel de bioseguridad superior a BSL2, que no está disponible en nuestro laboratorio, nuestro modelo experimental para la protección contra NDV implica títulos de virus significativamente reducidos o inmunidad estéril contra una segunda exposición (desafío) con el virus de la vacuna. Para la vacunación y el desafío, se utilizaron una vacuna comercial ILTV CEO (Trachivax® Merck Animal Health, Summit, NJ, EE. UU.) y una cepa patógena de pollos de engorde ILTV Georgia 63140 [13], respectivamente. La cepa 63140 se propagó en células de riñón de pollo obtenidas de pollos libres de patógenos específicos (SPF) de 3- a 4- semanas de edad [14]. La vacuna CEO se preparó siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de la inoculación, la dosis infectiva mediana del cultivo de tejidos (TCID50) se confirmó mediante la titulación de ambos virus en células de riñón de pollo como se describió anteriormente [14].
2.2. Diseño experimental
Se obtuvieron huevos libres de patógenos específicos a los 18 días de incubación y se incubaron en el Centro de Investigación y Diagnóstico Avícola, Athens, GA. Los pollitos se colocaron sobre virutas de pino frescas en casas de colonias y corrales. Los pollitos se vacunaron con la dosis recomendada por los fabricantes en 100 µL por vía oculonasal de acuerdo con el siguiente programa; IBV a 1 DOA, NDV a las 2 semanas de edad (WOA), IBV a 4 WOA, ILTV a 8 WOA, NDV a 12 WOA e ILTV a 16 WOA.
Además, un grupo de control no fue vacunado. Se realizaron desafíos homólogos en 20, 24, 28, 32 y 36 WOA, y se realizaron necropsias cinco días después del desafío (dpc). En el desafío, las aves recibieron uno de cuatro tratamientos: IBV GA98, NDV B1, ILTV 63140 o ningún desafío. Los grupos de tratamiento para cada virus de desafío por punto de tiempo fueron los siguientes: no vacunados, no desafiados (n=9–10); vacunados, no desafiados (n=9–10); vacunados, desafiados (n=17–19); no vacunados, desafiados (n=9–10). Todas las aves desafiadas con IBV recibieron una EID50 de 1 × 103,2 por ave en 100 µL por vía intranasal. Todas las aves expuestas a NDV recibieron la vacuna NDV B1 en 100 µl por vía intranasal, reconstituida de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las aves expuestas a ILTV recibieron la cepa patógena 63140 en una dosis de 1 × 103,5 TCID50 por ave en 100 µl dividida en partes iguales entre gotas para los ojos e intranasal. Para los desafíos de IBV y NDV, las aves se observaron a los 5 dpc en busca de signos respiratorios, como se describió anteriormente [15]: 0=ausente; 1=leve; 2=moderado; 3=grave. Para los desafíos de ILTV, se observaron aves a los 3 y 5 dpc para detectar disnea, conjuntivitis, depresión y mortalidad, como se describió anteriormente [16].
La hendidura coanal (aves desafiadas con IBV y NDV y control a los 5 dpc) o la tráquea (aves desafiadas con ILTV y control a los 3 y 5 dpc) se tomaron muestras para la detección del virus, y las muestras se almacenaron en PBS a -80 ◦C. A los 28, 32 y 36 WOA, se recogieron 50 µL de lágrimas añadiendo NaCl granulado al ojo. La sangre se recogió mediante punción en el ala o en el corazón y se añadió a un tubo de microcentrífuga para recoger el suero para la detección de anticuerpos. Las aves se sacrificaron de forma humanitaria, y el párpado, la glándula de Harder (HG), el timo, el hígado, el bazo, las amígdalas cecales y la bolsa de Fabricio se recolectaron y almacenaron a -80 ◦C para la detección del virus y en formalina tamponada neutra al 10 por ciento. Se extrajo la tráquea, se colocó una sección en formalina tamponada neutra al 10 por ciento y la porción restante de la tráquea se sumergió en medios de cultivo tisular para la prueba de iconostasio que se describe a continuación. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia (AUP #: A2015 05-001-R2).
2.3. Prueba de ciliostasis
La prueba de iconostasio se realizó en tráqueas recolectadas en medios de cultivo celular (medio de Eagle modificado por Dulbecco) a 37 ◦C. Para cada tráquea, se cortaron cinco anillos traqueales que medían aproximadamente 1 mm de espesor y representaban las porciones proximal, media y distal [17,18]. La actividad de los cilios se observó utilizando un microscopio invertido (Olympus, Center Valley, PA, EE. UU.). El sistema de puntuación sigue 0=todos los cilios venciendo; 1=75 por ciento de cilios golpeando; 2=50 por ciento de cilios golpeando; 3=25 por ciento de cilios golpeando; 4=sin latidos de los cilios como se describió anteriormente [17]. La puntuación máxima posible para cada tráquea es 20. Cada anillo traqueal fue puntuado por tres individuos y se calculó la puntuación total media para cada tráquea. El puntaje de protección del iconostasio para cada grupo se determinó mediante la siguiente fórmula: 100 − [(total de puntajes individuales para el grupo)/(el número de individuos en el grupo × 20) × 100], y un puntaje Mayor o igual hasta los 50 se consideraba protegida.
2.4. Histopatología Traqueal
Se fijó una sección de cada tráquea en formalina tamponada neutra al 10 por ciento, se procesó y se incluyó en parafina, y se cortaron secciones de 5- µm para la tinción con hematoxilina y eosina. Para las lesiones de IBV, se puntuaron para cada tráquea la hiperplasia epitelial, la infiltración de linfocitos y la deciliación epitelial. Las puntuaciones se determinaron de la siguiente manera: 1=normal, 2=focal, 3=multifocal y 4=difusa, como se describió anteriormente [19]. Para las lesiones del VEN se realizó un análisis descriptivo. Para las lesiones de ILTV, las lesiones microscópicas se calificaron en una escala de 0 a 5 (normal a muy grave), como se describió anteriormente [20].
2.5. Extracción de ARN y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR)
Para la detección de IBV y NDV, se realizó la extracción de ARN viral de 50 µL de PBS de cada hisopo utilizando un kit de aislamiento viral MagMAX-96 5x (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.) en un MagMAX™ Express{{ 3}} Deep Well Magnetic Particle Processor (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) se realizó con el kit AgPath-IDTM One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.), siguiendo el protocolo del fabricante. Cada 25-µL de mezcla de reacción contenía 12,5 µL de tampón 2X RT-PCR, 10 µM de cada cebador, 4 µM de la sonda, 1 µL de mezcla de enzimas 25× RT-PCR y 5 µL de ARN viral. Las reacciones de qRT-PCR se realizaron en el sistema Applied Biosystems® 7500 Fast Realtime PCR (Life Technologies Ltd., Carlsbad, CA, EE. UU.) en las siguientes condiciones: un ciclo de 50 ◦C durante 30 min y 95 ◦C durante 15 min , seguido de 40 ciclos de 94 ◦C durante 1 s y 60 ◦C durante 60 s. Los cebadores y la sonda para IBV qRT-PCR se publicaron previamente [21] y están compuestos por un cebador directo IBV50GU391 (50 -GCT TTT GAG CCT AGC GTT-30 ), un cebador inverso IBV50GL533 ({ {38}}GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT G-30), y una sonda IBV50G de doble etiqueta Taqman® (50 -FAM-CAC CAC CAG AAC CTG TCA CCT C-BHQ{{45 }} ). Los cebadores y la sonda para la qRT-PCR de NDV se describieron previamente [22] y están compuestos por un cebador directo NDV M plus 4100 (5'-AGT GAT GTG CTC GGA CCT TC-3'), un cebador inverso NDV M -4220 (5'-CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA-3'), y una sonda de doble etiqueta Taqman® NDV M plus 4169 (5'-FAM-TTC TCT AGC AGT GGG ACA GCC TGC -BHQ1-3').
Los cebadores se obtuvieron de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EE. UU.), y la sonda Taqman fue sintetizada por BioSearch Technologies (Novato, CA, EE. UU.). Los componentes de la RT-PCR en tiempo real y los parámetros del termociclador se describieron previamente [21]. Los datos se expresan como el valor promedio del umbral del ciclo (CT) para todas las muestras en cada grupo, con valores de CT positivos basados en el límite de detección para esta prueba asociada con la detección de virus en huevos [23].
Cada placa de reacción qRT-PCR incluía una curva estándar como control de extracción de ARN y como control positivo. Se usó GA98 IBV aislado de líquido alantoideo como plantilla para la curva estándar. También se incluyeron controles negativos en cada placa y consistieron en reactivos de PCR sin ARN.
2.6. Extracción de ADN
Para ILTV, el ADN total se extrajo de los hisopos traqueales utilizando el kit de pozos 96-miniprep de extracción de ADN MegaZorb® (Promega, Madison, WI, EE. UU.), como se describió anteriormente [24].
2.7. qPCR
Se realizó un ensayo de PCR dúplex en tiempo real que amplifica un fragmento del gen viral UL44 en ILTV y un fragmento del gen del colágeno alfa 2-de pollo, como se describió anteriormente [25].
2.8. Títulos de anticuerpos IgG específicos del virus de la bronquitis infecciosa en suero (IBV)
Los títulos de IgG específicos de IBV se detectaron utilizando un kit de prueba de anticuerpos IBV de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de IgG comercial (IDEXX, Westbrook, ME, EE. UU.). Brevemente, las muestras de suero (almacenadas a -20 ◦C) se diluyeron 1:500 y el procedimiento se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.
2.9. Títulos de anticuerpos IgA específicos de IBV secretados por lágrimas
La IgA específica de IBV en lágrimas se detectó utilizando un kit de prueba de anticuerpos IgG ELISA IBV comercial (IDEXX, Westbrook, ME, EE. UU.). Brevemente, las lágrimas se diluyeron dos veces en serie en PBS y se incubaron en pocillos duplicados durante la noche a 4 ◦C. Todos los pasos de lavado se realizaron usando PBS-Tween 20 (0,05 por ciento de Tween 20). Las placas se incubaron a 23 ◦C durante 2 h en IgA-BIOT monoclonal de ratón anti-pollo (1:1000, clon A-1, Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU.), seguido de 1 h en Streptavidin-HRP ( 1:4000, Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU.). Los pasos finales de detección de anticuerpos se completaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los títulos de punto final se determinaron informando la dilución más baja a la que la densidad óptica (DO), registrada a una longitud de onda de 650 nm, estaba al menos tres desviaciones estándar por encima de la media de 12 pocillos de control incubados sin muestras de lágrimas. Los datos de los pozos con un cambio de color puntual debido al sustrato residual o las burbujas de aire se excluyeron del análisis y los resultados se informaron como log2 del título de punto final.
2.10. Análisis estadístico
Los datos se analizaron con el software Prism v.6.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Para los datos de carga viral, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional con la prueba posterior de Dunnet para comparar los grupos de tratamiento dentro de cada período de recolección. Todos los demás datos se analizaron mediante una prueba de Kruskal-Wallis con la prueba posterior de Dunn para comparar los grupos de tratamiento dentro de cada período de recolección. Se determinaron diferencias significativas en p < 0.05.
3. Resultados
3.1. Virus de la bronquitis infecciosa
A los 5 días después del desafío con IBV GA98, las aves vacunadas/desafiadas tenían cargas de ARN significativamente más bajas en comparación con los controles positivos en todos los tiempos de recolección y en todas las muestras de tejido, excepto la amígdala cecal a 24 WOA (Tabla 1). En los controles vacunados, no se detectó ARN de IBV en todos los tiempos de recolección excepto en las amígdalas cecales a los 20 y 24 WOA y la hendidura coanal a los 20 WOA. Las cargas de IBV en los controles negativos en todos los tejidos estuvieron por debajo del límite de detección usando el valor de CT mayor o igual a 36,17 como se informó anteriormente [23], en todos los tiempos de recolección, excepto en los 24 controles negativos WOA HG.
Los signos clínicos de infección por IBV medidos 5 días después del desafío se redujeron significativamente en las aves vacunadas/desafiadas en comparación con los controles positivos en todas las semanas excepto 28 WOA, pero las tendencias en las puntuaciones de los signos clínicos fueron numéricamente más bajas entre las aves vacunadas/desafiadas (Tabla 2) . Los signos clínicos estuvieron ausentes en las aves de control vacunadas y negativas no expuestas, y los signos en las aves vacunadas/expuestas no fueron significativamente diferentes de los signos en los controles no expuestos.
Tabla 1. Valores promedio cuantitativos de umbral de ciclo (CT) de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR) para el ARN del virus de la bronquitis infecciosa (IBV) recolectado de la hendidura coanal, glándula de Harder, conjuntiva y amígdala cecal 5 días después del desafío con IBV GA98 a las 20, 24, 28, 32 y 36 semanas de edad. Las letras (a–d) indican diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de exposición para cada semana (p < 0,05).
Tabla 2. Los signos clínicos y las lesiones microscópicas se midieron 5 días después de la exposición al IBV GA98. Las letras (a–b) indican diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de exposición para cada semana (p < 0.05).
El examen histopatológico de las tráqueas de todos los grupos osciló entre los límites normales y la traqueítis linfocítica mínima a moderada focal a multifocal; sin embargo, la infiltración linfocítica moderada se observó con mayor frecuencia en los controles positivos. En todas las semanas, la proporción de aves vacunadas/expuestas con deciliación o necrosis traqueal aguda se redujo significativamente en comparación con los controles positivos y no fue diferente de los controles negativos y vacunados (Tabla 2).
Ciliostasis, defined as the cessation of tracheal ciliary movement, was measured at 5 DPC, and the number of birds positive for cryostasis and cryostasis protection scores was calculated for each group (Figure 1). At all collection times, vaccinated/challenged birds were protected from cryostasis (scores were >50), y los controles positivos no estaban protegidos (las puntuaciones fueron<50). The non-challenged negative controls and vaccinated controls were protected (scores were >50) en todos los horarios de recolección.
Figure 1. Ciliostasis protection scores among tracheas were collected 5 days post-challenge with IBV GA98 for different groups of birds challenged at 20, 24, 28, 32, and 36 weeks of age (WOA). Groups with a protection score >50 (línea horizontal) están protegidos y los grupos con una puntuación de protección<50 are not protected. Fractions above each bar represent the proportion of birds positive for cryostasis for the respective group. −/− = non-vaccinated/non-challenged, +/− = vaccinated/non-challenged, +/+ = vaccinated/challenged, −/+ = non-vaccinated/challenged.
Los títulos de IgG específicos de IBV se midieron en suero recogido en 5 DPC. En todo momento, excepto en 32 WOA, las aves vacunadas de los grupos expuestos y no expuestos exhibieron títulos significativamente más altos en comparación con las aves no vacunadas de los grupos expuestos y no expuestos (Figura 2). A las 32 WOA, los títulos en las aves vacunadas, independientemente del estado de desafío, fueron significativamente más altos en comparación con los controles positivos. Los títulos en las aves vacunadas/desafiadas no difirieron significativamente de los títulos en los controles vacunados hasta 36 WOA, cuando las aves vacunadas/desafiadas tenían títulos significativamente más altos. En comparación con los controles negativos, las aves vacunadas/expuestas tenían títulos significativamente más altos en todo momento.
Los títulos de IgA específicos de IBV se midieron en lágrimas recogidas en 5 DPC en 28, 32 y 36 WOA. A las 28 WOA, los títulos en las aves vacunadas/expuestas fueron significativamente más altos en comparación con los títulos en los controles negativos no expuestos (Figura 3). A las 32 WOA, las aves vacunadas/expuestas mostraron títulos significativamente más bajos en comparación con los controles positivos. Además, las aves vacunadas/expuestas tenían títulos significativamente más altos que el grupo vacunado/sin exposición a 28 WOA. No se detectaron otras diferencias significativas. Virus 2019.
Figura 2. Los títulos de IgG específicos de IBV en suero se recolectaron 5 días después del desafío con IBV GA98 para diferentes grupos de aves desafiadas a los 20, 24, 28, 32 y 36 WOA. Las letras (a–c) indican diferencias significativas entre los grupos vacunados y de desafío para cada semana (p < 0,05). −/−=no vacunados/no desafiados, más /−=vacunados/no desafiados, más / más=vacunados/desafiados, −/ más=no vacunados/desafiados.
Figura 3. Título de IgA específica de IBV en lágrimas recolectadas 5 días después del desafío con IBV GA98 para diferentes grupos de aves desafiadas a los 20, 24, 28, 32 y 36 WOA. Las letras (a–c) indican diferencias significativas entre los grupos vacunados y de desafío para cada semana (p < 0,05). −/−=no vacunados/no desafiados, más /−=vacunados/no desafiados, más / más=vacunados/desafiados, −/ más=no vacunados/desafiados.
3.2. Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV)
A los 5 dpc con NDV B1, las aves vacunadas/expuestas tenían cargas de ARN indetectables o cargas significativamente más bajas en comparación con los títulos de control positivo en todos los tiempos de recolección y en todos los tejidos muestreados (Tabla 3). Los controles negativos no desafiados y los controles vacunados dieron negativo para el virus de ARN usando el valor de CT mayor o igual a 35.0 como se informó anteriormente [22].
Tabla 3. Valores promedio de qRT-PCR CT para el ARN del NDV recolectado de la hendidura coanal, la glándula de Harder y la conjuntiva 5 días después de la exposición a la vacuna NDV B1. Las letras (a–c) indican diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de desafío para cada semana (p < 0.05).
Los signos clínicos medidos a los 5 dpc fueron significativos a las 20 WOA en los controles positivos, después de lo cual los signos clínicos en los controles positivos no fueron diferentes de los de los otros grupos de tratamiento (Tabla 4). No existieron diferencias significativas en los signos clínicos entre las aves vacunadas/expuestas y los controles no expuestos en ningún momento. En todas las semanas, el examen histopatológico de las tráqueas estuvo dentro de los límites normales o reveló traqueítis linfocítica mínima a leve de focal a multifocal, y no hubo diferencias relacionadas con el grupo.
También se evaluó la criostasis de las tráqueas, y ningún grupo exhibió criostasis.
Los títulos de IgG en suero específicos para el NDV en aves vacunadas/expuestas y controles vacunados fueron significativamente más altos que los títulos en los controles positivos y negativos en todos los tiempos de recolección (Figura 4). No hubo diferencias significativas en los títulos entre las aves vacunadas/expuestas y los controles vacunados en ningún momento. De manera similar, no se detectó una diferencia significativa en los títulos entre los controles negativos/no vacunados/desafiados, excepto en 28 WOA en los que los títulos de los controles no vacunados/desafiados fueron significativamente más altos.
Tabla 4. Los signos clínicos se midieron 5 días después de la exposición a NDV B1. Las letras (a–b) indican diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de exposición para cada semana (p < 0.05).
Figura 4. Los títulos de IgG específicos de NDV en suero se recolectaron 5 días después del desafío con la vacuna NDV B1 para diferentes grupos de aves desafiadas a los 20, 24, 28, 32 y 36 WOA. Las letras (a–c) indican diferencias significativas entre los grupos vacunados y de desafío para cada semana (p < 0,05). −/−=no vacunados/no desafiados, más /−=vacunados/no desafiados, más / más=vacunados/desafiados, −/ más=no vacunados/desafiados.
3.3. Virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV)
A los 5 dpc con la cepa ILTV 63140, las aves vacunadas/expuestas tenían cargas de ADN viral significativamente más bajas que los controles positivos en todos los tiempos de recolección y en todos los tejidos (Tabla 5). Las cargas de ADN en la tráquea y HG eran indetectables o bajas y no diferían significativamente de las cargas de ADN en los controles vacunados y negativos no desafiados, que fueron negativos usando el valor de CT mayor o igual a 38,0 como se informó anteriormente [26]. En la conjuntiva, las cargas de ADN en las aves vacunadas/expuestas fueron significativamente más altas que las cargas de ADN de los controles vacunados y negativos no expuestos, excepto en 28 WOA en los que no se detectaron diferencias significativas entre las aves vacunadas/expuestas y los controles vacunados.
Tabla 5. Valores promedio de qPCR CT para el ADN de ILTV recolectado de la tráquea, la glándula de Harder y la conjuntiva 5 días después del desafío con la cepa patógena de ILTV 63140. Las letras (a–c) indican diferencias significativas entre los grupos vacunados y de desafío para cada semana (p < 0,05).
Los signos clínicos y el ADN viral se detectaron en las aves desafiadas a los 3 DPC, pero los signos en los controles positivos se volvieron más severos a los 5 dpc a medida que aumentaba la carga viral traqueal (Tabla 6). Los puntajes de los signos clínicos medidos a los 5 dpc se redujeron significativamente en las aves vacunadas/expuestas en comparación con los controles positivos, en todos los puntos de recolección excepto en 36 WOA cuando los puntajes de los signos clínicos se redujeron numéricamente. Todos los controles negativos y los controles vacunados no tenían signos clínicos, y los signos clínicos en las aves vacunadas/expuestas no fueron significativamente diferentes en comparación con estos controles, excepto en 36 WOA cuando las puntuaciones de los signos clínicos fueron significativamente más altas.
Tabla 6. Los signos clínicos se midieron 5 días después de la exposición a ILTV 63140. Las letras (a–b) indican diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de exposición para cada semana (p < 0,05).
El examen histológico traqueal estuvo dentro de los límites normales o reveló traqueítis linfocítica mínima a leve de focal a difusa en las tráqueas de todos los grupos. Para los controles positivos, 3/9 y 1/10 en las semanas 20 y 28, respectivamente, tenían traqueítis necrotizante focal aguda con sincitios e inclusiones intranucleares (Figura 5).
Figura 5. Las lesiones microscópicas traqueales son compatibles con una infección por laringotraqueítis infecciosa a las 20 semanas de edad. (A) Numerosos sincitios con inclusiones intranucleares (flecha). (B) Otra tráquea del mismo grupo demostró sincitios con inclusiones intranucleares (flecha).
No se observó iconostasio en las tráqueas de las aves de ninguno de los grupos.
Los títulos de IgG específicos de ILTV en el suero recolectado 5 días después de la exposición fueron significativamente más altos en las aves vacunadas de los grupos expuestos y no expuestos, en comparación con los controles positivo y negativo (Figura 6).
Figura 6. Los títulos de IgG específicos de ILTV en suero se recolectaron 5 días después del desafío con la cepa ILTV 63140 para diferentes grupos de aves desafiadas a los 20, 24, 28, 32 y 36 WOA. Las letras (a–b) indican diferencias significativas entre la vacuna y los grupos de exposición para cada semana (p < 0,05). −/−=no vacunados/no desafiados, más /−=vacunados/no desafiados, más / más=vacunados/desafiados, −/ más=no vacunados/desafiados.
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