El efecto del inhibidor de STAT6 AS1517499 en el tratamiento de la Fibrosis Renal
Mar 24, 2022
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PARTE Ⅰ: La inhibición farmacológica de STAT6 mejora la activación de fibroblastos mieloides y la polarización alternativa de macrófagos en la fibrosis renal
Baihai Jiao, Changlong An, Melanie Tran, Hao Du, Penghua Wang, Dong Zhou y Yanlin Wang
INTRODUCCIÓN
La enfermedad renal crónica (ERC) se ha convertido en un importante desafío para la salud pública(1). La fibrosis es la vía común última para el desarrollo de la ERC y se considera un factor importante para la progresión de todas las formas de la ERC(2).fibrosis renales una característica patológica de la ERC, que lleva al reemplazo de la estructura normal del tejido renal con matriz extracelular (ECM) con daño progresivo e irreversible a la función renal (3). Sin embargo, a pesar de una mayor comprensión de los mecanismos moleculares defibrosis renal, no existe un tratamiento específico para controlar la fibrosis y restablecer la función renal. Dado que el origen y la contribución funcional de los fibroblastos no se comprenden por completo, sigue siendo un desafío abordar de manera efectiva los fibroblastos en la fibrosis de órganos.
La evidencia acumulada indica que los miofibroblastos mieloides denominados fibrocitos juegan un papel crucial en el proceso de fibrosis (4-7). Nosotros y otros hemos demostrado previamente que el reclutamiento de fibroblastos derivados de la médula ósea aumenta la progresión y el desarrollo derenalfibrosis(8-12). Por lo tanto, dirigirse a estas células puede servir como una estrategia terapéutica eficaz para tratar la enfermedad renal crónica. Los fibroblastos derivados de la médula ósea comparten las características de las células mesenquimales y las células hematopoyéticas(13,14). Sin embargo, varias citocinas producidas en el microambiente local determinan la diferenciación de los fibroblastos derivados de la médula ósea. Hemos demostrado previamente que las citocinas Th2 (I-4 e IL-13), que se consideran citocinas profibróticas, mejoran la expresión de colágeno tipo I, fibronectina y -SMA en monocitos derivados de la médula ósea (15 , dieciséis).
STAT6la señalización se activa principalmente por citocinas Th2 como IL-4 e IL-13 y está asociada con la patogenia de pulmón (17,18), hígado (19) yrenalfibrosis(15, 20). Recientemente hemos demostrado que JAK3/STAT6juega un papel crucial en la activación de los fibroblastos derivados de la médula ósea y el desarrollo derenalfibrosisen la nefropatía obstructiva(15). Además, hemos demostrado que la eliminación de IL-4Ro inhibeSTAT6activación, acumulación de fibroblastos mieloides y transformación en miofibroblastos, polarización de macrófagos M2 y desarrollo derenalfibrosisdespués de una lesión obstructiva o la administración de ácido fólico(16). Estos hallazgos sugieren que elSTAT6vía de señalización puede servir como un nuevo objetivo terapéutico pararenalfibrosis.
En este estudio, evaluamos el papel terapéutico potencial deAS1517499, un potente y selectivoSTAT6inhibidor (21), en la activación de fibroblastos mieloides y el desarrollo derenalfibrosisen dos modelos murinos experimentales. Nuestros resultados demuestran queAS1517499abolidoSTAT6activación en las células intersticiales del riñón con lesión obstructiva o nefropatía por ácido fólico. Además, la administración deAS1517499suprime la activación de fibroblastos mieloides, reduce la polarización de macrófagos M2 y atenúarenalfibrosis. Estos hallazgos sugieren que la inhibición deSTAT6conAS1517499tiene el potencial para el tratamiento de la enfermedad renal fibrótica.
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RESULTADOS
AS1517499 inhibe la activación de STAT6 en el riñón con lesión obstructiva
Hemos informado que JAK3/STAT6la señalización se activa en las células intersticiales de los riñones fibróticos después de una lesión obstructiva o de la administración de ácido fólico(15,16). Para evaluar siSTAT6puede servir como diana terapéutica para el tratamiento derenalfibrosis, los ratones de tipo salvaje se sometieron a una lesión obstructiva y luego se trataron con vehículo oAS1517499, a STAT6-inhibidor específico, cada dos días durante 10 días. Se realizaron tinciones inmunohistoquímicas y análisis de transferencia Western para examinarSTAT6activación en el riñón. La tinción inmunohistoquímica reveló que el fósforo positivoSTAT6la tinción se detectó principalmente en las células intersticiales del riñón con nefropatía obstructiva, que se redujo porAS1517499tratamiento (Figuras 1A, B). De acuerdo con estos hallazgos, el análisis de transferencia Western mostró el nivel de fosfo-STAT6fue inhibida en el riñón con nefropatía obstructiva después deAS1517499tratamiento (Figuras 1C, D). Estos datos indican que la inhibición deSTAT6conAS1517499previeneSTAT6activación en el riñón con nefropatía obstructiva.AS1517499Deteriora la acumulación de fibroblastos mieloides en la nefropatía obstructiva La evidencia acumulada indica que el reclutamiento de fibroblastos mieloides contribuye significativamente a la patogénesis derenalfibrosis. Para investigar siAS1517499afecta la acumulación de fibroblastos mieloides, las secciones de riñón se tiñeron para el marcador hematopoyético CD45 y el marcador mesenquimatoso PDGFR-.
FIGURA 1|AS1517499 inhibe la activación de STAT6 en el riñón con lesión obstructiva.(A) Fotomicrografías representativas de secciones de riñón en el día 10 de UUO teñidas para fosforiladoSTAT6(marrón) y contrastado con hematoxilina (azul). Barra de escala, 50um. (B) Análisis cuantitativo de fosforiladosSTAT6-células positivas en el riñón.***P<0.001 vs.=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" levels="" of="">STAT6ySTAT6en el riñón el día 10 de UUO. (D) Análisis cuantitativo p-STAT6niveles de proteína en el riñón, ***P<0.001 vs=""><0.05 vs="" vehicle-uuo;="">< 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
El número de células CD45 y PDGFR-dobles positivas aumentó significativamente en los riñones obstruidos, mientras queAS1517499el tratamiento redujo notablemente las células positivas duales CD45 y PDGFR (Figuras 2A, B). Estos datos sugieren queSTAT6inhibidorAS1517499mejora la acumulación de fibroblastos mieloides en el riñón después de una lesión obstructiva.AS1517499Atenúa la polarización de los macrófagos M2 en la nefropatía obstructiva La transformación de los monocitos en fibroblastos derivados de la médula ósea está mediada por la polarización de los macrófagos M2.STAT6juega un papel clave en la polarización de los macrófagos M2. Por lo tanto, examinamos si la inhibición deSTAT6conAS1517499media la polarización de los macrófagos. Las secciones de riñón se tiñeron para CD206 (marcador de macrófagos M2) y las células positivas duales de PDGFR-. CD206 y PDGFR- aumentaron notablemente en el riñón de ratones con lesión obstructiva. A diferencia de,AS1517499redujo significativamente el número de células CD206 plus y PDGFR-plus en riñones con nefropatía obstructiva (Figuras 2C, D). Estos datos indican queAS1517499atenúa significativamente la transición de monocitos a fibroblastos mieloides y reduce la polarización de macrófagos M2.
FIGURA 2 |AS1517499 atenúa la acumulación de fibroblastos mieloides y la polarización de macrófagos en el riñón con lesión obstructiva.(A) Fotomicrografías representativas de secciones de kidhey en el día 10 de UUO teñidas para CD45 (rojo), PDGFR- (verde) y DAPI (azul) Barra de escala, 50 μm. B） Análisis cuantitativo de fibroblastos CD45* y PDGFR-* en el riñón.**P<0.001 vs=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)representative="" photomicroaraphs="" of="" the="" kidney="" at="" day="" 10ofuuo="" stained="" for="" cd206="" (red).pdgfr-b="" (green).and="" dapiblue).scale="" bar.,50um.(d)="" quantitative="" analysis="" of="" cd206t="" and="" pdgfr-b+="" fibroblasts="" in=""><0.01 ys=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (e)quantitative="" analysis="" of="" mrnaexpression="" of="" m2="" macrophage="" markers="" (mrc.fzz1.arg1.ccl17="" in="" the="" kidney="" of="" vehide="" or="">AS1517499ratones tratados.*P<><><0.05 vs=""><><0.05 vs=""><><0.05vs as-uuo.n="6" per="">
Para evaluar más a fondo el efecto deSTAT6inhibidorAS1517499en la polarización de macrófagos M2, se realizó RT-PCR en tiempo real para detectar expresiones de ARNm de marcadores de macrófagos M2.AS1517499el tratamiento suprimió la expresión abundante de ARNm de Argl, MRCl, Fizzl y CCL17 en los riñones obstruidos (Figura 2E). Estos datos indicanSTAT6tinción de inmunofluorescencia de señalización y análisis de transferencia Western. La tinción de inmunofluorescencia y el análisis de transferencia Western revelaron que los niveles de fibronectina y colágeno I aumentaron notablemente en el riñón obstruido, mientras queAS1517499el tratamiento atenuó significativamente los niveles de proteína de colágeno I y fibronectina en el riñón obstruido (Figuras 4C-H).
FIGURA 3|AS1517499 reduce la formación de miofibroblastos en el riñón con lesión obstructiva.(A) Microfotografías representativas de secciones de riñón tratadas con UUO teñidas para a-SMA (verde) y contrateñidas con DAPI (azul). Barra de escala, 50mm. (B) Análisis cuantitativo del área positiva de a-SMA en el riñón. ***P < 0.001="" frente="" a="" vehículo-con,="" #="" p="">< 0.05="" frente="" a="" vehículo-uuo,="" más="" más="" p="">< 0,01="" vs="" as-uuo.="" n="6" por="" grupo.="" (c)="" las="" transferencias="" western="" representativas="" muestran="" niveles="" de="" proteína="" a-sma="" en="" el="" riñón.="" (d)="" análisis="" cuantitativo="" de="" la="" expresión="" de="" la="" proteína="" a-sma="" en="" el="" riñón.="" ***p="">< 0,001="" frente="" a="" vehicle-con,="" ##p="">< 0,01="" frente="" a="" vehicle-uuo,="" plus="" plus="" p="">< 0,01="" frente="" a="" as-uuo.="" n="6" por="">
FIGURA 4|AS1517499 atenúa la fifibrosis renal y la producción de proteína ECM en el riñón con lesión obstructiva.(A) Fotomicrografías representativas de secciones de riñón teñidas con rojo Sirius para evaluar la deposición total de colágeno en el riñón. Barra de escala, 50 mm. (B) Análisis cuantitativo del depósito de colágeno intersticial en el riñón. ***PAGS<0.001 vs="" vehicle-con.="" ##p="" <="" 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" fibronectin="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (d)="" quantitative="" analysis="" of="" the="" fibronectin-positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" vehicle-con.="" ##p="" <="" 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" +="" p="" <="" 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (e)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" collagen="" i="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (f)="" quantitative="" analysis="" of="" collagen="" i="" positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" vehicle-con.="" #="" p="" <="" 0.05="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (g)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" expression="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" (h)="" quantitative="" analysis="" of="" protein="" levels="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" veh-con;="" ##p="" <="" 0.01,="" #="" p="" <="" 0.05="" vs="" veh-uuo;="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
AS1517499 InhibeSTAT6Activación en nefropatía por ácido fólico
La nefropatía por ácido fólico es otro modelo murino comúnmente usado derenalfibrosis. Por lo tanto, examinamos siAS1517499puede inhibirSTAT6activación y patogenia derenalfibrosisen la nefropatía por ácido fólico. Las secciones de riñón se tiñeron para fosfo-STAT6.STAT6la fosforilación se indujo significativamente en las células intersticiales del riñón con nefropatía FA, mientras queAS1517499el tratamiento inhibió notablemente la expresión de fosfo-STAT6 (Figuras 5A, B). Estos hallazgos se confirmaron aún más mediante análisis de transferencia Western (Figuras 5C, D). Estos datos indican queSTAT6se activa en las células intersticiales del riñón dañado con nefropatía por ácido fólico, que se inhibe significativamente despuésAS1517499tratamiento.
FIGURA 5|AS1517499 inhibe la activación de STAT6 en la nefropatía por ácido fólico.(A) Imágenes representativas de la tinción inmunohistoquímica de fosforiladosSTAT6en el riñón 2 semanas después del vehículo oAS1517499tratamiento. Barra de escala, 50 mm. (B) Análisis cuantitativo de fosforiladosSTAT6-células positivas en el riñón 2 semanas después del vehículo oAS1517499tratamiento. ***P < {{0}}.001="" contra="" con;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="" grupo.="" (c)="" western="" blot="" representativo="" de="">STAT6ySTAT6en el riñón. (D) Análisis cuantitativo p-STAT6niveles de proteína en el riñón. ***P < {{0}}.001="" contra="" con;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="">
AS1517499suprime la acumulación de fibroblastos mieloides en la nefropatía por ácido fólico Examinar el papel deAS1517499en la acumulación de fibroblastos mieloides en el riñón con nefropatía por ácido fólico, realizamos doble tinción de inmunofluorescencia para CD45 y PDGFR-. El número de células CD45 y PDGFR-dobles positivas aumentó en el riñón con nefropatía por ácido fólico.AS1517499suprimió considerablemente el número de células positivas duales CD45 y PDGFR en el riñón con nefropatía por ácido fólico (Figuras 6A, B).
AS1517499Atenúa la polarización de los macrófagos M2 en la nefropatía por ácido fólico Luego examinamos si la inhibición farmacológica deSTAT6conAS1517499regula la polarización de los macrófagos M2 en la nefropatía FA. Según lo confirmado por el análisis de tinción de inmunofluorescencia, el tratamiento deAS1517499inhibió significativamente el número de células positivas duales CD206 y PDGFR en comparación con ratones tratados con vehículo con administración de FA (Figuras 6C, D). Además, se indujeron marcadores de macrófagos M2, Argl, MRC1, Fizzl y CCL17 en la nefropatía por ácido fólico. Estos marcadores de macrófagos M2 se redujeron despuésAS1517499tratamiento (Figura 6E). Estos datos indican que la inhibición farmacológica deSTAT6conAS1517499atenúa la polarización de macrófagos M2 en el riñón con nefropatía FA.
FIGURA 6|AS1517499 atenúa la acumulación de fibroblastos mieloides y la polarización de macrófagos en la nefropatía por ácido fólico.(A) Fotomicrografías representativas de secciones de riñón 2 semanas después del vehículo oAS1517499tratamiento teñido para CD45 (rojo), PDGFR-b (verde) y DAPI (azul). Barra de escala, 50mm. (B) Análisis cuantitativo de CD45 plus y PDGFR-b plus fibroblastos en el riñón. **P < 0.01="" frente="" a="" con.="" #="" p="">< 0.05="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="" grupo.="" (c)="" fotomicrografías="" representativas="" de="" secciones="" de="" riñón="" 2="" semanas="" después="" del="" vehículo="">AS1517499tratamiento teñido para CD206 (rojo), PDGFR-b (verde) y DAPI (azul). Barra de escala, 50mm. (D) Análisis cuantitativo de CD206 plus y PDGFR-b plus fifibroblastos en el riñón. ***P < 0,001="" frente="" a="" con.="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="" grupo.="" (e)="" análisis="" cuantitativo="" de="" la="" expresión="" del="" arnm="" de="" los="" fabricantes="" de="" macrófagos="" m2="" (mrc,="" fizz1,="" arg1,="" ccl17)="" en="" el="" riñón="" 2="" semanas="" después="" del="" vehículo="">AS1517499tratamiento. ***P < {{0}}.001="" contra="" con;="" ###p="">< 0,001="" frente="" a="" fa="" más="" veh;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="">
AS1517499Atenúa la formación de miofibroblastos en la nefropatía por ácido fólico Para determinar siAS1517499afecta la transformación de miofibroblastos, se examinó la expresión de -SMA en secciones de riñón y mediante análisis de transferencia Western. De acuerdo con nuestros hallazgos en el modelo UUO, los miofibroblastos positivos para -SMA y la expresión de la proteína -SMA aumentaron en el riñón después del tratamiento con FA en comparación con los ratones tratados con vehículo. Además, la coadministración de FA conAS1517499redujo significativamente las células positivas para -SMA y el nivel de proteína -SMA en el riñón en comparación con el grupo de vehículo coadministrado con FA (Figuras 7A-D). Estos resultados demuestran queAS1517499inhibe la formación de miofibroblastos en el riñón con nefropatía por ácido fólico.
FIGURA 7|AS1517499 reduce la formación de miofibroblastos en la nefropatía por ácido fólico.(A) Fotomicrografías representativas de secciones de riñón 2 semanas después del vehículo oAS1517499tratamiento teñido para a-SMA (verde) y contrateñido con DAPI (azul). Barra de escala, 50mm. (B) Análisis cuantitativo del área positiva de a-SMA en el riñón. ***P < 0.001="" contra="" con;="" ###p="">< 0.001="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="" grupo.="" (c)="" transferencias="" western="" representativas="" que="" muestran="" los="" niveles="" de="" proteína="" a-sma="" en="" el="" riñón="" 2="" semanas="" después="" del="" vehículo="">AS1517499tratamiento. (D) Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína a-SMA en el riñón. ***P < 0.001="" vs="" con,="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="">
Cistanche de maca ginseng
AS1517499 mejoraRenalFibrosisy preserva la función renal en la nefropatía por ácido fólico
Para evaluar el efecto deAS1517499enrenalfibrosisSe realizó tinción con rojo picrosirius en secciones de riñón. Los ratones tratados con FA tenían niveles notablemente elevados de depósito de colágeno, mientras queAS1517499el tratamiento redujo significativamente las cantidades de depósito de colágeno en el riñón (Figuras 8A, B). Además, la tinción de inmunofluorescencia y el análisis de transferencia Western demostraron además queAS1517499inhibe significativamente la expresión de proteínas ECM (fibronectina y colágeno I) en el riñón con nefropatía por ácido fólico (Figuras 8C-H). Estos datos sugieren queAS1517499inhibe la producción de ECM en el riñón y el desarrollo derenalfibrosisen la nefropatía por ácido fólico.
Para evaluar el efecto deSTAT6deficiencia en la función renal en la nefropatía por ácido fólico, se midió la creatinina sérica. Los ratones tratados con ácido fólico mostraron una elevación significativa de la creatinina sérica (Figura 8I). Por el contrario, los ratones tratados conAS1517499mostró una creatinina sérica mucho más baja en la nefropatía por ácido fólico. Estos resultados indican que la inhibición deSTAT6conAS1517499protege al riñón de la nefropatía por ácido fólico.
FIGURA 8|AS1517499 reduce la fifibrosis renal y preserva la función renal en la nefropatía por ácido fólico. (A) Fotomicrografías representativas de secciones de riñón 2 semanas después del vehículo oAS1517499tratamiento teñido con rojo Sirio para evaluación del depósito total de colágeno en el riñón. Barra de escala, 50mm. (B) Análisis cuantitativo del depósito de colágeno intersticial en el riñón. ***P < 0.0{{10}}1="" contra="" con,="" ##p="">< 0.01="" contra="" fa="" más="" veh="" .="" n="6" por="" grupo.="" (c)="" fotomicrografías="" representativas="" de="" secciones="" de="" riñón="" teñidas="" para="" fibronectina="" (verde)="" y="" contrateñidas="" con="" dapi="" (azul).="" barra="" de="" escala,="" 50mm.="" (d)="" análisis="" cuantitativo="" del="" área="" positiva="" para="" fifibronectina="" en="" riñones="" tratados="" con="" af.="" ***p="">< 0,001="" vs="" con,="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="" grupo.="" (e)="" fotomicrografías="" representativas="" de="" secciones="" de="" riñón="" teñidas="" para="" colágeno="" i="" (verde)="" y="" contrateñidas="" con="" dapi="" (azul).="" barra="" de="" escala,="" 50="" mm.="" (f)="" análisis="" cuantitativo="" del="" área="" positiva="" de="" colágeno="" i="" en="" el="" riñón.="" ***p="">< 0,001="" frente="" a="" con,="" #="" p="">< 0,05="" frente="" a="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="" grupo.="" (g)="" transferencias="" de="" western="" representativas="" que="" muestran="" la="" expresión="" de="" proteínas="" de="" fibronectina="" y="" colágeno="" i="" en="" el="" riñón.="" (h)="" análisis="" cuantitativo="" de="" los="" niveles="" de="" proteína="" de="" fibronectina="" y="" colágeno="" i="" en="" el="" riñón.="" ***p="">< 0,001="" frente="" a="" con;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="" grupo.="" (i)="" efecto="">AS1517499sobre la creatinina sérica. **P < {{0}}.001="" contra="" con;="" #="" p="">< 0.05="" vs="" fa="" más="" veh.="" n="6" por="">
La hierba medicinal china tradicional:cistanche
Nota: La medicina tradicional chinahierba cistanche(también conocido como "hierba de dragón" y "ginseng del desierto"), crece solo en los desiertos áridos y cálidos. Como una de las nueve hierbas inmortales,Cistanche(Cistanche tubulosa/Cistanche desertica/cistanche del desierto/salsa cistanche)contiene ricos ingredientes efectivos como echinacoside, acteoside, glucósidos feniletanoides totales, flavonoides, polisacáridos, etc. estudios farmacológicos modernos han confirmado lo siguienteefectos de la cistanche(beneficios de la cistanche): mejorar la inmunidad; mejorar la función sexual y la función renal; anti fatiga; antienvejecimiento; mejorar la memoria; enfermedad anti-Parkinson; enfermedad anti-Alzheimer; antioxidación; alivio del estreñimiento; antiinflamatorio; promover el crecimiento óseo, blanquear la piel; proteger el hígado; etc.
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