Efectos del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa sobre la microbiota intestinal de ratones con trastornos intestinales

Xiaowei Bao, Dongwen Bai, Xiaolu Liu, Ying Wang, Lanjun Zeng, Chenye Wei y Weiquan Jin

Facultad de Ciencias de la Alimentación y Farmacia, Universidad Agrícola de Xinjiang, Urumqi 830052, China

La correspondencia debe dirigirse a Xiaowei Bao; xiaoweibao0723@xjau.edu.cn

Recibido el 29 de abril de 2021; Aceptado el 30 de junio de 2021; Publicado 14 julio 2021

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite correctamente el trabajo original.

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resumen

Los trastornos de la microbiota intestinal están asociados con muchas enfermedades. El extracto acuoso deCistanchetubulosa(CT), una fórmula herbal china tradicional, se ha informado que desempeña un papel en la protección del intestino humano. Sin embargo, se sabe poco sobre sus efectos sobre la microbiota intestinal. El presente estudio se llevó a cabo para determinar si laCistanchetubulosael extracto acuoso puede modular el microbioma intestinal en ratones con trastornos intestinales. Descubrimos que la morfología intestinal dañada como resultado del tratamiento con cefixima podría rescatarse usando elCistanchetubulosaextracto acuoso. La comparación de la diversidad microbiana entre los ratones tratados con el extracto de Cistanche Tubulosa y los ratones de control también indicó que el trastorno en la comunidad de microbiomas de los grupos modelo podría restaurarse mediante el tratamiento con concentraciones altas y medias de laCistanchetubulosaextracto acuoso. El tratamiento con cefixima condujo a una disminución significativa de las bacterias del ácido láctico; sin embargo, la complementación de laCistanchetubulosaextracto acuoso recuperó el crecimiento de estas bacterias ácido lácticas. Además, elCistanchetubulosaEl extracto acuoso pudo moderar los cambios drásticos en las vías metabólicas del microbioma intestinal inducidos por la cefixima. Estos hallazgos proporcionaron una idea de los efectos beneficiosos del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa en la microbiota intestinal y también proporcionaron una referencia importante para el desarrollo de fármacos relacionados en el futuro.

Cistanchetubulosatiene muchos efectos, haga clic aquí para saber más

1. Introducción

Los microorganismos intestinales colonizan principalmente la luz intestinal y la capa mucosa y se mutualizan con el huésped a través del intercambio de materia y energía, la transformación y otros procesos [1]. *Son centros de señalización que integran mensajes ambientales, como la dieta, con señales genéticas e inmunitarias, lo que en consecuencia afecta el metabolismo, la inmunidad, el sistema nervioso y la respuesta a las infecciones del huésped [2]. Normalmente, existe un equilibrio dinámico entre la flora intestinal y los huéspedes; sin embargo, la disbiosis intestinal puede provocar cambios en el equilibrio salud/enfermedad, trastornos inmunológicos y una multitud de enfermedades [3]. Los cambios moderados en la microbiota intestinal son aceptables para el huésped; sin embargo, esto aún puede brindar oportunidades para amplificar los cambios en otros factores agravantes, como los bacteriófagos, las bacteriocinas y el estrés oxidativo [4].

Estudios previos han demostrado que el extracto de etanol de Cistanche tubulosa (CT), una fórmula herbal china tradicional, puede regular la composición microbiana intestinal en ratas [5], y los glucósidos totales de Cistanche tubulosa ajustan la microbiota intestinal desordenada [6]. Las especies de Cistanche, que parasitan principalmente las raíces de las especies de Tamarix, también se denominan "ginseng del desierto", y un tónico que consiste en los tallos de Cistanche deserticola (CD) y Cistanche tubulosa (CT) se usa como remedio a base de hierbas [7 ]. Se descubrió que los principales componentes químicos de los glucósidos de feniletanol (PHG) de Cistanche Tubulosa, que son sustancias antioxidantes [8, 9], mejoran la disfunción reproductiva [10], suprimen la activación de las células estrelladas hepáticas y bloquean la conducción de las vías de señalización en TGF{{6 }}/SMAD [11], y prevenir la fibrosis hepática inducida por albúmina sérica bovina en ratas [12]. Entre más de 100 componentes en Cistanche Tubulosa, el polisacárido es también una de las sustancias importantes con abundante contenido [13, 14]. Estudios previos han demostrado que los polisacáridos de C. deserticola inducen la melanogénesis en los melanocitos, reducen el estrés oxidativo[15], alivian la disfunción cognitiva al regular los procesos antioxidantes y antiinflamatorios en ratas [16], protegen las células PC12 contra las lesiones inducidas por OGD/RP [17] , mejoran la absorción de equinacósido in vivo y afectan la microbiota intestinal [18].

Los probióticos son microorganismos vivos no patógenos que tienen beneficios para la salud y confieren equilibrio microbiano en el tracto gastrointestinal cuando se administran en cantidades adecuadas [19]. *Pueden mejorar las respuestas inmunitarias celulares no específicas caracterizadas por la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK) y especificidad de antígeno para los linfocitos T tóxicos y la liberación de varias citoquinas en una forma específica de cepa y dependiente de la dosis [20 ]. Las cepas probióticas mejoran las propiedades del epitelio intestinal a través de la modulación de TJ, y se ha demostrado que cepas probióticas específicas regulan la expresión de mucina, lo que influye en las propiedades de la capa mucosa y regula indirectamente el sistema inmunitario intestinal [21]. Las cepas de bacterias del ácido láctico (LAB) y Bifidobacterium son los principales probióticos que se han utilizado en muchos campos [22-26]. Sus beneficios para la salud son numerosos, siendo su capacidad antioxidante un factor importante en sus funciones relacionadas con la salud[27]. Los probióticos pueden quelar iones metálicos para evitar que catalicen la oxidación [28, 29]; también pueden aumentar la expresión de enzimas antioxidantes [30, 31], producir varios metabolitos con actividad antioxidante [32, 33], mediar en las vías de señalización antioxidantes [34–36] y regular las enzimas que producen especies reactivas de oxígeno (ROS) y la respuesta de los microorganismos intestinales al estrés oxidativo[37].

flor de cistanche

Un estudio reciente demostró que los polisacáridos de Cistanche Deserticola podrían estimular el crecimiento de algunas bacterias del ácido láctico, lo que podría beneficiar la salud humana [38]. Sin embargo, el contenido de polisacáridos en la Cistanche Deserticola es diferente al de la Cistanche Tubulosa [7, 39], y esta diferencia puede conducir a diferentes efectos sobre los microorganismos intestinales. Además, aunque los polisacáridos de Cistanche Deserticola pueden reducir el estrés oxidativo al activar la vía NRF2/HO-1 [15], los efectos de un solo polisacárido pueden diferir del efecto general de múltiples composiciones en Cistanche Tubulosa. Por lo tanto, es necesario definir con precisión los efectos de los extractos acuosos de Cistanche Tubulosa sobre los microorganismos intestinales. Además, las PHG también pueden resistir el estrés oxidativo [40] y suprimir las respuestas inflamatorias mediadas por lipopolisacáridos al activar la vía theKeap1/Nrf2/HO-1 [41]. Por lo tanto, determinar el efecto del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa es de gran valor. Además, los efectos de ciertos componentes del extracto acuoso de Cistanche Deserticola sobre el estrés oxidativo y la flora intestinal sugieren que la resistencia al estrés oxidativo podría estar correlacionada con cambios en la flora intestinal.

Para llenar los vacíos en el conocimiento sobre los temas mencionados anteriormente, investigamos los efectos del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa en la microbiota intestinal de ratones con trastornos de la flora intestinal. Estos resultados proporcionarán información valiosa sobre los posibles mecanismos a través de los cuales Cistanche Tubulosa cambia la flora intestinal y confiere resistencia intestinal al estrés oxidativo.

2. Materiales y métodos

2.1. Animales Experimentales.

Se compraron un total de 18 ratones macho C57BL/6J de clase SPF, con un peso de 18 a 22 g, del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Xinjiang con el número de licencia SCXK (nuevo) 2018-0003. Se alojaron en jaulas en condiciones estandarizadas: fotoperíodo de 12 h de luz/oscuridad, temperatura de 23 ± 2 grados y humedad de 55 ± 5 por ciento. *Los animales fueron alimentados con una dieta comercial (51 % de extracto libre de nitrógeno, 25 % de proteína cruda, 4,6 % de grasa cruda, 6,5 % de ceniza cruda, 4,0 % de fibra cruda y 8,9 % de humedad) y agua del grifo . *Los animales fueron tratados de acuerdo a las recomendaciones descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

2.2. Extracción del Extracto Acuoso.

Rodajas secas de C. tubulosa, proporcionada por Hotan Dichen PharmaceuticalBiotechnology Co., Ltd., se molieron en polvo y se seleccionaron gránulos con tamaños de partículas entre 20 y 40 mallas. Las condiciones de extracción fueron las siguientes: relación sólido-líquido de 1:19, temperatura de 80 grados, tiempo de microondas de 6 min, tiempo de ultrasonido de 16 min, potencia de microondas de 400 W y potencia ultrasónica de 400 W. Los contenidos de los componentes principales del extracto acuoso se midieron por HPLC (Agilent 1260 Infinity II, California, EE. UU.). En resumen, las sustancias estándar de echinacósido (0,2 mg/ml) y acteósido (0,2 mg/ml) se disolvieron en metanol al 50 por ciento para servir como solución de sustancia de referencia. Luego, se disolvió 1 g del extracto acuoso de CT en 100 ml de metanol al 50 por ciento y se dejó reposar durante 30 min. La solución del extracto se trató con ultrasonido a 250 W y 35 kHz durante 10 min y posteriormente se centrifugó a 12,000 rpm/min. El sobrenadante se infiltró con un filtro de membrana microporoso de 0,45 μm. A continuación, la solución de la sustancia de referencia y el filtrado se detectaron mediante HPLC en las siguientes condiciones: gel de sílice enlazado con octadecilsilano como relleno, metanol como fase móvil A y ácido fórmico al 0,1 por ciento como fase móvil B. La temperatura de la columna se fijó en 30ºC. grado, la longitud de onda de detección se fijó en 330 nm y el volumen de inyección fue de 10 μL.

2.3. Experimentos.

Después de una semana de adaptación, los 18 ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos: A (normal con extracto acuoso de Cistanche Tubulosa en dosis media añadida), B (normal sin extracto acuoso de Cistanche Tubulosa), C (modelo sin extracto acuoso), D (modelo con dosis alta de extracto acuoso de Cistanche Tubulosa añadido), E (modelo con dosis media de extracto acuoso de Cistanche Tubulosa añadido) y F (modelo con dosis baja de extracto acuoso de Cistanche Tubulosa añadido). Los grupos se trataron de la siguiente manera: el grupo normal se empapó con solución salina normal, el grupo modelo se empapó con cefixima (30 mg/kg, Shiyao Group OuyiPharmaceutical Co., Ltd., Shijiazhuang, China) y solución salina normal, el alto El grupo de dosis media se empapó con cefixima y 221,14 mg/kg del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa, el grupo de dosis media se empapó con cefixima y 165,54 mg/kg del extracto acuoso, y el grupo de dosis baja se empapó con cefixima y 110,57 mg/kg del extracto acuoso. El grupo A se empapó con 165,54 mg/kg de extracto acuoso y no se añadió cefixima. La cefixima se administró diariamente a las 12:00 h, y las demás sustancias se administraron diariamente a las 15:00 h. Durante los experimentos, los grupos C, D, E y F se mantuvieron en el estado modelo de trastornos intestinales. * Las heces se recolectaron cada siete días en una mesa operable estéril y se almacenaron a -20 grados.

2.4. Observación Histopatológica del Colon de Ratón.

Al final del experimento, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y el contenido de su colon se recogió en una mesa operable estéril y se almacenó a -80 grados; al mismo tiempo, las muestras de tejido colónico se fijaron en formalina neutra al 10 por ciento. Luego, las muestras fueron deshidratadas usando un gradiente de concentración de etanol, hialinizadas usando xileno, embebidas en parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina-eosina. Los cambios morfológicos en la mucosa colónica se observaron y compararon usando un microscopio óptico. Se midió la longitud de las vellosidades y la profundidad de las criptas en el colon, y se calculó la relación entre la longitud de las vellosidades y la profundidad de las criptas (valor V/C) (51).

2.5. Extracción de ADN y construcción de bibliotecas. El ADN se extrajo de las heces utilizando el EZNA ®Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad del ADN se determinó con un fluorómetro (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, EE. UU.). Se diseñaron cebadores emparejados en la región V3-V4 del ADNr 16s para amplificar la región y producir fragmentos de ADN de 466 pb. *El cebador directo era 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-) y el cebador inverso era 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Cada volumen de PCR era de 25 μL, que contenía 2,5 μL de tampón de PCR 10 ×, 2 μL de dNTP, 1 μL de cada cebador y 20–30 ng de ADN molde. *es, los adaptadores indexados se adjuntaron al final de los amplicones para generar bibliotecas de secuenciación. Las bibliotecas se validaron usando un fluorómetro QuantiFluor™ y se cuantificaron a 10 nmol.

el acteósido en la cistanche puede estimular el sistema inmunológico

2.6. Secuenciación del gen 16s rRNA y análisis de la comunidad microbiana.

Se utilizó la plataforma Illumina (Illumina MiSeq) para obtener datos de extremos emparejados de 2 × 250 pb. Las unidades taxonómicas operativas (OTU) se obtuvieron utilizando el software Uparse a través de un agrupamiento estándar con un 97 por ciento de similitud. El algoritmo de asignación bayesiana ingenuo del clasificador RDP se utilizó para alinear las OTU con la versión 13.5 de la base de datos Greengene y realizar la anotación de especies. La diversidad alfa de la microbiota intestinal se calculó mediante los índices de Shannon y Simpson, y las diferencias entre grupos se analizaron mediante análisis discriminante lineal Tamaño del efecto (LEfSe). La diversidad beta se analizó mediante el análisis de coordenadas principales (PCoA) de las diferencias de Brady-Curtis. PICRUSt2 se utilizó para estimar la capacidad metabólica microbiana del microbioma intestinal [42].

2.7. Análisis de datos estadísticos.

SPSS 20 se utilizó para ANOVA unidireccional y los datos experimentales se expresaron como X ± S; X indica el valor promedio y S indica la desviación estándar.

3. Resultados

3.1. El efecto del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa en la morfología del colon.

Los compuestos representativos (equinacósido y acteósido) y sus concentraciones del extracto de Cistanche Tubulosa fueron validados por HPLC (Figura S1). Para determinar el efecto del extracto acuoso en el intestino, investigamos la longitud de las vellosidades del colon y la profundidad de los recesos después del tratamiento con el extracto acuoso de Cistanche Tubulosa. Las vellosidades del colon en los grupos de dosis normal y alta (A, B y D) eran más largas y parecidas a dedos, mientras que las vellosidades del colon en el modelo y los grupos de dosis baja (C y F) eran cortas y las puntas del colon las vellosidades estaban rotas (Figura 1). En consecuencia, la dosis alta de extracto acuoso de Cistanche Tubulosa aumentó significativamente la longitud de las vellosidades del colon y redujo la profundidad del receso en ratones con trastornos intestinales en comparación con los ratones del grupo modelo (P < 0.01).="" en="" contraste,="" la="" profundidad="" del="" receso="" no="" fue="" significativamente="" diferente="" entre="" el="" grupo="" de="" dosis="" alta="" y="" el="" grupo="" normal="" (p=""> 0.05) (Tabla S1). Estos resultados indicaron que la alta dosis del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa puede mejorar la morfología dentro del colon de ratones con trastornos intestinales.

3.2. El efecto del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa sobre la diversidad de la microbiota intestinal.

Realizamos la secuenciación del gen 16s rRNA para investigar la posible causa de los cambios morfológicos dentro del colon e investigar los cambios en la microbiota intestinal después del tratamiento con el extracto acuoso de CT. Se obtuvo un promedio de 100 553 etiquetas efectivas, con un rango de 77 734 a 125 144, a partir de los datos sin procesar (Tabla S2). Estas etiquetas se agruparon en 4932 OTU (Tabla S3). Luego analizamos la diversidad de la microbiota intestinal basándonos en Theseus. Los índices de Shannon y Simpson no mostraron diferencia entre el grupo A (normal con extracto acuoso de Cistanche Tubulosa) y el grupo B (normal sin extracto acuoso de CT) (Figura 2(a)). *Se indica que en los ratones sin tratamiento con cefixima, el extracto acuoso de CT podría no haber tenido efectos beneficiosos o perjudiciales adicionales sobre la diversidad de la microbiota intestinal. Sin embargo, la diversidad en el grupo modelo (C) mostró una tendencia decreciente en comparación con la de los grupos normales. * Los ratones tratados con extractos acuosos de CT en dosis altas y medias mostraron signos de recuperación de la diversidad, mientras que tal fenómeno no se observó en los ratones tratados con el extracto acuoso de CT en dosis bajas (Figura 2 (a)). Mientras tanto, el PCoA reveló que los extractos acuosos de dosis alta (D) y dosis media (E) administrados al grupo normal (A y B) y al grupo con trastorno intestinal tendían a tener distancias entre muestras más cortas que las del grupo modelo y las del grupo modelo. grupo de suplemento de extracto acuoso de dosis baja (F) (Figura 2(b)). Estos resultados indicaron que el extracto acuoso de CT podría ayudar a mejorar la diversidad de la microbiota intestinal en ratones con trastornos intestinales.

3.3. Cambios en la Composición de la Microbiota Intestinal Tratada con el Extracto Acuoso de Cistanche Tubulosa.

Los perfiles de composición de la microbiota se compararon entre diferentes grupos. A nivel de filo, la abundancia relativa de Proteobacteria en el grupo modelo fue mayor que en los otros grupos (Figura 3(a)). El aumento de Proteobacteria sugirió que la cefixima modificó el microbioma de los ratones modelo y que el extracto acuoso de CT podría beneficiar a la microbiota intestinal, ya que el aumento de la prevalencia de Proteobacteria es un marcador central de la flora intestinal alterada [43–45]. Además, a nivel de género, la abundancia relativa de Lactobacillus en el grupo modelo disminuyó en comparación con la de los grupos de dosis normal y alta; sin embargo, aumentó en comparación con el grupo de dosis media y baja (Figura 3 (b)). Estos resultados indicaron que la dosis alta de extracto acuoso podría promover el crecimiento de algunas bacterias del género Lactobacillus.

La microbiota diferencial entre los grupos estudiados se determinó adicionalmente de acuerdo con el análisis LEfSe. Este análisis mostró que, después del tratamiento con cefixima, las abundancias relativas de Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales y Chloroflflexi aumentaron significativamente, mientras que las abundancias relativas de lactobacillus, Eubacterium_nodatum_group, Pseudono cardiales y el grupo Christensenellaceae_R-7_disminuyó significativamente en comparación con los del grupo normal (Figura 4(a)). Sorprendentemente, cuando el grupo modelo se complementó con la dosis alta de extracto acuoso de CT, las abundancias relativas de Muribaculaceae, Lactobacillus, Kineosporiaceae, Eubacterium no datum group y Pedobacter aumentaron significativamente en comparación con las del grupo modelo. Mientras tanto, las abundancias relativas de Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostridium_9 y Candidatus Stoquefifichus disminuyeron significativamente en comparación con las del grupo modelo (Figura 4(b)).

3.4. Funciones de la Microbiota Intestinal Relacionadas con el Tratamiento con el Extracto Acuoso de Cistanche Tubulosa.

Utilizamos el software PICRUSt2 para predecir las rutas metabólicas de la microbiota intestinal, y el grupo normal se utilizó como referencia para analizar los cambios en otros grupos. Bajo el tratamiento con cefixima, aumentó la abundancia relativa de la degradación del etilbenceno, la biosíntesis de los péptidos no ribosómicos del grupo sideróforo y el metabolismo de los xenobióticos por las vías del citocromo P450; después del tratamiento con extractos acuosos de Cistanche Tubulosa en dosis altas y medias, su abundancia relativa volvió a los niveles normales. Mientras tanto, la abundancia relativa de la ruta del metabolismo de los cianoaminoácidos disminuyó con el tratamiento con cefixima; sin embargo, aumentó después del tratamiento con el extracto acuoso de CT en dosis altas. Además, en general, los cambios en las diferentes rutas de metabolitos después del tratamiento con cefixima fueron significativos en comparación con los del grupo normal; sin embargo, la adición del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa logró evitar cambios excesivos (Figura 5).

4. Discusión

La morfología del colon puede verse alterada por el crecimiento, la digestión y la absorción, la regulación inmunitaria y la reparación de lesiones intestinales[46–50]. La relación V/C puede reflejar de manera integral el estado digestivo del tracto intestinal y es directamente proporcional a la capacidad digestiva y de absorción del tracto intestinal [51, 52]. En el presente estudio, la biopsia de las vellosidades y el receso y los datos estadísticos mostraron que el extracto acuoso en dosis altas podría mejorar en parte la morfología defectuosa dentro del colon. Para investigar cómo el extracto acuoso cambia la morfología intestinal y afecta la microbiota intestinal, trabajamos hacia atrás a partir de los cambios en la flora intestinal. Encontramos que la abundancia relativa de Proteobacteria, un marcador central de la flora intestinal alterada, aumentó con el tratamiento con cefixima en comparación con el tratamiento sin cefixima. * Las abundancias relativas de otros marcadores centrales, Bacteroidetes y Firmicutes, no tuvieron cambios significativos, aunque estas actividades antioxidantes in vitro [56] y puede promover el crecimiento de algunas bacterias del ácido láctico, lo que podría beneficiar la salud del huésped [43]. Paralelamente, las Muribaculaceae son organismos probióticos vinculados a la longevidad [57]. Estos sugirieron que el mecanismo por el cual el extracto acuoso de CT mejora la microbiota intestinal puede ser la promoción o protección del crecimiento de organismos probióticos. Otra bacteria digna de mención fue la bacteria YE57. Aunque la dosis alta de extracto acuoso promovió la abundancia relativa de la bacteria YE57 en el presente estudio (Figura 4), estudios previos encontraron que su abundancia era mayor en el intestino normal que en el intestino tratado con residuos de té de hierbas de alta concentración [ 58] y que su abundancia se redujo tras la intervención con Bacillus licheniformis combinado con XOS (xilooligosacáridos) [59]. Por lo tanto, el papel de esta bacteria en la microbiota intestinal merece más estudio. Además, el número de muestra relativamente pequeño en este estudio podría causar una medida de falso positivo y falso negativo, y se sugiere un estudio futuro en muestras más grandes para validar los marcadores bacterianos identificados.

La composición del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa podría ser importante por sus efectos sobre la composición y los cambios funcionales en la microbiota intestinal de ratones con trastornos intestinales. Los PHG son componentes activos comunes que se encuentran en Cistanche Deserticola y Cistanche Tubulosa, y el equinacósido se identificó como el principal PNG en Cistache Tubulosas [60]. En las últimas décadas, se ha demostrado que el equinacósido posee muchas actividades farmacológicas, como efectos antienvejecimiento y neuroprotectores, mejora de la función cardíaca, reducción de la hiperlipidemia y la hiperglucemia, y prevención de la diabetes y el síndrome metabólico inducidos por la obesidad [53, 61–65] . De hecho, detectamos cambios en las rutas metabólicas de la microbiota intestinal.* El tratamiento con cefixima condujo al enriquecimiento de bacterias relacionadas con la degradación del etilbenceno y la biosíntesis de péptidos no ribosómicos del grupo sideróforo, mientras que los tratamientos con dosis altas y medias de Cistanche El extracto acuoso de Tubulosa podría paliar estos cambios, lo que indica que este extracto moderó la comunidad bacteriana relacionada con estas funciones. Además, el aumento del enriquecimiento bacteriano relacionado con la ruta del metabolismo de los cianoaminoácidos bajo el tratamiento con el extracto acuoso en dosis altas y su menor enriquecimiento en ratones modelo indicaron que el extracto acuoso de Cistanche Tubulosa puede promover el metabolismo del cianoaminoácido. *Los cambios en los metabolitos relevantes podrían proporcionar a este extracto acuoso actividades farmacológicas.

hierba cistanche

Aunque el mecanismo por el cual el extracto acuoso de Cistanche Tubulosa cambia la composición y función de la microbiota intestinal es complejo, existen algunas pistas para especular sobre el mecanismo potencial. Se ha informado que tanto las bacterias del ácido láctico como los extractos acuosos de Cistanche Tubulosa pueden antagonizar el estrés oxidativo. El estrés oxidativo que ocurre durante la inflamación es un factor común que exacerba los trastornos intestinales al reducir fuertemente la diversidad microbiana intestinal y promover el aumento de bacterias específicas (4). Por el contrario, las especies reactivas del oxígeno también promueven el crecimiento selectivo de grupos bacterianos a través de la respiración de nitrato y tetrationato. [66–68]; por ejemplo, las bacterias de la familia Enterobacteriaceae pueden crecer rápidamente como consecuencia de cambios en la composición de la flora intestinal en condiciones oxidativas durante la inflamación [69, 70]. La mayoría de los organismos vivos desarrollan defensas enzimáticas, defensas antioxidantes no enzimáticas y mecanismos de reparación para eliminar los radicales de oxígeno [71]. Sin embargo, estos sistemas antioxidantes nativos generalmente no son suficientes para prevenir el daño oxidativo en los organismos vivos. Varios antioxidantes sintéticos adicionales, incluidos el hidroxianisol butilado y el hidroxitolueno butilado, se han utilizado ampliamente para disminuir la oxidación, pero se ha cuestionado su seguridad [72, 73]. Por lo tanto, los investigadores han recurrido a la búsqueda de antioxidantes más seguros y naturales obtenidos a partir de sustancias naturales. Debido a la capacidad de los polisacáridos y las bacterias del ácido láctico para eliminar el estrés oxidativo, determinar el mecanismo antioxidante preciso de los extractos acuosos de Cistanche Tubulosa en la microbiota intestinal requiere más investigación en el futuro.

En conclusión, encontramos que el extracto acuoso de Cistanche Tubulosa pudo mejorar la microbiota intestinal en ratones con trastornos intestinales al promover la diversidad, moderar los cambios metabólicos y remodelar la estructura de la microbiota intestinal, y estos resultados pueden proporcionar una referencia para el desarrollo. de medicamentos relacionados en el futuro.

Disponibilidad de datos

La estadística de las unidades taxonómicas operativas entre cada muestra de datos utilizada para respaldar los hallazgos de este estudio se incluye en los archivos de información complementaria, y los datos de secuenciación de ARNr 16s utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio se publicarán una vez que se publiquen.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue apoyado financieramente por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81860766).

Materiales complementarios

Figura S1: Detección por HPLC del extracto acuoso de Cistanche tubulosa. (a) El pico de equinacósido y acteósido en el material de referencia aparece a los 5,066 min y 9,988 min por separado. (b) *El pico de equinacósido y acteósido en el extracto acuoso aparece a los 5,097 min y 10,076 min por separado, y las concentraciones son de 236 mg/g y 12,7 mg/g por separado. Tabla S1: la longitud de las vellosidades del colon y la profundidad de los recesos. Tabla S2: Información estadística de los datos de secuenciación del ARNr 16S. Cuadro S3: estadístico de las unidades taxonómicas operativas entre cada muestra. (material suplementario).

Referencias

[1] A. Heintz-Butchart y P. Wilmes, "Microbioma intestinal humano: la función importa", Trends in Microbiology, vol. 26, núm. 7, págs. 563–574, 2018.

[2] CA Thaiss, N. Zmora, M. Levy y E. Elinav, "El microbioma y la inmunidad innata", Nature, vol. 535, núm. 7610, págs. 65–74, 2016.

[3] G. Quaranta, M. Sanguinetti y L. Masucci, "Transplante de microbiota fecal: una herramienta potencial para el tratamiento de enfermedades del tracto reproductivo femenino humano", Frontiers in Immunology, vol. 10, pág. 2653, 2019.

[4] GA Weiss y T. Hennet, "Mecanismos y consecuencias de la disbiosis intestinal", Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 74, núm. 16, págs. 2959–2977, 2017.

[5] Y. Li, Y. Peng, P. Ma et al., "Efectos similares a los antidepresivos del extracto de Cistanche tubulosa en ratas con estrés crónico impredecible a través de la restauración de la homeostasis de la microbiota intestinal", Frontiers in Pharmacology, vol. 9, pág. 967, 2018.

[6] L. Fan, Y. Peng, J. Wang, P. Ma, L. Zhao y X. Li, "Los glucósidos totales de los tallos de Cistanche tubulosa alivian los comportamientos similares a la depresión: interacción bidireccional de los fitoquímicos y la microbiota intestinal, "Fitomedicina, vol. 83, artículo ID 153471, 2021.

[7] Y. Li, Y. Peng, M. Wang, P. Tu y X. Li, "Metabolismo gastrointestinal humano del extracto de agua de cistanche herba in vitro: elucidación del perfil metabólico basado en la identificación integral de metabolitos en jugo gástrico, jugo intestinal, bacterias intestinales humanas y microsomas intestinales", Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 65, núm. 34, págs. 7447–7456, 2017.

[8] H. Wang, Y. Sun, W.-C. Ye et al., "Feniletanoide antioxidante y glucósidos fenólicos de la flora de Picrorhiza Scrophularia", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol. 52, núm. 5, págs. 615–617, 2004.

[9] S.-L. Ji, K.-K. Cao, X.-X. Zhao et al., "Actividad antioxidante de los glucósidos de feniletanoide sobre la neurotoxicidad inducida por glutamato", Biociencia, biotecnología y bioquímica, vol. 83, núm. 11, págs. 2016–2026, 2019.

[10] Q. Wang, J. Dong, W. Lu et al., "Los glucósidos de feniletanol de Cistanche tubulosa mejoraron la disfunción reproductiva al regular los esteroides testiculares a través de la vía CYP450-3 -HSD", Journal of Ethnopharmacology, vol. 251, Artículo ID112500, 2020.

[11] S.-P. Tú, L. Ma, J. Zhao, S.-L. Zhang y T. Liu, "Los glucósidos de feniletanol de Cistanche tubulosa suprimen la activación de las células estrelladas hepáticas y bloquean la conducción de las vías de señalización en TGF- 1/smad como posibles agentes contra la fibrosis hepática", Molecules, vol. 21, núm. 1, pág. 102, 2016.

[12] S.-P. Tú, J. Zhao, L. Ma, M. Tudimat, S.-L. Zhang y T. Liu, "Efectos preventivos de los glucósidos feniletanoides de Cistanche tubulosa en la fibrosis hepática inducida por albúmina sérica bovina en ratas", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 23, núm. 1, pág. 52, 2015.

[13] T. Morikawa, H. Xie, Y. Pan, et al., "Una revisión de productos naturales biológicamente activos de una planta del desierto Cistanche tubulosa", Boletín químico y farmacéutico, vol. 67, núm. 7, págs. 675–689, 2019.

[14] J. Li, J. Li, A. Aspire, et al., "Los glucósidos feniletanoides de Cistanche tubulosa inhiben el crecimiento de las células B16-F10 tanto in vitro como in vivo mediante la inducción de la apoptosis a través de la mitocondrial- vía dependiente", Journal of Cancer, vol. 7, núm. 13, págs. 1877–1887, 2016.

[15] Y. Hu, J. Huang, Y. Li et al., "Cistanche deserticola polysaccharide induce la melanogénesis en los melanocitos y reduce el estrés oxidativo a través de la activación de la vía NRF2/HO-1", Journal of Cellular and Molecular Medicine, vol. 24, núm. 7, págs. 4023–4035, 2020.

[16] S. Peng, P. Li, P. Liu, et al., "Cistanches alivia la disfunción cognitiva inducida por sevoflurano al regular el antioxidante y antiinflamatorio dependiente de PPAR-c en ratas", Journal of Cellular and Molecular Medicine, vol. 24, núm. 2, págs. 1345–1359, 2020.

[17] Y. Liu, H. Wang, M. Yang, et al., "Los polisacáridos de Cistanche deserticola protegen las células PC12 contra las lesiones inducidas por OGD/RP", Biomedicine & Pharmacotherapy, vol. 99, págs. 671–680, 2018.

[18] Z. Fu, L. Han, P. Zhang, et al., "Los polisacáridos de cistanche mejoran la absorción de echinacósido in vivo y afectan la microbiota intestinal", International Journal of Biological Macromolecules, vol. 149, págs. 732–740, 2020.

[19] NT Williams, "Probióticos", American Journal of Health-System Pharmacy, vol. 67, núm. 6, págs. 449–458, 2010.

[20] R. Ashraf y NP Shah, "Estimulación del sistema inmunológico por microorganismos probióticos", Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 54, núm. 7, págs. 938–956, 2014.

[21] G. La Fata, P. Weber y MH Mohajeri, "Los probióticos y el sistema inmunitario intestinal: regulación indirecta", Probióticos y proteínas antimicrobianas, vol. 10, núm. 1, págs. 11 a 21, 2018.

[22] MA Zocco, LZ dal Verme, F. Cremonini, et al., "Eficacia de lactobacillus GG en el mantenimiento de la remisión de la colitis ulcerosa", Farmacología alimentaria y terapéutica, vol. 23, núm. 11, págs. 1567–1574, 2006.

[23] MJ Saez-Lara, C. Gomez-Llorente, J. Plaza-Diaz, and A. Gil,"*e role of probiotic acid acid bacteria and bifidobacteria in the prevent and treatment of inflamatorio intestinal disease and other related diseases: una revisión sistemática de ensayos clínicos aleatorios en humanos", BioMed Research International, vol. 2015, artículo ID 505878, 15 páginas, 2015.

[24] MAO Dawood, S. Koshio, M. Ishikawa, et al., "Efectos de la suplementación dietética de Lactobacillus rhamnosus o/y lactococcus lactis sobre el crecimiento, la microbiota intestinal y las respuestas inmunitarias de la dorada, Pagrus major", Fish & Shellfifish Immunology, vol. 49, págs. 275 a 285, 2016.

[25] A. Sivan, L. Corrales, N. Hubert, et al., "La bifidobacteria comensal promueve la inmunidad antitumoral y facilita la eficacia anti-PD-L1", Science, vol. 350, núm. 6264, págs. 1084–1089, 2015.

[26] PJ Whorwell, L. Altringer, J. Morel, et al., "La eficacia de un bebé Bifidobacterium probiótico encapsulado es 35624 en mujeres con síndrome del intestino irritable", 8e American Journal of Gastroenterology, vol. 101, núm. 7, págs. 1581–1590, 2006.

[27] Y. Wang, Y. Wu, Y. Wang et al., "Propiedades antioxidantes de las bacterias probióticas", Nutrients, vol. 9, núm. 5, pág. 521, 2017.

[28] JMC Gutteridge, R. Richmond y B. Halliwell, "Inhibición de la formación catalizada por hierro de radicales hidroxilo a partir de superóxido y de peroxidación lipídica por deferoxamina", Biochemical Journal, vol. 184, núm. 2, págs. 469–472, 1979.

[29] E. Deriu, JZ Liu, M. Pezeshki, et al., "Las bacterias probióticas reducen la colonización intestinal de salmonella Typhimurium al competir por el hierro", Cell Host & Microbe, vol. 14, núm. 1, págs. 26 y 37, 2013.

[30] T. Kullisaar, M. Zilmer, M. Mikelsaar, et al., "Dos cepas de lactobacilos antioxidantes como probióticos prometedores", International Journal of Food Microbiology, vol. 72, núm. 3, págs. 215–224, 2002.

[31] JG LeBlanc, S. del Carmen, A. Miyoshi, et al., "Uso de bacterias de ácido láctico productoras de superóxido dismutasa y catalasa en la enfermedad de Crohn inducida por TNBS en ratones", Journal of Biotechnology, vol. 151, núm. 3, págs. 287–293, 2011.

[32] M. Rossi, A. Amaretti y S. Raimondi, "Producción de folato por bacterias probióticas", Nutrients, vol. 3, núm. 1, págs. 118 a 134, 2011.

[33] A. Pompei, L. Cordisco, A. Amaretti, et al., "La administración de bifidobacterias productoras de folato mejora el estado de folato en ratas Wistar", 8e Journal of Nutrition, vol. 137, núm. 12, págs. 2742–2746, 2007.

[34] L.-X. Wang, K. Liu, DW Gao y JK Hao, "Efectos protectores de dos cepas de Lactobacillus Plantarum en ratones hiperlipidémicos", World Journal of Gastroenterology, vol. 19, núm. 20, págs. 3150–3156, 2013.

[35] EO Petrof, K. Kojima, MJ Ropeleski, et al., "Los probióticos inhiben el factor nuclear κB e inducen proteínas de choque térmico en las células epiteliales del colon a través de la inhibición del proteasoma", Gastroenterology, vol. 127, núm. 5, págs. 1474–1487, 2004.

[36] A. Seth, F. Yan, DB Polk y RK Rao, "Los probióticos mejoran la interrupción de la barrera epitelial inducida por peróxido de hidrógeno mediante un mecanismo dependiente de PKC y MAP quinasa", American Journal of Physiology-Gastrointestinal and liver Physiology , vol. 294, núm. 4, págs. G1060–G1069, 2008.

[37] M. G´omezGuzm´an, M. Toral, M. Romero, et al., "Efectos antihipertensivos de cepas de probióticos Lactobacillus en ratas espontáneamente hipertensas", Molecular Nutrition & FoodResearch, vol. 59, núm. 11, págs. 2326 y 2336, 2015.

[38] H. Zeng, L. Huang, L. Zhou, P. Wang, X. Chen y K. Ding, "Un galactoglucano aislado de Cistanchedeserticola YC Ma. y su bioactividad en cepas de bacterias intestinales", Carbohydrate Polymers, vol. 223, artículo ID 115038, 2019.

[39] S. Zheng, X. Jiang, L. Wu, Z. Wang y L. Huang, "Discriminación química y genética de cistanche herba basada en UPC-QTOF/MS y código de barras de ADN", PLoS One, vol. 9, núm. 5, artículo ID e98061, 2014.

[40] M. Li, T. Xu, F. Zhou, et al., "Efectos neuroprotectores de cuatro glucósidos de feniletanoide en la apoptosis inducida por H2O2-en células PC12 a través de la vía Nrf2/ARE", International Journal of Molecular Sciences , vol. 19, núm. 4, pág. 1135, 2018.

[41] A. Wu, Z. Yang, Y. Huang, et al., "Los glucósidos feniletanoides naturales aislados de Callicarpa kwangtungensis suprimieron la respuesta inflamatoria mediada por lipopolisacáridos mediante la activación de la vía Keap1/Nrf2/HO-1 en RAW 264.7 células de macrófagos", Journal of Ethnopharmacology, vol. 258, artículo ID 112857, 2020.

[42] GM Douglas, VJ Maffffei, JR Zaneveld, et al., "PICRUSt2 para la predicción de las funciones del metagenoma", Nature Biotechnology, vol. 38, núm. 6, págs. 685–688, 2020.

[43] H.-L. Li, L. Lu, X.-S. Wang et al., "Alteración de la microbiota intestinal y los perfiles inflamatorios de citocinas/quimiocinas en la mucositis intestinal inducida por 5-fluorouracilo", Frontiers in Cellular andfection Microbiology, vol. 7, pág. 455, 2017.

[44] M. Pammi, J. Cope, PI Tarr, et al., "Disbiosis intestinal en bebés prematuros que preceden a la enterocolitis necrotizante: una revisión sistemática y metanálisis", Microbiome, vol. 5, núm. 1, pág. 31, 2017.

[45] N.-R. Shin, TW When y J.-W. Bae, "Proteobacteria: firma microbiana de la disbiosis en la microbiota intestinal", Trends in Biotechnology, vol. 33, núm. 9, págs. 496–503, 2015.

[46] M. de Oliveira Bel´em, CP Cirilo, AP de Santi-Rampazzoet al., "Los ajustes de la morfología intestinal causados ​​por la restricción dietética mejoran el estado nutricional durante el proceso de envejecimiento de las ratas", Experimental Gerontology, vol. 69, págs. 85 a 93, 2015.

[47] B. Potsic, N. Holliday, P. Lewis, D. Samuelson, V. DeMarco y J. Neu, "Suplementos y privación de glutamina: efecto sobre la morfología del intestino delgado de ratas criadas artificialmente", Pediatric Research, vol. 52, núm. 3, págs. 430–436, 2002.

[48] ​​JL Daniels, RJ Bloomer, M. van der Merwe, SL Davis, KK Buddington y RK Buddington, "Adaptaciones intestinales a una combinación de diferentes dietas con y sin ejercicio de resistencia", Revista de la Sociedad Internacional de Nutrición Deportiva, vol. 13, núm. 1, pág. 35, 2016.

[49] L. Muñoz, MJ Borrero, M. ´Ubeda et al., "La desregulación inmunitaria intestinal provocada por la disbiosis promueve la alteración de la barrera y la translocación bacteriana en ratas con cirrosis", Hepatology. vol. 70, núm. 3, págs. 925–938, 2019.

[50] X. Li, Y. Wu, Z. Xu et al., "Efectos de la decocción de hetiao Jianping sobre las lesiones intestinales y la reparación en ratas con diarrea asociada a antibióticos", Medical Science Monitor, vol. 26, artículo IDe921745, 2020.

[51] Y. Xie, F. Ding, W. Di et al., "Impacto de una dieta rica en grasas sobre las células madre intestinales y la función de barrera epitelial en ratones hembra de mediana edad", Molecular Medicine Reports, vol. 21, núm. 3, págs. 1133–1144, 2020.

[52] BL Bivolarski y EG Vachkova, "Eventos morfológicos y funcionales asociados al destete en conejos", Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, vol. 98, núm. 1, págs. 9 a 18, 2014.

[53] H. Shimoda, J. Tanaka, Y. Takahara, K. Takemoto, S.-J. Shan y M.-H. Su, "*e efectos hipocolesterolémicos del extracto de Cistanchetubulosa, una medicina cruda tradicional china, en ratones", 8e American Journal of Chinese Medicine, vol. 37, núm. 6, págs. 1125–1138, 2009.

[54] RE Ley, PJ Turnbaugh, S. Klein y JI Gordon, "Microbios intestinales humanos asociados con la obesidad", Nature, vol. 444, núm. 7122, págs. 1022-1023, 2006.

[55] J.-Y. Kim, YM Kwon, I.-S. Kim et al., "Efectos de la suplementación con algas pardas laminaria japonica sobre las concentraciones séricas de IgG, triglicéridos y colesterol, y la composición de la microbiota intestinal en ratas", Frontiers in Nutrition, vol. 5, pág. 23, 2018.

[56] W. Zhang, J. Huang, W. Wang, et al., "Extracción, purificación, caracterización y actividades antioxidantes de polisacáridos de Cistanche tubulosa", International Journal of BiologicalMacromolecules, vol. 93, págs. 448 y 458, 2016.

[57] M. Sibai, E. Altuntas¸, B. Yıldırım, G. ¨Ozt¨urk, S. Yıldırım y T. Demircan, "Microbioma y longevidad: una gran abundancia de Muribaculaceae vinculadas a la longevidad en el intestino del roedor de larga vida Spalax leucodon", OMICS: A Journal of IntegrativeBiology, vol. 24, núm. 10, págs. 592–601, 2020.

[58] Y. Xie, Z. Chen, D. Wang, et al., "Efectos de los residuos de té de hierbas fermentados en las características de la microbiota intestinal de vaquillas Holstein bajo estrés por calor", Frontiers in Microbiology, vol. 11, pág. 1014, 2020.

[59] Y. Li, M. Liu, H. Liu, et al., "Los suplementos orales de Bacillus licheniformis zhengchangsheng y xilooligosacáridos combinados mejoran la obesidad inducida por una dieta rica en grasas y modulan la microbiota intestinal en ratas", BioMed Research International, vol. . 2020, ID de artículo 9067821, 17 páginas, 2020.

[60] Y. Jiang y P.-F. Tu, "Análisis de componentes químicos en especies de cistanche", Journal of Chromatography A, vol. 1216, n. 11, págs. 1970–1979, 2009.

[61] F. Li, Y. Yang, P. Zhu, et al., "Echinacoside promueve la regeneración ósea al aumentar la relación OPG/RANKL en MC3T3-E1cells", Fitoterapia, vol. 83, núm. 8, págs. 1443–1450, 2012.

[62] F. Tang, Y. Hao, X. Zhang y J. Qin, "Efecto del equinacósido en la fibrosis renal mediante la inhibición de la vía de señalización de TGF- 1/Smads en el modelo de nefropatía diabética en ratones DB/DB , Diseño, desarrollo y terapia de medicamentos, vol. 11, págs. 2813–2826, 2017.

[63] W.-T. Xiong, L. Gu, C. Wang, H.-X. Sun y X. Liu, "Efectos antihiperglucémicos e hipolipidémicos de Cistanche tubulosa en ratones DB/DB diabéticos tipo 2", Journal of Ethnopharmacology, vol. 150, núm. 3, págs. 935–945, 2013.

[64] X.-x. Bao, H.-h. Ma, H. Ding, W.-w. Li y M. Zhu, "Optimización preliminar de una fórmula de medicina herbal china basada en los efectos neuroprotectores en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson inducida por rotenona", Journal of IntegrativeMedicine, vol. 16, núm. 4, págs. 290–296, 2018.

[65] Y. Chen, Y.-Q. Li, J.-Y. Fang, P. Li y F. Li, "Establecimiento del modelo experimental concurrente de osteoporosis combinada con la enfermedad de Alzheimer en ratas y los efectos duales del equinacósido y el acteósido de Cistanche tubulosa", Journal of Ethnopharmacology, vol. 257, artículo ID 112834, 2020.

[66] M. Hensel, AP Hinsley, T. Nikolaus, G. Sawers y B. C. Berks, "*e base genética de la respiración de tetrationato en Salmonella Typhimurium", Microbiología Molecular, vol. 32, núm. 2, págs. 275–287, 1999.

[67] SE Winter, P. Thiennimitr, MG Winter, et al., "La inflamación intestinal proporciona un aceptor de electrones respiratorio para la salmonella", Nature, vol. 467, núm. 7314, págs. 426–429, 2010.

[68] SE Winter, MG Winter, MN Xavier, et al., "el nitrato derivado del huésped aumenta el crecimiento de E. coli en el intestino inflamado", Science, vol. 339, núm. 6120, págs. 708–711, 2013.

[69] C. Lupp, ML Robertson, ME Wickham, et al., "La inflamación mediada por el huésped interrumpe la microbiota intestinal y promueve el crecimiento excesivo de Enterobacteriaceae", Cell Host &Microbe, vol. 2, núm. 2, págs. 119 y 129, 2007.

[70] B. Stecher, R. Robbiani, AW Walker, et al., "Salmonellaenterica serovar Typhimurium aprovecha la inflamación para competir con la microbiota intestinal", PLoS Biology, vol. 5, núm. 10, págs. e244–2189, 2007.

[71] V. Mishra, C. Shah, N. Mokashe, R. Chavan, H. Yadav y J. Prajapati, "Los probióticos como antioxidantes potenciales: una revisión sistemática", Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 63, núm. 14, págs. 3615–3626, 2015.

[72] JMP Martín, PF Freire, L. Daimiel, et al., "El antioxidante hidroxianisol butilado potencia los efectos tóxicos del propilparabeno en células de mamíferos cultivadas", Toxicología alimentaria y química, vol. 72, págs. 195–203, 2014.

[73] RS Lanigan y TA Yamarik, "Informe final sobre la evaluación de seguridad de BHT", International Journal of Toxicology, vol. 21, núm. 2, págs. 19 a 94, 2002.