Los liposomas cargados de epigalocatequina-3-galato favorecen la antiinflamación de las células de la microglía y promueven la neuroprotección

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Resumen

Se reconoce que la neuroinflamación mediada por microglia contribuye principalmente a la progresión de las enfermedades neurodegenerativas. El galato de epigalocatequina-3-(EGCG), conocido como un antioxidante natural en el té verde, puede inhibir la inflamación mediada por la microglía y proteger las neuronas, pero tiene desventajas como una alta inestabilidad y una baja biodisponibilidad. Desarrollamos una formulación liposomal de EGCG para mejorar su biodisponibilidad y evaluamos la actividad neuroprotectora en modelos de neuroinflamación in vitro e in vivo. Se han preparado liposomas cargados con EGCG a partir de fosfatidilcolina (PC) o fosfatidilserina (PS) recubiertos con o sin vitamina E (VE) mediante el método de hidratación y extrusión de membrana. losantiinflamatorioSe ha evaluado el efecto contra la activación de células microgliales BV-2 inducida por lipopolisacárido (LPS) y la inflamación en la sustancia negra de ratas Sprague Dawley. En el modelo de inflamación celular, las células microgliales murinas BV-2 cambiaron su morfología de esferoide normal a forma de huso activado después de 24 h de inducción de LPS. En el ensayo in vitro de radicales libres 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), el EGCG eliminó el 80 por ciento de DPPH en 3 min. Los liposomas cargados con EGCG podrían ser fagocitados por células BV-2 después de 1 h de cultivo celular a partir de experimentos de captación celular. Los liposomas cargados con EGCG mejoraron la producción de óxido nítrico derivado de microglía BV-2 y LPS seguido de TNF. En el modelo de rata con síndrome de Parkinson in vivo, la inyección intranigral simultánea de liposomas cargados con EGCG atenuó las citoquinas proinflamatorias inducidas por LPS y restableció el deterioro motor. Demostramos que los liposomas cargados con EGCG ejercen un efecto neuroprotector al modular la activación de la microglía. EGCG extraído del té verde y liposomas cargados podría ser un candidato valioso para una terapia modificadora de la enfermedad paraEnfermedad de Parkinson (EP).

Palabras clave:neuroproteccion; neuroinflamación; enfermedad de Parkinson; catequina; L- -fosfatidilcolina;fosfatidilserina

prevenirParkinsonenfermedadefectos de Cistanche concistanche

Chun-Yuan Cheng 1,2, Lassina Barro 2, Shang-Ting Tsai 2,3, Tai-Wei Feng 2,3, Xiao-Yu Wu 2, Che-Wei Chao 4, Ruei-Siang Yu 2, Ting-Yu Chin 4,* y Ming Fa Hsieh 2,3,*

1 División de Neurocirugía, Departamento de Cirugía, Changhua Christian Hospital, 135 Nanxiao St., Changhua City, Changhua County 500, Taiwán; 83998@cch.org.tw

2 Departamento de Ingeniería Biomédica, Chung Yuan Christian University, No. 200, Zhongbei Rd., Zhongli Dist., Taoyuan City 320314, Taiwán;

3 Centro de Tecnologías y Dispositivos Médicos Mínimamente Invasivos, Chung Yuan Christian University, No. 200, Zhongbei Rd., Zhongli Dist., Taoyuan City 320314, Taiwán

4 Departamento de Tecnología de Biociencias, Chung Yuan Christian University, No. 200, Zhongbei Rd., Zhongli Dist., Taoyuan City 320314, Taiwán.

1. Introducción

Cuando el sistema nervioso se daña o se infecta, las células de la microglía se activan y transforman para ramificarse, lo que da como resultado una expresión excesiva de una gran cantidad de citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-), la interleucina-1 ( IL-1 ), interleucina 6 (IL-6) y mediadores inflamatorios como el óxido nítrico (NO) y especies reactivas de oxígeno (ROS). Finalmente, las células nerviosas se dañan, degeneran o mueren a causa de estos mediadores inflamatorios. Recientemente se descubrió que en el cerebro de pacientes con enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson0 (EP), la enfermedad de Alzheimer0, la enfermedad de Huntington0 y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob , se activan y sobreexpresan grandes cantidades de células microgliales [1–3]. Epidemiológicamente, la causa de la EP está relacionada principalmente con la reacción neuroinflamatoria. Los mediadores inflamatorios resultantes, como TNF-, IL-1, IL-6, NO y ROS, se encuentran en el cuerpo estriado del cerebro [1,4–7]. La degradación de las neuronas dopaminérgicas puede ser regulada por las células de la microglía [8].

El proceso de neuroinflamación que causa la EP está precedido por el daño primario de las neuronas causado por toxinas ambientales, incluida la rotenona [9], el lipopolisacárido (LPS) [5,7] y los efectos de la acumulación anormal de proteínas [10]. El daño provocará lesiones e incluso apoptosis de las neuronas dopaminérgicas. Luego, las células de microglía se activan para liberar citocinas, lo que provoca inflamación y muerte de las neuronas y, finalmente, conduce a la enfermedad de Parkinson.

Cuando las células microgliales son estimuladas por LPS, LPS se une al sitio de unión del receptor CD14 de la superficie de las células microgliales. El complejo LPS-CD14 está vinculado con el conector MD2 a través de proteínas transmembrana del receptor tipo toll-4 (TLR4) y luego está involucrado en múltiples vías de transmisión de mensajes generadas por proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y factores de transcripción activadores (factor nuclear -kappa B, NF-κB). Después de la transcripción génica [5,11,12], las células microgliales liberan citoquinas como TNF- e IL-1 , o expresan genes de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa-2 (COX{ {17}}), lo que resulta en la liberación de prostaglandinas o NO. Además, los radicales libres ONOO destructivos se generan mediante la combinación de aniones superóxido producidos a partir de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa con el NO producido a partir de iNOS, lo que lleva a la muerte de las neuronas dopaminérgicas [13]. Por lo tanto, en este estudio, se utilizó LPS para inducir la neuroinflamación de las células de la microglía como modelo in vitro de la enfermedad de Parkinson.

Las catequinas son antioxidantes naturales que pueden prevenir el daño celular y proporcionar muchos beneficios farmacológicos, como antitumorales, anticancerígenos, antienvejecimiento, radiación antifarmacológica y eliminación de radicales libres [14]. El té verde contiene aproximadamente un 10 por ciento de polifenoles en peso, incluidas grandes cantidades de una catequina llamada galato de epigalocatequina (EGCG). EGCG tiene la actividad antioxidante más alta y la capacidad de eliminación de radicales libres en todas las catequinas del té verde y puede capturar ROS para proteger las células del daño del estrés oxidativo [15]. EGCG también tiene una alta eficacia antiinflamatoria, que puede inhibir eficazmente la secreción de citocinas (TNF-, IL-2 e IL-8) por los macrófagos [16], la fosforilación de las proteínas de señalización Akt y las proteínas IκB en vías inflamatorias para reducir la expresión de NF-κB o la transcripción de AP-1 mediante la inhibición de la fosforilación de las proteínas MAPK aguas arriba para equilibrar la expresión de COX-2 y reducir la producción de citocinas proinflamatorias [17].

Recientemente, se informó que EGCG es potencialmente terapéutico o profiláctico para la EP debido a la supresión de oligómeros activos de -sinucleína (S) [18]. EGCG también previene la agregación de S in vitro [19-21], y la agregación de S citoplásmica en las neuronas dopaminérgicas es una posible patogénesis de la EP que conduce al daño de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra [22]. Además, EGCG puede recuperar el daño funcional o neuroquímico inducido por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) y regular la ferroportina en la sustancia negra y reducir estrés oxidativo [23]. EGCG también tiene efectos neuroprotectores e inmunoprotectores en ratones tratados con MPTP y puede modular la neuroinflamación y proteger la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la EP inducida por MPTP [24].

Se investigaron los efectos antiinflamatorios de EGCG. EGCG suprimió la producción de NO inducida por LPS y la expresión de iNOS en células microgliales BV-2. EGCG puede inhibir eficazmente las expresiones de citoquinas proinflamatorias como TNF- e IL-1 en células BV-2 [25]. El pretratamiento con EGCG de macrófagos humanos inhibió significativamente la expresión inducida por LPS de citocinas proinflamatorias como TNF-, IL-1 e IL-6 [26]. Además, el tratamiento posterior con EGCG en ratones lesionados con LPS disminuyó la producción de una citocina proinflamatoria mediante la modulación de la vía TLR4-NF-κB [27]. Además, las microesferas de poli(lactida-co-glicolida) (PLGA) cargadas con EGCG y optimizadas mediante la adición de -ciclodextrina (-CD) podrían suprimir eficazmente la producción de NO de las células BV-2 en el modelo in vitro de BV murina -2 células microgliales estimuladas por LPS, lo que indica que las microesferas pueden suprimir la inflamación de las células microgliales activadas [28].

Aunque el té verde es una bebida diaria, la eficacia de las catequinas es ineficaz debido a la baja biodisponibilidad oral; por tanto, se requieren formas de dosificación farmacéutica eficaces. El transportador de nanofármacos tiene los beneficios de evitar el metabolismo prematuro, prolongar el tiempo de acción del fármaco y orientar la administración del fármaco. Por lo tanto, este estudio pretende desarrollar liposomas que contengan fosfatidilcolina (PC) y fosfatidilserina (PS), componentes similares a la membrana celular, como formas de dosificación antiinflamatoria. El EGCG extraído de las hojas de té verde se cargó en liposomas para ralentizar las reacciones inflamatorias en las células de microglía inducidas por LPS. También se evaluó el efecto terapéutico de los liposomas cargados con EGCG en el modelo in vivo de EP para la neuroprotección.

2. Resultados

2.1. Extracción de EGCG

2.1.1. Extracto de EGCG

Los datos de caracterización de epigalocatequina{{0}}galato se pueden encontrar en el Archivo complementario (Figuras S1 y S2). 2.1.2. Diversas formulaciones de EGCG En la Tabla 1, los diámetros de partícula promedio de los liposomas PS-, PS-EGCE- y PS-EGCG-VE de placebo fueron más pequeños que los de los liposomas PC-, PC-EGCE- y PC-EGCG-VE- de placebo. liposomas, respectivamente. Debido a que PC es neutral y PS tiene carga negativa [29], esto indica que el potencial de superficie aditivo afectó el tamaño de partícula. El índice de polidispersión (PDI) de todos los liposomas fue inferior a 0,22, lo que indica que la estructura de los liposomas en solución es estable. Las cargas negativas de PS condujeron a una fuerza repulsiva en el potencial superficial entre los PS-liposomas, evitando la agregación y reduciendo el tamaño de los PS-liposomas.

La eficiencia/tamaño de encapsulación de los liposomas que contienen PS descritos en la Tabla 1 fue mayor/menor que la de los liposomas que contienen PC correspondientes [30]. La eficacia de encapsulación de los liposomas PC-EGCG-VE y los liposomas PS-EGCG-VE fue mayor que la de los liposomas PC-EGCG y los liposomas PS-EGCG, respectivamente. Esto se debe a que la vitamina E es soluble en grasa, está incrustada en una membrana de bicapa de fosfolípidos y proporciona un protector antioxidante para EGCG.

2.2. Análisis celular in vitro

2.2.1. Viabilidad celular

La viabilidad celular de las células tratadas con EGCG de 50 a 400 µM disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control (Figura 1A). Por el contrario, la viabilidad de las células que reciben de 5 a 25 µM es similar a la viabilidad de las células del grupo de control. Se determinó que la concentración de EGCG utilizada en este estudio era de 25 µM. De manera similar, se determinó que la concentración de LPS utilizada para la inducción de la inflamación celular era de 50 ng/mL según la Figura 1B. En la Figura 1C, la viabilidad celular de las células cocultivadas con liposomas de placebo de todas las concentraciones no fue estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control. Por lo tanto, los liposomas de placebo no son citotóxicos para las células de la microglía.

2.2.2. Morfología celular

La morfología celular del grupo de control (Figura 2A) y la morfología de las células tratadas con EGCG 25 μM (Figura 2B) eran esféricas, mientras que la morfología de las células tratadas con 50 ng/ml de LPS (Figura 2C) tenía forma de huso. Sin embargo, la morfología de las células tratadas con EGCG 25 uM y activadas por LPS (Figura 2D) fue esférica. Esto denota que EGCG puede inhibir la activación inducida por LPS. Por lo tanto, el pretratamiento de EGCG tiene un efecto inhibitorio sobre la neuroinflamación, protegiendo a las células microgliales de la activación.

2.2.3. SIN lanzamiento

En la Figura 3A, la liberación de NO de las células BV-2 inducidas con 5 a 1000 ng/mL de LPS durante 24 h de incubación fue estadísticamente significativa en comparación con la liberación de NO del grupo de control. Se determinó que la concentración de LPS utilizada para la activación de la inflamación celular para que funcione es de 50 ng/ml.

La liberación de NO de las células BV-2 tratadas con EGCG 25 µM no fue estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control, como se muestra en la Figura 3B. Sin embargo, la inflamación celular inducida con LPS durante 24 h mostró un aumento significativo en comparación con el grupo control. Las células tratadas con EGCG 25–200 µM durante 1 h y luego activadas con LPS mostraron una disminución estadísticamente significativa en comparación con el grupo de células activadas solo con LPS. La liberación de NO no disminuyó cuando el EGCG aumentó de 50 a 200 µM, ya que la viabilidad celular disminuyó cuando el EGCG aumentó de 50 a 200 µM, según la Figura 1A.

La producción de NO de las células tratadas con EGCG 25 µM seguida de la inflamación inducida con LPS 50 ng/mL no fue estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control (Figura 3C). Sin embargo, el NO liberado en el grupo de células tratadas con PC-EGCG-liposomas o PC-EGCG-VE-liposomas seguido de activación de LPS con 50 ng/mL mostró una disminución significativa en comparación con el grupo de células tratadas solo con LPS. La liberación de NO de las células pretratadas con PC-EGCG-liposomas o PC-EGCG-VE-liposomas fue mayor que la liberación de NO del grupo de células pretratadas con EGCG, lo que debería explicarse por la liberación lenta de EGCG de los liposomas.

2.2.4. Análisis de citoquinas

En la Figura 4A, la concentración de TNF- de las células tratadas con LPS después de 24 h mostró un aumento estadísticamente significativo en comparación con el grupo control o el medio de cultivo celular (DMEM). Los liposomas PC de placebo eran similares a los de las células tratadas con LPS. Sin embargo, la concentración de TNF- en el grupo de células pretratadas con PS-EGCG-liposomas o PS-EGCG-VE-liposomas seguido de activación con LPS mostró una disminución estadísticamente significativa en comparación con las células tratadas con LPS. Esta concentración decreciente de TNF- indica que los liposomas cargados con EGCG pueden reducir la activación de las células microgliales inducida por LPS. El efecto inhibidor de los liposomas PS-EGCG-VE fue mejor que el de los liposomas PS-EGCG.

Los fosfolípidos de la membrana celular pueden ser hidrolizados por la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2) para producir ácido araquidónico. La ciclooxigenasa (COX) es una enzima clave que convierte el ácido araquidónico en prostaglandina. COX-2 y cPLA2 a menudo se generan a partir de una inflamación o una enfermedad maligna [31–34]. En la Figura 4B, la inflamación fue inducida por LPS de 5 a 50 ng/mL durante 24 h, y la expresión de cPLA2 aumentó cuando aumentó la concentración de LPS. La Figura 4C mostró el aumento de las actividades de COX-2, inducidas por LPS (5–50 ng/mL) durante 24 h. La expresión de COX-2 aumentó de 5 a 25 ng/ml de LPS, mientras que disminuyó a 50 ng/ml. En la Figura 4D, la expresión de cPLA2 se redujo cuando las células BV-2 se trataron previamente con EGCG y se indujeron con LPS. La expresión de COX-2 cuando LPS activó las células BV-2 aumentó en comparación con el grupo de control (Figura 4E). Hubo una disminución significativa de COX-2 en el grupo de células pretratadas con EGCG, placebo PS-liposomas, PS-EGCG-liposomas y PS-EGCG-VE-liposomas, seguido de inducción inflamatoria con LPS. Especialmente, la expresión de COX-2 de células pretratadas con liposomas de PS de placebo tuvo una diferencia estadísticamente significativa con respecto a la de las células inducidas por LPS.

2.3. Prueba en animales in vivo

2.3.1. comportamiento animal

Prueba El número de círculos completados por las ratas parkinsonianas después de la administración de anfetamina (que se muestra en la Figura 5A) aumentó significativamente en comparación con el número de círculos completados por las ratas del grupo de control. El comportamiento de las ratas parkinsonianas0' tratadas con las diversas formulaciones de EGCG fue similar al de las ratas del grupo de control. Estos datos indicaron que EGCG atenuaba las lesiones unilaterales inducidas por LPS del sistema nigroestriatal. 2.3.2. Análisis de marcadores inflamatorios La proporción de TNF-/GAPDH en el grupo tratado fue significativamente menor en comparación con la proporción encontrada en ratas sindrómicas. La tendencia IL-1 fue similar a la tendencia TNF-. Los resultados in vivo son consistentes con los resultados de los estudios in vitro. La expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en el grupo tratado fue similar al grupo inducido por LPS (Figura 5D). Sin embargo, este resultado podría indicar que la mejora de la coordinación de las extremidades en ratas con síndrome de Parkinson mediante liposomas cargados con PC-EGCG se debe a la reducción de la respuesta de neuroinflamación, pero no al aumento de la expresión de BDNF.

También se ajusta a informes anteriores de que la reducción de la producción de TNF y NO mediante el pretratamiento de ratas con EGCG (10 mg/kg) durante 24 h y la inducción con LPS después de 7 días disminuyó en comparación con las ratas tratadas con LPS, y concluyó que EGCG tiene un efecto terapéutico potencial para la neurotoxicidad inducida por LPS debido a la reducción de la liberación de TNF y NO.

3. Discusión

En este estudio, se detectó que la pureza del EGCG extraído del té verde era del 90,5 por ciento, y la actividad de eliminación de radicales libres del EGCG fue más extensa que el 80 por ciento en 3 minutos. Estaba aumentando con una mayor concentración de EGCG o un tiempo de reacción más prolongado. El tamaño de partícula de los liposomas PC-EGCG-VE y PS-EGCG-VE era de 161,5 y 142,9 nm, que eran más pequeños que los del EGCG cargado en microesferas de PLGA [28] con -ciclodextrina adicional (entre 1 y 14 µm) . La eficacia de encapsulación de los liposomas PC-EGCG-VE y PS-EGCG-VE fue del 60,2 % y del 76,8 %, respectivamente. Estos resultados mostraron que los liposomas que contenían PS eran más pequeños, más estables y tenían una mayor eficiencia de encapsulación debido a la carga en PS y dieron como resultado una fuerza repulsiva entre los liposomas para evitar la agregación.

La expresión de TNF- en células pretratadas con PS-EGCG- y PS-EGCG-VE-liposomas y luego inducida por LPS tuvo diferencias estadísticamente significativas en comparación con la de las células inducidas con LPS, y se observaron resultados similares en el pretratamiento de EGCG en LPS expresión de TNF-inducida en células BV-2 [25] y macrófagos humanos [26]. En resumen, la morfología celular y expresión de TNF- del grupo tratado con EGCG mostró un efecto de inhibición de la inflamación inducida por LPS.

En el presente estudio, el pretratamiento con EGCG puede reducir la liberación de NO. La supresión de la producción de NO de las células BV-2 inducidas por LPS mediante el pretratamiento de microesferas de PLGA cargadas con EGCG también se investigó en nuestro estudio anterior [28].

En el presente estudio, el síndrome de Parkinson en ratas se crea por el daño a la región de la sustancia negra unilateral inducida por LPS. Otro hallazgo importante es que, a través del análisis cuantitativo estadístico, los liposomas cargados con EGCG pueden aliviar el síndrome debido al daño en la región unilateral de nigrosina del cerebro medio del cerebro de rata inducido por LPS en la prueba rotacional y la producción de factores neuroinflamatorios TNF- en la sustancia. nigra del cerebro de rata también puede reducirse mediante liposomas cargados con EGCG. Este estudio indica que la mejora de la coordinación de las extremidades y la reducción de la inflamación neuronal en el síndrome parkinsoniano inducido por LPS se debe a la administración local de liposomas cargados con EGCG, pero no al aumento de la expresión de BDNF. Sin embargo, los resultados anti-neuroinflamación son necesarios para un efecto neuroprotector [35]. La activación de BV-2 libera factores proinflamatorios, que son neurotóxicos y conducen al daño celular. Al prevenir la activación de BV-2, EGCG proporciona un efecto neuroprotector. Algunos tratamientos posteriores con EGCG para mejorar la proliferación, la tasa de supervivencia y la diferenciación neuronal de células madre neurales adultas en la circunvolución dentada inducidas por LPS indican que EGCG puede ser un agente terapéutico potencial para enfermedades neuroinflamatorias [27].

Estudios farmacocinéticos previos mostraron que el PS exógeno puede cruzar la barrera hematoencefálica (BBB), en la que parece tener afinidad por el hipotálamo [6], y la administración oral produce niveles máximos en 1 a 4 horas. Además, se descubrió que los liposomas que contienen PS imitan las células apoptóticas para promover la secreción de mediadores antiinflamatorios, como el factor de crecimiento transformante- 1 (TGF- 1) (para regular a la baja el NO producido por los macrófagos) [36] y prostaglandina E2 (PGE2) por macrófagos y células de microglía in vitro [6,37], y también promueven el alivio de la inflamación in vivo [38]. En consecuencia, los liposomas cargados con EGCG que contienen PS demostrados en este estudio tienen la ventaja de un tamaño de partícula más pequeño, una mayor eficiencia de encapsulación y la inhibición de la activación del síndrome de Parkinson tanto en células de microglía como en el modelo de rata Vivo, mostrando una función antiinflamatoria mejorada y neuroprotección.

La limitación es que nuestro estudio se realizó con algunos análisis faltantes, como en el caso del efecto neuroprotector, y no se investigó la tinción de NeuN. También analizamos solo BDNF como factor neurotrófico. FGF2 e IGF2 también son factores neurotróficos que deben tenerse en cuenta [39].

5. Conclusiones

Para mejorar la baja biodisponibilidad oral de las catequinas, en este estudio se cargó EGCG en liposomas. Se encuentra que los liposomas que contienen PS eran más pequeños y más estables. Tiene una mayor eficiencia de encapsulación y la adición de vitamina E puede proteger al EGCG de la oxidación y mejorar la eficiencia de la encapsulación. En el estudio in vitro, las expresiones de producción de TNF y NO de las células BV-2 se redujeron después del pretratamiento de liposomas cargados con EGCG en células BV-2 inducidas por LPS. Por lo tanto, los liposomas cargados con EGCG han jugado un papel esencial en la respuesta neuroinflamatoria como inhibidores. Los efectos beneficiosos han sido prevenir la apoptosis de las células en las reacciones neuroinflamatorias.

En un estudio in vivo, se mejoró el síndrome parkinsoniano en ratas inducido por LPS en la región unilateral de la sustancia negra del cerebro medio. El mecanismo de neuroinflamación, incluida la secreción de TNF, ha sido inhibido por el tratamiento posterior de liposomas cargados con EGCG. Demostramos que EGCG sería un candidato más valioso para tratar enfermedades neurodegenerativas al aliviar la inflamación en el cerebro. La investigación posterior debe centrarse en las vías inflamatorias mediante el uso de un rastreador de lisosomas para rastrear la entrada del liposoma en la célula y la liberación de EGCG del liposoma.

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