Evaluación y comparación de cuatro ensayos serológicos cuantitativos de SARS-CoV-2 en pacientes con COVID-19 e individuos sanos inmunizados, pacientes con cáncer y pacientes con terapia inmunosupresora

ABSTRACTO

Fondo: Los inmunoensayos semicuantitativos y cuantitativos son la metodología más utilizada para evaluar la inmunidad post-inmunización.

Objetivos: Comparar cuatro ensayos serológicos cuantitativos de SARS-CoV-2 en pacientes con COVID-19 e individuos sanos inmunizados, pacientes con cáncer y pacientes con terapia inmunosupresora.

Diseño del estudio: Se utilizaron 210 muestras serológicas de cohortes de infección y vacunación por COVID-19 para crear un depósito de muestras serológicas. Se evaluaron métodos serológicos de cuatro fabricantes, a saber, Euroimmun, Roche, Abbott y DiaSorin, para mediciones de anticuerpos cuantitativas, semicuantitativas y cualitativas. Los cuatro métodos miden los anticuerpos IgG contra el dominio de unión al receptor de pico del SARS-CoV-2 e informan los resultados en unidades de unión de anticuerpos/mL (BAU/mL). Se eligió un error total permitido (TEa) de ±25 % como criterio para determinar si los dos métodos son clínicamente equivalentes cuantitativamente. Los resultados semicuantitativos (títulos) se obtuvieron utilizando la concentración numérica de anticuerpos dividida por el valor de corte para cada método. Resultados: Todas las comparaciones cuantitativas pareadas demostraron un desempeño inaceptable. Con ±25% como TEa, el mejor acuerdo fue 74 (35,2% de 210 muestras) entre Euroimmun y DiaSorin, mientras que el acuerdo más bajo fue 11 (5,2% de 210 muestras) entre Euroimmun y Roche. Los títulos de anticuerpos entre los cuatro métodos fueron significativamente diferentes (p <0,001). La diferencia de título más alta de la misma muestra se da entre Roche y DiaSorin con una diferencia de 1392-veces. En la comparación cualitativa, ninguna de las comparaciones pareadas mostró una comparación aceptable (p <0,001).

Conclusiones: Existe una correlación deficiente entre cuatro ensayos evaluados, cuantitativa, semicuantitativa y cualitativamente. Se requiere una mayor armonización de los ensayos para lograr mediciones comparables.

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1. Antecedentes

Han pasado más de dos años desde la pandemia mundial de infección por SARS-CoV-2 y se han administrado más de doce mil millones de dosis de vacunas, con más de 600 millones de personas infectadas con COVID-19 en todo el mundo [1]. . Health Canada (HC) y la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA) han aprobado múltiples vacunas para Autorización de uso de emergencia (EUA), como Moderna SpikeVax (mRNA-1273) y Pfizer-BioNTech Comirnaty (BNT162b2) [2, 3]. Los coronavirus tienen cuatro proteínas estructurales: la proteína de pico (S), la nucleocápside (N), la proteína de la envoltura (E) y la proteína de membrana (M) [4]. La proteína S, que sobresale de la envoltura del virus, es inmunodominante y consta de dos subunidades: la proteína S1, que contiene el dominio de unión al receptor (RBD), y la proteína S2, que media en la fusión de la membrana celular [5]. Se encuentran disponibles múltiples plataformas de pruebas serológicas contra diferentes antígenos del SARS-CoV-2, como la proteína de pico (S) y la proteína de la nucleocápside (N).

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Los inmunoensayos, por ejemplo, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), son la metodología más utilizada para evaluar la inmunidad después de la inmunización [6]. Para la mayoría de las demás vacunas, a menudo se elige un valor de corte universal basado en un inmunoensayo semicuantitativo o cuantitativo para representar la protección y la inmunidad [6]. Como lo demostró la vacuna contra la rubéola, el valor de corte debe monitorearse y ajustarse continuamente con la ayuda de grandes estudios epidemiológicos [7] y puede diferir entre países [8]. Por lo tanto, es fundamental que los resultados de varias plataformas analíticas sean comparables y puedan definir adecuadamente la inmunidad posterior tanto a la inmunización como a la infección. El Comité Nacional de Científicos de Laboratorio Clínico (NCCLS) publica periódicamente pautas para que los laboratorios clínicos informen adecuadamente los resultados de las pruebas con respecto a la inmunidad después de lograr un alto nivel de concordancia entre varias plataformas analíticas [7,9]. En personas sanas, se sabe que las respuestas humorales podrían aumentar significativamente con dosis de refuerzo adicionales de la vacuna contra el SARS-CoV-2 [10]. Además, la respuesta humoral es deficiente después de la inmunización en individuos inmunodeprimidos [11]. Como resultado, los métodos serológicos aprobados para uso clínico deben proporcionar resultados precisos con un amplio rango dinámico de anticuerpos desde el extremo bajo al alto.

Tabla 1 Características de la población de estudio.

2. Objetivos

Comparar cuatro ensayos serológicos cuantitativos de SARS-CoV-2 en pacientes con COVID-19 e individuos sanos inmunizados, pacientes con cáncer y pacientes con terapia inmunosupresora, utilizando muestras recolectadas de la primera a la cuarta dosis de vacunación. Evaluamos los cuatro ensayos serológicos etiquetados para uso clínico en un rango dinámico extendido (medible).

3. Diseño del estudio

3.1. Reclutamiento, muestreo y recopilación de datos.

Se obtuvo la aprobación del comité de ética institucional y el consentimiento de los participantes. Desde mayo de 2021 hasta julio de 2022, inscribimos a personas sanas, pacientes con cáncer y pacientes con terapia inmunosupresora después de una a cuatro dosis de la vacuna COVID-19 en Kingston, Ontario, Canadá. También se obtuvieron muestras de suero de pacientes hospitalizados con COVID-19 admitidos en el Centro de Ciencias de la Salud de Kingston entre febrero de 2021 y abril de 2022. Hubo 210 muestras en total, incluidas 82 muestras positivas para COVID-19-y 128 muestras de personas inmunizadas. Este último incluye 42 muestras de individuos sanos, 44 de pacientes con cáncer y 42 de pacientes con terapia inmunosupresora (23 de pacientes con trasplante renal y 19 de pacientes con otra terapia inmunosupresora). La terapia inmunosupresora para pacientes con trasplante renal consistió en una triple terapia con un inhibidor de la calcineurina (tacrolimus o ciclosporina), con un agente antiproliferativo (micofenolato, azatioprina, sirolimus o everolimus) y corticosteroides. Los participantes inmunizados recibieron BNT162b2, AZD1222, ARNm-1273 o una combinación de vacunas de varios fabricantes. Entre 128 muestras de sangre de participantes inmunizados, se obtuvieron 35, 70, 22 y 1 después de la primera, segunda, tercera y cuarta dosis de inmunización, respectivamente. Ningún participante recibió la vacuna bivalente. En pacientes hospitalizados con COVID-19, su infección se confirmó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)/análisis de mutación genética realizado en el Kingston Health Sciences Center siguiendo el protocolo estándar. Tanto los resultados positivos como los negativos de la PCR se informaron a la base de datos de Public Health Ontario.

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3.2. Medición de anticuerpos cuantitativa, semicuantitativa y cualitativa.

Se evaluaron cuatro métodos serológicos, incluido Euroimmun Anti-SARS-CoV-2 QuantiVac ELISA (IgG) (número de producto: EI 2606- 9601-10 G), Abbott Architect AdviseDx SARS-CoV-2 IgG II ( número de producto: 6S60), Roche Elecsys Anti-SARS-CoV-2 S (número de producto: 09289267190) y DiaSorin LIAISON SARS-CoV-2 TrimericS IgG (número de producto: 311510). Tecnólogos de laboratorios médicos realizaron pruebas de 210 muestras en tres laboratorios clínicos académicos. Las pruebas se realizaron en instrumentos de cada fabricante de pruebas de serología, a saber, EUROIMMUN Analyzer 1, Abbott ARCHITECT, Roche Cobas e602 y DiaSorin LIAISON. Todos los resultados se informaron en unidades de unión de anticuerpos/ml (BAU/ml). Los cuatro métodos miden los anticuerpos IgG contra el dominio de unión al receptor de picos (S1) del SARS-CoV-2. El título semicuantitativo de anticuerpos IgG contra el dominio de unión al receptor de pico (S1) del SARS-CoV-2 se derivó de la medición cuantitativa de anticuerpos. El título se determinó dividiendo los niveles cuantitativos de anticuerpos por los valores de corte correspondientes de cada fabricante. Los títulos de anticuerpos se redondearon a un número entero y los superiores a 1 se incluyeron en la comparación. Los niveles cuantitativos de anticuerpos para el dominio S1 del SARS-CoV-2 se compararon con su valor de corte positivo correspondiente para determinar el resultado cualitativo de la prueba, ya sea positivo o negativo. La prueba EUROIMMUN tiene un rango límite (mayor o igual a 25,6 a<35.2 BAU/mL); antibody results within the borderline range were excluded from the quantitative comparison. 

3.3. Presentación de datos y análisis estadístico.

La presentación de datos y la comparación de métodos cuantitativos se realizaron utilizando EP Evaluator 12 (Data Innovations LLC, Estados Unidos). Con base en los requisitos reglamentarios comunes para los ensayos inmunológicos, se eligió un error total permitido (TEa) de ±25 % como criterio para determinar si los dos métodos son clínicamente equivalentes. El análisis de comparaciones semicuantitativas y cuantitativas se realizó mediante SPSS Statistics (IBM SPSS Statistics, Estados Unidos). Se determinó que todos los grupos no tenían una distribución normal (p.< 0.001, Shapiro-Wilk normality test). The results were reported as medians and interquartile range (IQR). Friedman's and Pearson's Chi-Square tests were used to determine statistical significance between groups.

Cuadro 2 Principales características de los cuatro inmunoensayos evaluados.

Fig. 1. Comparaciones por pares de pruebas serológicas cuantitativas.

4. Resultados

4.1. Características de la cohorte de estudio.

Los niveles demográficos y cuantitativos de anticuerpos de los participantes del estudio se resumen en la Tabla 1. Los datos de la cohorte de vacunas se separan además en individuos sanos, pacientes con cáncer y pacientes con terapia inmunosupresora (IST). Se muestra el rango dinámico de los niveles cuantitativos de anticuerpos IgG contra el SARS-CoV-2.

Fig. 2. Comparación por pares de la concordancia de las pruebas serológicas semicuantitativas.

4.2. Características de los métodos de pruebas serológicas.

Las principales características de los cuatro métodos de prueba serológica para IgG contra la proteína S1 del SARS-CoV-2 se resumen en la Tabla 2. Todos los cuatro métodos están aprobados para su uso por HC para uso clínico y por la FDA para EUA. Tres fabricantes establecen un valor de corte único que representa la seroconversión, mientras que Euroimmun proporciona un rango límite (mayor o igual a 25,6 a<35.2 BAU/mL). 

4.3. Comparación de la medición cuantitativa de anticuerpos.

La figura 1 muestra las comparaciones de los cuatro métodos serológicos entre 210 muestras, que incluían muestras tanto inmunizadas como positivas para COVID-19-. Todas las comparaciones pareadas demostraron un acuerdo inaceptable, utilizando TEa de ±25% como criterio. El mejor acuerdo fue 74 (35,2% de 210 muestras) entre Euroimmun y DiaSorin, mientras que el acuerdo más bajo fue 11 (5,2% de 210 muestras) entre Euroimmun y Roche. La figura 1 también muestra el modelo de regresión lineal (estadística de regresión de Deming) para cada comparación, con una pendiente que oscila entre 1,3 y 7,6. Análisis adicionales basados ​​en muestras inmunizadas y positivas a COVID-19-por separado demostraron resultados similares, que se proporcionan en los datos complementarios.

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4.4. Comparación de la medición de anticuerpos semicuantitativa. 

La Fig. 2 representa los títulos de anticuerpos para los cuatro métodos serológicos comparados por pares, utilizando 210 muestras. El título de anticuerpos de cada muestra se calculó mediante la concentración numérica de anticuerpos dividida por el valor de corte para cada método. Los títulos de anticuerpos entre los cuatro métodos fueron significativamente diferentes (p <0,001, prueba de Friedman). La diferencia de títulos más alta de la misma muestra fue entre Roche y DiaSorin con una diferencia de 1392-veces. Análisis adicionales basados ​​en muestras inmunizadas y positivas a COVID-19-por separado demostraron resultados similares, que se proporcionan en los datos complementarios.

4.5. Comparación de la medición cualitativa de anticuerpos.

La comparación cualitativa de los cuatro métodos de prueba serológica se resume en la Tabla 3. De las 173 muestras en las que hubo una concordancia perfecta entre los cuatro métodos serológicos, 148 resultados fueron positivos y 25 negativos. Hubo 31 muestras en las que hubo desacuerdo entre al menos uno de los cuatro métodos de prueba. Estas muestras de desacuerdo se categorizaron aún más según qué prueba proporcionó el resultado distinto. Ninguna de las comparaciones pareadas basadas en resultados cualitativos mostró concordancia (p < 0.001, prueba ChiSquare de Pearson).

Tabla 3 Acuerdo de Pruebas Serológicas Cualitativas de Anticuerpos.

5. Discusión

Según el conocimiento de otros programas de vacunación, existen múltiples marcadores sustitutos para determinar la inmunidad. Entre ellos se incluyen los niveles de anticuerpos determinados mediante inmunoensayo, ensayo de neutralización viral y bacteriana, ensayo de interferón y ensayo de hemaglutinación [6]. El seguimiento de la respuesta inmune mediada por células a un antígeno viral en el laboratorio es un procedimiento que requiere mucha mano de obra. Se realiza sólo en laboratorios especializados, por ejemplo, en laboratorios de citómetros de flujo avanzados, y no se utiliza de forma rutinaria con fines clínicos. Por el contrario, la detección de anticuerpos circulantes se puede realizar con relativa facilidad utilizando ensayos serológicos de alto rendimiento. Por lo tanto, el inmunoensayo semicuantitativo (que mide el título de anticuerpos) y cuantitativo (que mide la concentración de anticuerpos) es la metodología más utilizada para evaluar la inmunidad después de la inmunización [6].

Las pruebas serológicas son esenciales para evaluar la eficacia de la vacunación contra el SARS CoV-2 [12,13]. Desde el inicio de la pandemia de COVID-19 y especialmente después de que la vacuna contra el SARS-CoV-2 estuvo disponible a nivel mundial, se ha publicado una extensa literatura de investigación para evaluar las respuestas inmunitarias humorales mediante diversos inmunoensayos [12,13]. Los resultados de varios métodos analíticos deben ser comparables para poder comprender adecuadamente las conclusiones de diversas publicaciones. Además, para evaluar de forma fiable la eficacia de la inmunización contra el SARS-CoV-2 con fines clínicos, es fundamental desarrollar inmunoensayos sólidos y realizar una comparación y estandarización exhaustivas de los métodos. Después de que se requiere un alto nivel de acuerdo entre varios métodos, se podría elegir un límite basado en ensayos semicuantitativos o cuantitativos para SARS-CoV-2 para representar la protección y la inmunidad.

Nuestro estudio demostró acuerdos deficientes entre cuatro métodos serológicos aprobados para uso clínico por Health Canada y la FDA, fabricados por Euroimmun, Abbott, Roche y DiaSorin. Como aún no se conoce el TEa para las respuestas serológicas del SARS-CoV-2, elegimos arbitrariamente ±25 %, que se usa comúnmente para otros inmunoensayos. Utilizando este criterio, se observaron malos acuerdos en todas las comparaciones entre dos métodos cualesquiera. Aunque la comparación entre Euroimmun y DiaSorin es superior a cualquier otra comparación, solo el 35,2% de 210 muestras se consideraron aceptables. De forma semicuantitativa, después de convertir los resultados cuantitativos en títulos dividiendo los niveles cuantitativos de anticuerpos por los valores de corte correspondientes de cada fabricante, los títulos de cualquiera de los dos métodos diferían significativamente (p < 0.001). La diferencia de títulos más alta se produjo entre Roche y DiaSorin con una diferencia de 1392-veces. Claramente, los métodos serológicos disponibles actualmente difieren significativamente tanto cuantitativa como semicuantitativamente y no pueden proporcionar el rendimiento requerido para el uso clínico de rutina. Además, cuando aplicamos los valores de corte de seroconversión en los resultados y determinamos las tasas positivas en los cuatro métodos en 210 muestras, hubo diferencias estadísticas significativas (p <0,001) en cualquiera de los dos métodos comparados.

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En noviembre de 2020, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció un estándar internacional y un material de referencia para la inmunoglobulina anti-SARSCoV-2 (código NIBSC 20/136) [14]. El objetivo de este material de referencia es armonizar la evaluación de la respuesta inmune humoral después de una infección natural o vacunación. Los cuartos métodos que se están evaluando son trazables hasta este material de referencia y sus resultados podrían informarse en BAU/mL, una unidad recomendada por la OMS. Euroimmun, en su documento de instrucciones, proporcionó la correlación con este material de referencia con R2=0.99. No está claro por qué se observó un acuerdo deficiente en nuestro estudio. En julio de 2022, la OMS proporcionó el segundo estándar internacional para inmunoglobulinas anti-SARS-CoV-2 y un panel de referencia para anticuerpos contra las variantes preocupantes del SARS-CoV-2 [15]. Probablemente, la aplicación de este nuevo material de referencia podría mejorar la concordancia de las mediciones de anticuerpos, especialmente para las muestras positivas para COVID-19-. En conclusión, encontramos una correlación pobre entre todos los ensayos evaluados, cuantitativa, semicuantitativa y cualitativamente. Se requiere una mayor armonización de los ensayos para lograr mediciones comparables.

Referencias

[1] Estadísticas e investigación sobre vacunas contra el coronavirus (COVID-19). https://ourworldindata.org/covid-vaccinations, (consultado el 3 de agosto de 2022).

[2] Health Canada, Vacunas COVID-19 aprobadas, (consultado el 3 de agosto de 2022). https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines.html.

[3] Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU., "COVID-19 Vaccines" (consultado el 3 de agosto de 2022). https://www.fda.gov/emergency-preparedness-and-response/coronavirus-disease-2019-covid-19/covid-19-vaccines.

[4] J. Cui, F. Li, Z.-L. Shi, Origen y evolución de los coronavirus patógenos, Nat. Rev. Microbiol. 17 (3) (2019) 181–192.

[5] H. Bisht, A. Roberts, L. Vogel, A. Bukreyev, PL Collins, BR Murphy, K. Subbarao, B. Moss, La proteína de pico del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo expresada por el virus vaccinia atenuado inmuniza de forma protectora a los ratones, Proc . Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 101 (17) (2004) 6641–6646.

[6] SA Plotkin, Correlatos de protección inducida por la vacunación, Clin. Vacuna Inmunol. 17 (7) (2010) 1055–1065.

[7] Comité Nacional de Científicos de Laboratorio Clínico (NCCLS). Detección y Cuantificación de Anticuerpos IgG contra Rubéola en el Laboratorio Clínico; Directriz aprobada. 1997 Wayne, Pensilvania.

[8] Z. Gao, JG Wood, MA Burgess, RI Menzies, PB McIntyre, CR MacIntyre, Modelos de estrategias para el control de la rubéola y el síndrome de rubéola congénita: una experiencia de 40- años en Australia, Vacuna 31 (4) (2013) 691–697.

[9] Comité Nacional de Científicos de Laboratorio Clínico (NCCLS). Criterios de evaluación y rendimiento para productos de prueba de componentes múltiples destinados a la detección y cuantificación del anticuerpo IgG contra rubéola, I/LA6-T, guía provisional. 1985 Wayne, Pensilvania.

[10] K. Macrae, CY Gong, P. Sheth, J. Martinez-Cajas, Y. Gong, Análisis cuantitativo de las respuestas serológicas del SARS-CoV-2 después de tres dosis de inmunización y antes del avance de la COVID{{4 }} infecciones, Vacunas 10 (10) (2022) pp, https://doi.org/ 10.3390/vaccines10101590.

[11] A. Robinson, A. Mazurek, M. Xu, Y. Gong, Análisis cuantitativo del estado de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 entre pacientes con cáncer e individuos sanos con intervalos de dosificación de vacunación extendidos en Canadá, Curr. Oncol. 29 (1) (2022) 68–76, https://doi.org/10.3390/curroncol29010006.

[12] PM Folegatti, et al., Seguridad e inmunogenicidad de la vacuna ChAdOx1 nCoV-19 contra el SARS-CoV-2: informe preliminar de un ensayo controlado aleatorio, simple ciego y de fase 1/2 , Lancet 396 (10249) (2020) 467–478.

[13] LA Jackson, EJ Anderson, NG Rouphael, PC Roberts, M. Makhene, RN Coler, MP McCullough, JD Chappell, MR Denison, LJ Stevens, AJ Pruijssers, A. McDermott, B. Flach, NA Doria-Rose, KS Corbett, KM Morabito, S. O'Dell, SD Schmidt, PA Swanson, M. Padilla, JR Mascola, KM Neuzil, H. Bennett, W. Sun, E. Peters, M. Makowski, J. Albert, K. Cross, W. Buchanan, R. Pikaart Tautges, JE Ledgerwood, BS Graham, JH Beigel, Informe preliminar de una vacuna de ARNm contra el SARS-CoV-2 -, N. Engl. J. Med. 383 (20) (2020) 1920-1931.

[14] Mattiuzzo. et al. Establecimiento del Panel de Referencia y Estándar Internacional de la OMS para anticuerpos anti-SARS-CoV-2. 2020.(https://www.who.int/publications/m/ item/WHO-BS-2020. 2403).

[15] WHO/BS/2022.2427: Establecimiento del segundo estándar internacional de la OMS para inmunoglobulinas anti-SARS-CoV-2 y panel de referencia para anticuerpos contra las variantes preocupantes del SARS CoV-2. https://www.who.int/publications/m/item/who-bs- 2022.2427 (consultado el 30 de noviembre de 2022).