Diseño, síntesis y efectos antimelanogénicos de derivados de (2-fenilo sustituido-1,3-ditiolan-4-il)metanol

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Do Hyun Kim1Su Jeong Kim1Sultán Ullah1Hwi Young Yun1Pusoon Chun2Hyung Ryong Moon1

Resumen:Los autores diseñaron y sintetizaron 17 (2-fenilo sustituido-1,3-ditiolan-4-il) metanol (PDTM) derivados para encontrar un nuevo andamiaje químico, mostrando excelentesinhibidor de la tirosinasaactividad. Sus actividades inhibidoras de la tirosinasa se evaluaron frente a la tirosinasa de hongo a 50 μM, y se encontró que cinco de los derivados de PDTM (PDTM3, PDTM7–PDTM9 y PDTM13) inhibían el hongo.tirosinasamás que ácido kójico o arbutina, los controles positivos. De diecisiete PDTM, PDTM3 (concentración inhibitoria media máxima 13,94±1,76 μM), con un resto 2,4-dihidroxifenilo, exhibió los mayores efectos inhibitorios (concentración inhibitoria media máxima de ácido kójico 18.86± 2,14 µM). Curiosamente, los compuestos PDTM sin grupo hidroxilo, PDTM7-PDTM9, también tenían actividades inhibidoras más fuertes que el ácido kójico. Los estudios in silico de las interacciones entre la tirosinasa y los cinco PDTM sugirieron que sus afinidades de unión estaban estrechamente relacionadas con sus actividades inhibidoras de la tirosinasa. Los experimentos basados ​​en células realizados con células de melanoma de piel de ratón B16F10 mostraron que PDTM3 inhibía eficazmentemelanogénesisy celulartirosinasaactividad. Un estudio de viabilidad celular realizado con células B16F10 indicó que el efecto antimelanogénico de PDTM3 no se podía atribuir a su citotoxicidad. Los estudios cinéticos mostraron que PDTM3 inhibió competitivamente la tirosinasa, lo que indica la unión al sitio activo de tirosinasa. Descubrimos que PDTM3 con un nuevo andamiaje químico podría ser un candidato prometedor para los agentes blanqueadores de la piel y que el anillo de 1,3-ditiolano podría usarse como un andamio químico para la potente inhibición de la tirosinasa.Palabras clave:inhibidor de tirosinasa, melanogénesis, 1,3-ditiolano, PDTM

Cistanche es un inhibidor de la tirosinasa.

Introducción

Durante las últimas décadas,inhibidores de la tirosinasahan sido de considerable interés, debido al papel clave que desempeña la tirosinasa enmelanogénesis. La melanina se produce mediante una combinación de reacciones químicas y catalizadas enzimáticamente. La ruta biosintética responsable de la producción de melanina fue aclarada inicialmente por Raper1 y Mason2 y modificada recientemente por Cooksey et al3 y Schallreuter et al.4 La melanogénesis es iniciada por la enzima tirosinasa, que cataliza los dos primeros pasos oxidativos en la ruta biosintética de la melanina: las oxidaciones de l-tirosina a l-dopa seguida de l-dopa a l-dopaquinona (Figura 1). Estos dos pasos son también los pasos que determinan la velocidad en la biosíntesis de melanina porque el pH fisiológico puede continuar espontáneamente con los pasos subsiguientes. colores rojos de la piel de los mamíferos, o al dopacromo por autooxidación y finalmente a la eumelanina, que es responsable de los colores marrón/negro de la piel de los mamíferos (Figura 1). La melanina protege la piel humana de la dañina radiación ultravioleta y también determina la apariencia fenotípica. Por otro lado, la acumulación excesiva de melanina en la piel puede causar enfermedades asociadas a la hiperpigmentación y problemas estéticos, como pecas, melasma y lentigos seniles.

tirosinasaestá ampliamente distribuido en bacterias, hongos, insectos, plantas y animales, incluidos los humanos, y es responsable de los colores de la piel y el cabello humanos y del pardeamiento indeseable de frutas y verduras.6 Pardeamiento enzimático indeseable y enfermedades asociadas con hiperpigmentación en la piel han alentado a los científicos a buscar nuevos inhibidores potentes de la tirosinasa para su uso como agentes para blanquear la piel y evitar el oscurecimiento. Muchosinhibidores de la tirosinasahan sido descubiertos hasta la fecha,7–9 pero relativamente pocos han sido aprobados como materiales para blanquear la piel, debido a problemas de seguridad o efectos blanqueadores débiles.

En nuestros estudios previos, sobre la base de estructuras de l-tirosina y l-dopa, sustratos naturales de la tirosinasa, diseñamos dos posibles inhibidores de la tirosinasa con un anillo de tiazolidina (MHY384 y MHY794; Figura 1) y los sintetizamos por condensación de un apropiado benzaldehído y l-cisteína o clorhidrato de cisteamina. Estos dos compuestos fueron identificados como potentes competidoresinhibidores de la tirosinasay para reducir eficazmente la melanogénesis en ratones sin pelo HRM2.10,11 Además de inhibir directamente la actividad de la tirosinasa, MHY384 inhibió la expresión de tirosinasa al suprimir las vías del monofosfato de adenosina cíclico-PKA10 y del monofosfato de guanosina cíclico-PKG12,13 inducido por NO, y MHY794 también suprimiótirosinasaexpresión inducida por NO mediadamelanogénesis11 Estos resultados positivos y el hecho de que el divalente –S– es un isóstero clásico del divalente –NH– nos animó a sintetizar derivados con un anillo de ditiolano como sustituto del anillo de tiazolidina que existe comúnmente en MHY384 y MHY794, con el fin de encontrar nuevos inhibidores de tirosinasa.

En el presente estudio, como parte de nuestros esfuerzos en curso para encontrar un andamio químico nuevo y fuerte para la inhibición de la tirosinasa y desarrollar nuevosinhibidores de la tirosinasa, sintetizamos una clase de derivados estructuralmente novedosos (2-fenilo sustituido-1,3-ditiolan-4-il)metanol (PDTM) (Figura 1) e investigamos sus efectos antimelanogénicos utilizando tirosinasa de hongos y ensayos basados ​​en células. En este estudio, el ácido kójico y la arbutina se usaron como control positivo para la actividad inhibidora de la tirosinasa, porque el ácido kójico es uno de los controles positivos más utilizados para la evaluación de la inhibición de la tirosinasa y la arbutina se usa clínicamente como agente blanqueador.

materiales y métodos

Materiales

A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos disponibles comercialmente: l-tirosina (código T3754), l-dopa (código PHR1271), ácido kójico (código K3125), MTT (3-(4,5-dimetil{{ 8}}tiazolilo)-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro) (código M2128), PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) (código P7626), Triton X-100 ( 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenilpolietilenglicol) (código T8787), hidrogenofosfato de potasio (código P9666), dihidrogenofosfato de potasio (código PHR1330), 2,3- dimercapto-1-propanol (código 64046), 1,4-dioxano (código 296309), ácido sulfúrico (código 339741) y benzaldehídos: se adquirieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.). El suero bovino fetal, el medio de Eagle modificado por Dulbecco, la solución salina tamponada con fosfato (PBS), la penicilina, la estreptomicina y la tripsina se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Hongotirosinasa(código T3824) y la hormona estimulante de melanocitos (-MSH; código M4135) también se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H y 13C se registraron en los instrumentos Varian Unity Inova 400 y Varian Unity AS 500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los datos de espectrometría de masas (MS) de baja resolución y MS de alta resolución se obtuvieron en un Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, EE. UU.) y un espectrómetro de masas de cromatografía líquida de tiempo de vuelo de cuadrupolo de masa precisa 6530 (Agilent), respectivamente . La síntesis de PDTM1–PDTM17 se realizó en nuestro laboratorio.

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Procedimiento general para la síntesis de PDTM1–PDTM17

A una solución agitada de 2,3-dimercapto-1-propanol (100 mg, 0,80 mmol) en 1,4-dioxano (1 ml) se añadió una solución de ácido sulfúrico (equivalencia 0,1) en 1,4-dioxano (1 ml) y un benzaldehído apropiado (equivalencia 1,1) posteriormente. Después de agitarse a temperatura ambiente durante 10 minutos, la mezcla de reacción se agitó a 70 grados durante 40 minutos a 1 hora. Luego, la mezcla se repartió entre acetato de etilo y agua, y la capa orgánica se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se evaporó. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar productos PDTM puros: PDTM1–PDTM17.14 Caracterización estructural (RMN 1H y 13C y datos de masa de todos los PDTM y RMN 1-D y 2-D los espectros de algunos PDTM) de compuestos sintetizados se proporcionan en Materiales complementarios.

Inhibición de hongostirosinasapor PDTM1–PDTM17

Los efectos inhibitorios de los análogos de PDTM sobre la tirosinasa de hongos se exploraron con modificaciones menores, como se describió anteriormente en nuestro trabajo.15 Cada compuesto (10 μL, concentración final 50 μM) se mezcló con una solución de sustrato (170 μL), preparada a partir de fosfato de potasio 14,7 mM. tampón (pH 6,5) y solución de l-tirosina 293 µM (1:1, v/v), en cada pocillo de una placa de pocillos 96-. A cada pocillo, se añadió solución de tirosinasa de hongos (20 μL, 1,000 U/mL) y se incubó durante 30 minutos a 37 grados. El contenido de dopacromo formado en los pocillos se determinó midiendo las densidades ópticas a 475 nm utilizando un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Como controles positivos se utilizaron ácido kójico y arbutina. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Tasas de inhibición detirosinasase calcularon así:

Inhibición (porcentaje)=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)

donde A indica la densidad óptica del compuesto de prueba y B representa la densidad óptica del control.

La mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50) es la concentración de un compuesto que inhibe una respuesta estándar del 50 por ciento. IC50 se deriva del eje x en una curva de concentración de inhibidor versus formación de producto y se determina a partir de la alineación de la curva de dosis-respuesta en el eje y dependiente. En el presente estudio, los experimentos de inhibición dependientes de la dosis se realizaron por triplicado para determinar la IC50 de los compuestos. De acuerdo al porcentaje de inhibición de cinco dosis (concentración final 10, 20, 30, 40 y 50 µM) en cada experimento, se determinaron las curvas log-lineales y sus ecuaciones. A continuación, se calcularon los valores de IC50 individuales como la concentración cuando el eje y equivalía al 50 por ciento de inhibición. Se muestran los resultados de los tres experimentos.

Análisis de la naturaleza de la inhibición de la tirosinasa de hongos

Para dilucidar la naturaleza del efecto inhibitorio de PDTM3 sobre la tirosinasa de hongos, se realizaron estudios cinéticos. Se añadió PDTM3 (10 μL [0, 5, 10 o 25 μM de concentración final]) a 170 μL de solución de l-tirosina (0,5, 1, 2 o 4 mM de concentración final) y luego mezclado con champiñóntirosinasasolución (20 μL, 1,000 U/mL) en cada pocillo de una 96-placa de pocillos. Después de incubar la mezcla durante 30 minutos a 37 grados, se determinó el contenido de dopacromo producido en los pocillos midiendo las densidades ópticas a 475 nm utilizando un lector de microplacas. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Para la determinación de la naturaleza de la inhibición se utilizó un diagrama de Lineweaver-Burk.

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Simulación de acoplamiento de PDTM3 o ácido kójico con tirosinasa

La simulación de acoplamiento in silico de proteína-ligando se realizó con AutoDock Vina utilizando una técnica de búsqueda sistemática y la estructura 3-D de Agaricus bisporustirosinasa(ID del banco de datos de proteínas 2Y9X).16,17 En la estructura cristalina de la tirosinasa, el sitio de unión de la l-tirosina se usó como un bolsillo de acoplamiento. Los resultados de la simulación se obtuvieron del acoplamiento entre tirosinasa y compuestos sintéticos (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 y PDTM13) o ácido kójico. Antes de realizar la simulación de acoplamiento con los compuestos, las estructuras 2-D de los compuestos se transformaron en estructuras 3-D, se determinaron las cargas de los compuestos y se insertaron átomos de hidrógeno mediante ChemOffice. Se utilizó LigandScout 3.1.2 para la predicción de posibles interacciones entre ligandos y tirosinasa y la identificación de farmacóforos. Las imágenes de simulación de acoplamiento de 17 PDTM se proporcionan en Materiales complementarios.

Determinación del nivel de melanogénesis en células B16F10

Se usaron ensayos de contenido de melanina con modificaciones menores en células B16F10 para los efectos inhibidores de PDTM3 enmelanogénesis.19 Se permitió que las células sembradas a una densidad de 5x104 células/pocillo en una placa de 24-pocillos se adhirieran a 37 grados en una atmósfera humidificada que contenía un 5 por ciento de CO2 durante la noche. Al día siguiente, las células se expusieron a -MSH (1 µM) y PDTM3 (0, 5, 10 o 25 µM) o ácido kójico (25 µM), y la placa se incubó durante 24 horas en las mismas condiciones. Después de lavarlas dos veces con PBS, las células se separaron mediante incubación a 60 grados en 200 μL de NaOH 1 N durante 1 hora. Los lisados ​​se trasladaron a una placa de 96-pocillos y las densidades ópticas se midieron a 405 nm mediante un lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para calcular el porcentaje medio de inhibiciones de ácido kójico y PDTM3. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

Ensayo de actividad de tirosinasa en células B16F10

Al estimar la tasa de oxidación de l-dopa,tirosinasaLas actividades se evaluaron con modificaciones menores, como se describe en el trabajo anterior. adherirse a 37 grados en una atmósfera humidificada que contenga 5 por ciento de CO2 durante 24 horas. Las células se expusieron a -MSH (1 µM) y PDTM3 (0, 5, 10 o 25 µM) o ácido kójico (25 µM), y la placa se incubó en las mismas condiciones durante 24 horas. Después de lavarlas dos veces con PBS, las células se lisaron con 100 μL de tampón de lisis que contenía PMSF 0,1 mM (5 μL), PBS 50 mM (90 μL, pH 6,8) y 1 % de Triton X-100 (5 μL) y congelada a -80 grados por 30 minutos. Los lisados ​​se descongelaron y centrifugaron a 12,000 g durante 30 minutos a 4 grados y los sobrenadantes (80 μL) se combinaron con l-dopa 10 mM (20 μL) en una placa de pocillos 96-, que luego se incubado durante 30 minutos a 37 grados. Las densidades ópticas se calcularon a 500 nm y las actividades inhibitorias de la tirosinasa se determinaron así:

Inhibición (porcentaje)=× 100 ([A−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)

donde B y A son las densidades ópticas del blanco antes y después de la incubación, respectivamente, y D y C son las densidades ópticas del compuesto de prueba antes y después de la incubación, respectivamente.

análisis estadístico

Se utilizó un análisis de varianza de una vía seguido de la prueba de Dunnett para determinar si las medias de los grupos diferían significativamente de las de los controles. Se utilizó la prueba t no pareada de Welch para determinar si los efectos de PDTM3 y del ácido kójico eran significativamente diferentes. El análisis estadístico se realizó con GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Todos los resultados se indican como media ± error estándar de tres experimentos independientes. Los valores de P bilaterales de 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados y discusión

La preparación de PDTM1–PDTM17PDTM1–PDTM17 se sintetizó como se muestra en el Esquema 1. Calentar 2,3-dimercapto-1-propanol y numerosos benzaldehídos adecuadamente sustituidos (1–17) en 1,4-dioxano en la presencia de ácido sulfúrico proporcionó los productos PDTM deseados como sólidos o aceite pegajoso. Las estructuras de los productos finales se confirmaron mediante RMN de 1H y 13C, espectroscopia de correlación, espectroscopia de correlación cuántica simple heteronuclear, espectroscopia de correlación de enlaces múltiples heteronucleares y MS de baja y alta resolución. La presencia del singlete correspondiente al protón –SCH(Ph)S– en δ=6.09–5.56 ppm en los espectros de RMN 1H confirmó la formación de un anillo de ditiolano entre los benzaldehídos y el 2,3-mercapto -1-propanol. En los datos espectroscópicos de RMN de 1H de los PDTM, el pico 2-H apareció más campo abajo que los picos de los protones unidos a los átomos de carbono sp3, y los picos 4-H exometileno y 5-H2 se observaron más campo arriba en el orden indicado. En los datos espectroscópicos de RMN de 13C, aparte de los picos del anillo de fenilo, el pico de carbono del exometileno (~64 ppm) estaba más abajo, seguido en orden por 4-C (~58 ppm), 2-C (~55,3 ppm) y 5-C (~41 ppm). Cuatro productos, PDTM6, PDTM12, PDTM13 y PDTM15, se obtuvieron cada uno como un solo racemato, mientras que los otros se obtuvieron como una mezcla de dos racematos ([2R,4R]/[2S,4S] y [2R,4S]/ [2S,4R], 1:1–1:1,5), cuyas proporciones se calcularon utilizando datos espectroscópicos de RMN 1H. El fenómeno en la formación del producto no puede explicarse simplemente por efectos estéricos, electrónicos y/o estereoelectrónicos. losinhibición de la tirosinasaEl ensayo se realizó sin la separación de los racematos.

Efectos inhibitorios de PDTM1–PDTM17 sobre la tirosinasa de hongos

Los potenciales de los 17 productos sintetizados, PDTM1–PDTM17, para inhibir la actividad de la tirosinasa de hongos se examinaron usando ácido kójico22 y arbutina23 como controles positivos. Las inhibiciones se determinaron utilizando l-tirosina 293 µM como sustrato y compuestos sintéticos a una concentración de 50 µM.tirosinasalas inhibiciones por ácido kójico y arbutina se determinaron a 50 y 500 µM, respectivamente.

Tres compuestos: PDTM11 (3,4,5-trimetoxifenilo), PDTM15 (4-hidroxi-3-metilfenilo) y PDTM17 (3,5-di-t-butilo{{ 12}}hidroximetil) – inhibió la tirosinasa en la misma medida que el ácido kójico y la inhibió más que la arbutina (Tabla 1). Cinco derivados de PDTM: PDTM3 (2,4-dihidroxifenilo), PDTM7 (4-metoxifenilo), PDTM8 (3,4-dimetoxifenilo), PDTM9 (2,4-dimetoxifenilo), y PDTM13 (3-bromo-4-hidroxifenilo): inhibieron la tirosinasa con mayor potencia que el ácido kójico. Se examinaron los valores IC50 de estos compuestos: 13,94±1,76 µM (PDTM3), 16,47±2,36 µM (PDTM7), 16,97±2,99 µM (PDTM8), 27,85±1,47 µM (PDTM9) y 15,57±3,31 µM (PDTM13). Los valores bajos de IC50 de PDTM3, PDTM7, PDTM8 y PDTM13 indicaron que la potencia era más fuerte que la del ácido kójico (18.86±2,14 µM) y la arbutina (381,26±3,22 µM), que se usaron como controles positivos . Curiosamente, este resultado coincide con nuestro hallazgo anterior de que muchos análogos con un resto 2,4-dihidroxifenilo poseen mayorinhibidor de la tirosinasaactividad que el ácido kójico.10,13,24–32

Los derivados de PDTM restantes no tuvieron (PDTM1 y PDTM2) o tuvieron un efecto inhibidor bajo (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 y PDTM16) en comparación con el ácido kójico. De acuerdo con nuestros datos acumulados de relación estructura-actividad, los análogos con al menos un grupo hidroxilo fueron más capaces de inhibir la tirosinasa. Sorprendentemente, cuatro derivados de PDTM sin grupo hidroxilo inhibieron la actividad de la tirosinasa tanto o más eficazmente que el ácido kójico. Estos fueron PDTM7 (4-metoxifenilo), PDTM8 (3,4-dimetoxifenilo), PDTM9 (2,4-dimetoxifenilo) y PDTM11 (3,4,5-trimetoxifenilo) . Compuestos (PDTM1-2, PDTM4-5 y PDTM12) con solo un 4-grupo hidroxilo en el anillo de fenilo o un grupo alcoxi o hidroxilo en la posición 3 con un 4-hidroxilo El grupo tenía poca o ninguna actividad, mientras que los compuestos (PDTM13–PDTM17) con un grupo alquilo o bromo en la posición 3 con un grupo 4-hidroxilo mostraron una actividad inhibidora de la tirosinasa de moderada a alta. Estos resultados de la relación estructura-actividad apoyan la hipótesis de que lainhibidor de la tirosinasala actividad de los compuestos con un grupo hidroxilo 4-se ve muy afectada por el tipo de sustituyente 3-.

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Modo de inhibición de la tirosinasa de hongos por PDTM3

Dado que PDTM3 inhibió el hongotirosinasala mayoría, se utilizó un diagrama de Lineweaver-Burk para determinar la naturaleza de su efecto inhibitorio. Como se muestra en la Figura 2, se obtuvo un gráfico de doble recíproco y todas las líneas con diferentes pendientes intersectaron el eje y en el mismo punto. Por lo tanto, los valores de Km (constante de Michaelis) aumentaron gradualmente con la concentración de PDTM3. Los valores detallados de los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla 2. Por otro lado, la velocidad máxima de reacción (Vmax) no se vio afectada por la concentración de PDTM3. Estos hallazgos demuestran que PDTM3 inhibió la tirosinasa de forma competitiva y dependiente de la dosis.

Simulaciones de acoplamiento in silico de asociación de tirosinasa con PDTM3, PDTM7–PDTM9, PDTM13 y ácido kójico

Se utilizó AutoDock Vina para determinar si los análogos de PDTM sintetizados inhibían directamente la tirosinasa mediante la unión a su sitio activo. Ácido kójico y cinco análogos de PDTM (PDTM3, PDTM7–PDTM9 y PDTM13), que se descubrió que tienen un potente efecto de hongoinhibidor de la tirosinasaactividad, se utilizaron como ligandos para la simulación de acoplamiento. Cada uno de estos análogos de PDTM podría tener cuatro estereoisómeros y las energías de unión de los estereoisómeros se indican en la Figura 3A. Se encontró que los cinco análogos de PDTM tenían una afinidad similar o superior por el sitio activo de la tirosinasa en comparación con el ácido kójico (-5,4 kcal/mol), y PDTM3 demostró la mayor afinidad. Este resultado indicó que los fuertes efectos inhibidores de estos cinco derivados de PDTM eran atribuibles a su afinidad de unión con la tirosinasa y mostró una estrecha relación entre la afinidad de unión, determinada por simulación de acoplamiento, y la inhibición de la tirosinasa.

Se usó LigandScout 3.1.2 para identificartirosinasaresiduos de aminoácidos que interactúan con los análogos de PDTM. Como se muestra en las Figuras 3B y C, el grupo hidroxilo 4-en el anillo de fenilo de PDTM3 interactuó con His85 de tirosinasa a través de enlaces de hidrógeno, y el anillo de fenilo interactuó con Val283 y Ala286 a través de interacciones hidrofóbicas y con His263 a través de π–π interacción de apilamiento. Los enlaces de hidrógeno entre el grupo hidroxilo alcohólico y los residuos de aminoácidos de la tirosinasa se detectaron solo para PDTM7 y PDTM8. Sin embargo, el grupo hidroxilo alcohólico de ambos análogos de PDTM interactuó con diferentes residuos de aminoácidos, por ejemplo, PDTM7 interactuó con His244 y Asn260, mientras que PDTM8 interactuó con Gly281. Además, Val283 de tirosinasa estuvo involucrado en interacciones hidrofóbicas con los cinco análogos.

Ensayos de contenido de melanina

Se usaron células B16F10 para evaluar las actividades despigmentantes de los análogos de PDTM. PDTM3 fue elegido para los experimentos basados ​​en células, debido a su potente hongoinhibidor de la tirosinasaefecto y su falta de toxicidad para las células B16F10. PDTM3 se evaluó por su efecto inhibidor contra estimulado por -MSHmelanogénesisen células B16F10 mediante la determinación de los niveles de melanina en las células. Los niveles de melanina se redujeron significativamente después de que las células se cotrataran con PDTM3 y -MSH en comparación con las células tratadas con -MSH solo. En el rango de concentración de 0 a 25 μM, PDTM3 exhibió un efecto antimelanogénico significativo y dependiente de la dosis. Además, a una concentración de solo 10 μM, PDTM3 mostró una mayor potencia inhibitoria que el ácido kójico a 25 μM, como se muestra en la Figura 5. Estos resultados indicaron que el efecto antimelanogénico de PDTM3 en células B16F10 no estaba relacionado con la citotoxicidad.

Ensayo de actividad de tirosinasa en células B16F10

El efecto inhibidor de PDTM3 sobre la actividad de la tirosinasa celular se examinó en células B16F10 preestimuladas con -MSH. Inhibición dependiente de la dosis de PDTM3tirosinasaactividad en el rango de concentración 0–25 μM (Figura 6). Además, estos resultados coincidieron bien con los resultados del contenido de melanina, lo que sugirió que el efecto antimelanogénico de PDTM3 era atribuible a la inhibición de la tirosinasa.

Conclusión

En este trabajo, una variedad de análogos de PDTM fueron sintetizados y evaluados por sus efectos sobremelanogénesisy actividad tirosinasa en células B16F10. Ocho análogos exhibieron una inhibición tanto o más potente contra la tirosinasa de hongo que el ácido kójico, y PDTM3 tuvo la mayor actividad inhibidora. En las células B16F10, PDTM3 inhibió significativamente la biosíntesis de melanina de manera dependiente de la dosis ytirosinasaactividad en el rango de concentración 0–25 μM sin efecto citotóxico. A una concentración de 10 μM, PDTM3 redujo la biosíntesis de melanina y la actividad de tirosinasa significativamente más que el ácido kójico a 25 μM. En vista de nuestra observación de que muchos análogos de PDTM mostraron potentes actividades inhibidoras de la tirosinasa, sugerimos que el 1,3-ditiolano se considere un andamio apropiado parainhibidor de la tirosinasaactividad. Ahora, estamos buscando las condiciones de separación de cada mezcla PDTM de dos racematos, y las condiciones de separación y el efecto antimelanogénico de cada racemato se informarán a su debido tiempo.

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