Evaluación de la actividad antimelanogénica y el mecanismo de galangina in silico e in vivo

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Ki Wung Chung, un Hyeong Oh Jeong, un Eun Kyeong Lee, un Su Jeong Kim, un Pusoon Chun,bHae Young Chung,*, y Hyung Ryong Moon*, un

La pigmentación anormal debido a la síntesis excesiva de melanina puede provocar problemas graves como pecas, manchas de la edad y melanoma. Los inhibidores de la tirosinasa han sido un objetivo interesante para el tratamiento de la hiperpigmentación porque la tirosinasa es la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de melanina. La detección de inhibidores potentes de la tirosinasa condujo al descubrimiento del flavonoidegalanina, que mostró notables efectos inhibitorios sobre la tirosinasa de hongo. El valor IC50 de la galanina (3,55±0,39 µM) fue inferior al del ácido kójico (48,55±1,79 µM), que se utilizó como control positivo. Los estudios mecánicos y de simulación de acoplamiento in silico demostraron que la galanina interactuaba con los sitios catalíticos de la tirosinasa y competía con la tirosina. En células de melanoma B16F10 estimuladas con hormona estimulante de melanocitos, la galanina inhibió la actividad de tirosinasa así como la producción de melanina. Aunque altas dosis degalaninafueron citotóxicos, no se observaron efectos citotóxicos a dosis bajas. Además, la eficacia in vivo de la galanina se evaluó en ratones sin pelo que poseían melanina HRM2. Según lo medido por el índice de blanqueamiento de la piel y la tinción de melanina, la exposición repetida a los rayos UVB aumentó la síntesis de melanina en la piel. La aplicación de galangina redujo significativamente la melanogénesis inducida por la exposición a los rayos UVB. Colectivamente, nuestros datos indican quegalaninamuestra una fuerte actividad de inhibición de la tirosinasa, lo que sugiere que puede ser un agente efectivo para blanquear la piel.

Palabras clavegalanina; melanogénesis; pigmentación; tirosinasa

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Galangina, un compuesto flavonoide, se encuentra en altas concentraciones en Alpinia officinarum y Helichrysum) Estudios previos han demostrado que galangina tiene varias actividades farmacológicas, protege a las plantas de la radiación UV, patógenos y herbívoros, y ejerce actividades antibacterianas y antivirales.2– 4) Sin embargo, también tiene propiedades antioxidantes, que son atribuibles a sus efectos beneficiosos.5) Galangina también ejerce efectos anticancerígenos a través de la inhibición del crecimiento de las células cancerosas.6,7)

La melanina es un pigmento biológico que se encuentra en la mayoría de los organismos. En biología de la piel, la melanina se produce por la oxidación del aminoácido tirosina. En la fisiología normal, la melanina previene las lesiones de la piel a través de la absorción de la radiación ultravioleta nociva. 8) La melanina sintetizada en los melanocitos de la piel se distribuye a los queratinocitos, donde participa principalmente en la protección contra la radiación ultravioleta dañina. 8) Sin embargo, a pesar de ciertas ventajas, el exceso de melanina también puede causar problemas estéticos y enfermedades de la piel.9) Las pigmentaciones anormales, como pecas, manchas de la edad, melasma y lentigos seniles, causan serios problemas a la fisiología normal de la piel.10,11) Por lo tanto, la modulación de la melanogénesis es una estrategia importante para el tratamiento de la pigmentación excesiva de la piel. Varias enzimas participan en los procesos de melanogénesis. Entre estas diversas enzimas, la tirosinasa, que cataliza los procesos de oxidación de L-tirosina a 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y L-DOPA a dopaquinona, es la más importante.12) Estos procesos mediados por tirosinasa son procesos limitantes de velocidad. En condiciones anormales, se ha detectado hiperactivación de la tirosinasa con un aumento de la producción total de melanina.13) Debido a su papel clave en la melanogénesis, la tirosinasa es un objetivo atractivo para un agente despigmentante.14) Por lo tanto, varios inhibidores de la tirosinasa tanto naturales como sintéticos se han desarrollado las fuentes. Muchos inhibidores de la tirosinasa, incluidos la hidroxiquinona, el ácido kójico y la arbutina, se han utilizado anteriormente en las industrias cosmética y de medicamentos. Aunque se han desarrollado comercialmente varios inhibidores de la tirosinasa, se han hecho evidentes los efectos secundarios citotóxicos.12) Por lo tanto, se necesitan agentes blanqueadores de la piel eficaces y seguros.

El propósito de este estudio fue caracterizar galangina como un potente inhibidor de la tirosinasa utilizando varios métodos experimentales. Durante la búsqueda de inhibidores de la tirosinasa de fuentes naturales, encontramos que la galangina redujo significativamente la actividad de la tirosinasa con una potencia alta. Debido a que ya se informaron los efectos inhibidores de la galanina sobre la tirosinasa, nos enfocamos en los mecanismos inhibidores y la potencia en experimentos con células y animales.1) Usando varios experimentos in silico, in vitro e in vivo, nuestros datos indicaron que la galangina puede ser un poderoso agente blanqueador de la piel para el tratamiento de la pigmentación de la piel.

Beneficios para la salud de la cistanche tubolosa:blanqueamiento de la piel

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Galangina, ácido kójico, tirosinasa de hongos, L-tirosina, hormona estimulante de melanocitos (-MSH) y otros reactivos químicos se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.).

Medición del efecto inhibidor de la tirosinasa y el mecanismo inhibidor en un sistema sin células

Para evaluar la eficacia inhibidora y los mecanismos de galangina sobre la tirosinasa, se utilizó tirosinasa de hongo como se describió anteriormente. Brevemente, se disolvieron 1000 unidades de tirosinasa de hongo en 20 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agregaron a 170 µL de la mezcla de ensayo, que contenía L-tirosina 1 mM, tampón de fosfato 50 mM (pH 6,5) y 10 µL de el material de prueba. La mezcla se incubó a temperatura ambiente (25 grados) durante 30 min. La cantidad de dopacromo producido se midió espectrofotométricamente a 492 nm (OD492) en un lector de microplacas. El IC50 se calculó a partir de repeticiones del experimento a diferentes dosis de galangina. Para determinar el mecanismo inhibitorio de la galanina, se realizó un ensayo cinético de tirosinasa. Se usaron varias concentraciones de L-tirosina (1, 2, 4 y 8 mM) para el ensayo de inhibición. Después del examen, cada valor se convirtió en su recíproco de acuerdo con las gráficas de Lineweaver-Burk. Los resultados mostraron la gráfica de 1/V frente a 1/[S]. La intersección de cada gráfico se utilizó para determinar el mecanismo inhibitorio.

Simulación de acoplamiento

Para la simulación de acoplamiento proteína-ligando in silico, utilizamos AutoDock4.2. Se obtuvo una unión exitosa entre la proteína y el ligando. La estructura tridimensional (3D) de tirosinasa utilizada en la estructura cristalina era de Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) y se utilizó un sitio de unión predefinido de tirosina como bolsillo de acoplamiento.15) Las simulaciones de acoplamiento se realizaron entre tirosinasa y galangina /ácido kójico. Los compuestos se prepararon para la simulación de acoplamiento mediante los siguientes pasos: (1) las estructuras 2D se convirtieron en estructuras 3D; (2) se calcularon las cargas y (3) se agregaron átomos de hidrógeno usando el programa ChemOffice. LigandScout 3 calculó la predicción de posibles residuos de enlaces de hidrógeno entre los compuestos y la tirosinasa y la generación de farmacóforos.0.

Sistema de cultivo celular

Las células B16F10 de melanoma murino obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD, EE. UU.) se usaron por primera vez para evaluar los efectos de la galanina en la inhibición de la tirosinasa. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; WELGENE Inc., Corea, LM001-05) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (FBS; WELGENE Inc., S101-01) y penicilina/estreptomicina. (100 IU/50 µg/mL; WELGENE Inc., LS202-02) a 37 grados en una atmósfera humidificada que contiene 5 por ciento de CO2 en el aire. Para evaluar los efectos de la galangina sobre la viabilidad celular, se realizó un ensayo de viabilidad celular usando un kit disponible comercialmente (EZ-1000, Dogen Bio, Corea). Brevemente, las células se cultivaron en 96-placas de pocillos y se trataron con diferentes concentraciones de galangina. Transcurrido el tiempo indicado, se leyó la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Todos los experimentos con células se realizaron al menos tres veces para garantizar la reproducibilidad.

Actividad de tirosinasa

La actividad de tirosinasa en células B16F10 se examinó mediante la medición de la tasa de oxidación de L-DOPA. Las células se sembraron en placas de 60π pocillos, se incubaron en presencia o ausencia de 1 µM -MSH y luego se trataron durante 24 h con 5 y 10 µM de galangina. El tratamiento con ácido kójico se utilizó como control positivo. Las células se lisaron en 500 μl de tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8) que contenía 25 μl de Triton X al 1 %-100 y 25 μl de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM y luego se congelaron a -80 grados durante 30 min. Después de descongelar y mezclar, los lisados ​​celulares se clarificaron mediante centrifugación a 12000 xg durante 30 min a 4 grados. Los sobrenadantes (80 µL) se colocaron en una 96-placa de pocillos, se agregaron 20 µL de L-DOPA (2 mg/mL) y se leyó la absorbancia a 492 nm cada 10 min durante 1 h a 37 grados usando un lector de placas.

Extracto de Cistanche: inhibe la expresión de tirosinasa

Contenido de melanina

En el estudio actual, el contenido de melanina se utilizó como índice de melanogénesis. Brevemente, las células B16 se sembraron en una placa de 60π y se incubaron en presencia o ausencia de 1 µM -MSH. A continuación, las células se incubaron durante 24 h con o sin galangina a 5 y 10 µM. El tratamiento con ácido kójico se utilizó como control positivo. Después de dos lavados con PBS, las muestras se disolvieron en 500 µl de NaOH 1 N, se incubaron a 60 grados durante 1 h y se mezclaron para solubilizar la melanina. La absorbancia a 405 nm se midió utilizando un lector de microplacas.

Experimentos in vivo

La eficacia despigmentante in vivo de galangina se evaluó en experimentos con animales. Los estudios con animales fueron diseñados por el Banco de Tejidos Envejecidos, aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad Nacional de Pusan ​​y realizados de acuerdo con las pautas para la experimentación con animales emitidas por la Universidad Nacional de Pusan. Se obtuvieron ratones sin pelo HRM2 machos de seis semanas de edad que poseían melanina de Hoshino Laboratory Animals (Yoshino, Saitama, Japón) y se alojaron en condiciones controladas (23 ± 1 grado, 55 por ciento ± 5 por ciento de humedad, 12- h luz /ciclo oscuro) con libre acceso al agua y una dieta estándar de laboratorio. Después de un período de aclimatación de 1 semana, los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos de seis animales. Se prepararon galangina (10 µM) y ácido kójico (50 µM) en una solución de propilenglicol y etanol (3:7). La solución disuelta (200 µL) o vehículo se aplicó tópicamente a la piel dorsal del animal una vez al día. Los animales fueron irradiados con UVB de un CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum Inc., CA, EE. UU.) a 50 mJ/cm2 de acuerdo con el programa experimental del animal. Los colores de los sitios de la piel se midieron utilizando un espectrofotómetro CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japón) en el que los colores se describieron por sus valores L*, a* y b* de acuerdo con el sistema de color de la Comisión Internacional de L'Eclairage. Después de sacrificar los animales, se recolectaron las pieles, se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante la noche a temperatura ambiente y se tiñeron para detectar melanina usando un kit de tinción Fontana-Masson de American Master*Tech Scientific, Inc. (Lodi, CA, EE. UU.) en acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las pieles rebanadas se tiñeron con una solución de plata amoniacal durante 60 minutos a 60 grados, se incubaron en cloruro de oro al 0,1 por ciento y luego en tiosulfato de sodio al 5 por ciento.

Análisis estadístico

Se utilizó la prueba t de Student para analizar las diferencias entre dos grupos y ANOVA para analizar las diferencias entre grupos. Valores de p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" analysis="" was="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 5="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

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RESULTADOS

Simulación de acoplamiento in silico de galangina en tirosinasa

Galangin es un fitoquímico natural y contiene un resto flavonoide en su estructura (Fig. 1). Inicialmente, se realizó una simulación de acoplamiento entre tirosinasa de hongos (estructura terciaria) y compuestos (galangina, ácido kójico y tirosina). El sitio de acoplamiento al que se unieron la galangina y el ácido kójico se determinó previamente como el sitio activo de la tirosinasa. 15) Esta simulación fue exitosa y se logró una puntuación significativa. La energía de unión entre la galangina y la tirosinasa fue de -7,67 kcal/mol, según lo determinado por análisis con Autodock4.2. La energía de unión entre la tirosinasa y el ácido kójico (el control positivo) fue de -4,09 kcal/mol y de -5,13 kcal/mol entre la tirosinasa y el sustrato original, la tirosina (Tabla 1). Estos resultados mostraron que la galangina se unía a la tirosinasa con una mayor afinidad que las otras interacciones. Con base en los resultados de la simulación de acoplamiento, buscamos las interacciones entre la tirosinasa y los compuestos utilizando el programa LigandScout. Descubrimos que la galangina interactuaba con ASN-260, VAL-283, ALA-286 y PHE-292, mientras que el ácido kójico solo interactuaba con ASN-260 y MET280 ( Figura 2, Tabla 1). Por lo tanto, estas interacciones pueden ser los determinantes clave de la actividad del inhibidor y tienen un efecto importante en la puntuación de acoplamiento.

Determinación de efectos y mecanismos antimelanogénicos en tirosinasa de hongos

Sobre la base de los resultados in silicoresultados y otros resultados informados anteriormente, evaluamos los efectos y mecanismos antimelanogénicos utilizando tirosinasa de hongo. Cuando se probó con la tirosinasa de hongos en el sistema libre de células, la eficacia inhibidora de la galangina fue más fuerte que la del ácido kójico (Fig. 3A). Además, galangina redujo la actividad de la tirosinasa de forma dependiente de la dosis (Fig. 3B). Los valores IC50 de galangina y ácido kójico se calcularon y se presentan en la Tabla 2. El bajo valor IC50 de galangina (3,55±0,39 µM) indicó que la potencia era significativamente mayor que la de kójico ácido (48,55±1,79 µM). El mecanismo inhibidor de la galangina se evaluó más a fondo utilizando gráficos recíprocos dobles de Lineweaver-Burk. Se usaron varias concentraciones de L-tirosina (1, 2, 4 y 8 mM) y galangina (0, 7,5 y 15 µM) para el ensayo de inhibición. Se midieron los cambios de absorbancia dependientes del tiempo y se representaron gráficamente los resultados de doble recíproco (Fig. 3C). Los resultados indicaron que la gráfica de 1/V contra 1/[S] produjo tres líneas diferentes con diferentes pendientes, que se cruzaban en el mismo eje vertical. A medida que aumentaba la concentración del compuesto, aumentaba el valor de Km, pero los valores de Vmax permanecían iguales, lo que sugería que la galangina era un inhibidor competitivo de la unión a la tirosinasa. Estos datos coincidieron con los resultados in silico de que la galangina se unía e inhibía el sitio activo de la tirosinasa.

Fig. 1. Las estructuras de galangina, ácido kójico y tirosina

Evaluación de la actividad despigmentante de galangina en células de melanoma murino B16F10

A continuación, se evaluó la actividad despigmentante de galangina utilizando células de melanoma murino B16F10. En primer lugar, se ensayaron los efectos citotóxicos de galangina sobre células de melanoma murino B16F10. Como se muestra en la Fig. 4A, la galangina disminuyó significativamente la viabilidad celular a dosis superiores a 25 µM. Por lo tanto, para evitar la citotoxicidad, utilizamos galangina 5 µM y 10 µM en los experimentos para evaluar los efectos antimelanogénicos. Las células B16F10 se trataron con galangina en presencia de -MSH 1 µM. La síntesis total de melanina causada por el tratamiento con -MSH fue visible a simple vista y mostró que la galangina inhibía potentemente la síntesis de melanina desencadenada por -MSH (Fig. 4B). -El tratamiento con MSH aumentó significativamente la actividad de tirosinasa y el contenido de melanina de las células B16F10 (Figs. 4C, D). El tratamiento con galangina inhibió la melanogénesis celular, que fue aumentada por -MSH de manera dependiente de la dosis (Figs. 4C, D). En conjunto, estos resultados indicaron que la galangina podría ser un potente agente para la supresión de la melanogénesis a través de la inhibición de la tirosinasa.

Tabla 1. Puntajes de acoplamiento y los principales residuos interactivos de compuestos

Efectos de Galangin en la pigmentación de la piel in vivo

Los efectos inhibidores de la galangina se examinaron posteriormente en ratones sin pelo que poseían melanina que se trataron como se describe en el programa de la Fig. 5A. Los colores de los sitios de la piel se midieron con precisión utilizando un espectrofotómetro. La exposición a UVB de los ratones condujo a una disminución del valor L*, que era representativo de la pigmentación (Fig. 5B). Las disminuciones inducidas por UVB en el valor L* se bloquearon significativamente en los animales tratados con galanina en comparación con los animales de control tratados con vehículo, lo que demostró la potente eficacia despigmentante de la galanina (Fig. 5B). El valor ΔL* también indicó la potencia de galangina durante los períodos experimentales (Fig. 5C). Además, los colores de la piel detectados a simple vista el día 14 también indicaron la potencia antimelanogénica de la galangina (Fig. 5D). La tinción de Fontana-Masson, que resalta la melanina, verificó los efectos de la galangina. Las muestras de piel de animales irradiados con UVB demostraron un aumento de las manchas de melanina (Fig. 5E). De acuerdo con los datos numéricos de la espectrofotometría, los animales tratados con galanina mostraron una disminución en las manchas de melanina teñidas en comparación con los animales de control irradiados con UVB (Fig. 5E). En conjunto, estos datos sugirieron quegalaninafue un agente angiogénico efectivo en el tiempo en el modelo de melanogénesis in vivo inducida por UVB.

Fig. 2. Resultados de la simulación de acoplamiento in silico entre la tirosinasa y los compuestos candidatos

DISCUSIÓN

Se ha informado anteriormente que la galangina ejerce varios efectos biológicos, incluida la citoprotección. Aunque la actividad antitirosinasa de galangina se ha estudiado previamente, los mecanismos y la eficacia precisa en los sistemas de cultivo celular no se describieron por completo.1,16) Por lo tanto, nuestro objetivo fue explorar la potencia y los mecanismos inhibidores de galangina. La eficacia inhibidora de galangina se evaluó inicialmente mediante simulación de acoplamiento in silico. Las simulaciones de acoplamiento revelaron que la unión de galangina al sitio activo de la tirosinasa era más estable que la del sustrato original (tirosina) o el ácido kójico (control positivo). La eficacia inhibidora y los mecanismos también se confirmaron utilizando tirosinasa de hongo. Finalmente, se evaluó la eficacia inhibidora de galangina contra la melanogénesis en células de melanoma murino B16F10 estimuladas con -MSH. En resumen, el presente estudio identificó a la galanina como un agente potente.

La simulación de acoplamiento computacional se ha establecido como una herramienta poderosa para detectar y evaluar nuevos agentes farmacológicos.17) Los resultados de la simulación de acoplamiento proporcionan no solo los sitios de unión, sino también la afinidad de unión entre el compuesto y la enzima, lo que proporciona información inicial sin necesidad de pruebas físicas. experimentos.18) Aunque las predicciones no siempre son precisas y requieren más experimentos, la simulación de acoplamiento reduce los materiales y recursos necesarios y también puede respaldar los datos experimentales biológicos. Nuestra simulación de acoplamiento computacional indicó que la galangina podría unirse más fuertemente a la tirosinasa que a la tirosina o al ácido kójico. Además, el número de residuos que interactúan entre la galangina y la tirosinasa fue mayor en comparación con la tirosina o el ácido kójico. Los datos de acoplamiento iniciales se verificaron aún más mediante el uso de un ensayo de enzima tirosinasa, que mostró que la CI50 de galangina era más baja que la del ácido kójico; por lo tanto, los efectos inhibitorios de la galangina sobre la tirosinasa fueron más potentes que los del ácido kójico.

El mecanismo inhibitorio de la galangina sobre la tirosinasa se examinó más a fondo usando tirosinasa de hongo. Debido a que los datos de la simulación de acoplamiento sugirieron que la galangina se une al mismo sitio activo al que se une la tirosinasa, se anticipó que la galangina podría ser un inhibidor competitivo de la tirosinasa. Los resultados experimentales revelaron que la galangina inhibía de manera competitiva la unión de la tirosinasa a su sustrato original, la tirosina, lo que confirmó los resultados de la simulación de acoplamiento. En conjunto, los resultados demostraron la confiabilidad de la simulación de acoplamiento computacional y su potencial para detectar inhibidores.

La eficacia de galangina también se evaluó en células de melanoma murino B16F10. Galangin mostró efectos citotóxicos significativos en las células B16F10 cuando se administró en dosis altas. Esto fue consistente con informes previos de la actividad anticancerígena de la galangina en varias líneas de células cancerosas. 19,20) Debido a los efectos citotóxicos, los experimentos para verificar los efectos antimelanogénicos de las células requirieron una selección cuidadosa de las condiciones. Sin embargo, el valor IC50 de galangina fue muy bajo cuando se probó en un sistema libre de células que no mostró efectos citotóxicos. De hecho, la eficacia de galangina para la inhibición de la melanogénesis fue aceptable a dosis bajas que no ejercieron citotoxicidad. Dosis bajas de galangina redujeron efectivamente el contenido de melanina, así como la actividad de tirosinasa, en el sistema de cultivo celular. Junto con el sistema libre de células,galaninademostró tener un fuerte efecto inhibidor sobre la tirosinasa en el sistema de cultivo celular.

Finalmente, se evaluó el efecto antimelanogénico de galangina utilizando un ratón sin pelo HRM2. El modelo de ratón sin pelo HRM2 proporcionó una base útil para los experimentos de melanogénesis in vivo, ya que el ratón puede producir melanina, especialmente bajo estrés ambiental.21,22) En este modelo de ratón, la galangina mostró un efecto antimelanogénico significativo en la síntesis de melanina inducida por UVB. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que muestra la eficacia antimelanogénica de galangina utilizando un modelo de melanogénesis in vivo. Es importante establecer la eficacia in vivo porque muchos otros inhibidores de la melanogénesis no han logrado actuar in vivo debido a su incapacidad para atravesar el estrato córneo de la piel. En resumen,galaninafue identificado como un potente agente angiogénico animal in vivo. Llegamos a la conclusión de que el inhibidor de la tirosinasa galangina ofrecía un nuevo candidato a fármaco para el tratamiento de los trastornos de hiperpigmentación.

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