Evaluación de los efectos antienvejecimiento de una combinación de probióticos aislados de centenarios en un modelo de ratón SAMP8 Parte 2

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Inmunofluorescencia y Detección de Factores Inflamatorios

Los cerebros se fijaron en paraformaldehído y luego se sometieron a deshidratación, limpieza, inmersión en cera e inclusión. El tejido incrustado se cortó en rodajas de forma continua con un espesor de 5 μm. Las secciones se desparafinaron y se equilibraron con agua, se sometieron a recuperación de antígeno y se incubaron en albúmina de suero bovino (BSA) al 5 por ciento durante 30 min. A continuación, las secciones se incubaron con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados. A continuación, los núcleos se tiñeron con DAPI. Después de montar las secciones, se observaron bajo un microscopio de fluorescencia vertical y se capturaron imágenes.flavonoidesEl número de células positivas para NeuN se contó usando el software Image] (Institutos Nacionales de Salud). Se usó el número de células/campo de visión promedio para el análisis estadístico. Para detectar factores inflamatorios, la proteína se extrajo de los cerebros siguiendo el mismo método descrito para el western blot. Se utilizaron los siguientes kits para evaluar los niveles de factores inflamatorios en el hipocampo de ratones, siguiendo las instrucciones del fabricante: IL-1 (Proteintech, Cat#KE10003), TNF- (Proteintech, Cat#KE10002) e IL{ {5}} (Proteintech, n.° de catálogo KE10007).

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Extracción de ADN bacteriano

Para el análisis de la microbiota, se recogieron las heces de cada grupo de ratones (n=8). Se usó un kit de ADN genómico (Qiagen, Cat#51804) para extraer ADN genómico fecal, siguiendo las instrucciones del producto. Luego se utilizó el espectrofotómetro NanoDrop para determinar la concentración y calidad del ADN extraído. El ADN genómico se volvió a extraer de las muestras que no cumplían con los requisitos de calidad. La región V4 del ADN ribosómico 16S (ADNr) se amplificó usando los siguientes cebadores: 515F,5'-GTG CCA GCMGCC GCG GTAA-3;806R,5'-GGA CTA CVSGGG TAT CTAAT-3'. Para la secuenciación se utilizó la plataforma IlluminaHiSeq2000.usos de hesperidinaLos resultados de la secuenciación se han depositado en GenBank (número de acceso PRJNA768326).

Secuenciación de alto rendimiento Los datos se sometieron a eliminación de ruido de secuencia o agrupación de unidades taxonómicas operativas (OTU) mediante el uso del proceso de análisis del software Search o el análisis QIIME2 DADA2. El método de búsqueda (20) incluye principalmente descebado, empalme, filtrado de calidad, desduplicación, desquimerización, agrupamiento y otros pasos para obtener OTU. El método DADA2 lleva a cabo principalmente los pasos de reducción, filtrado de calidad, eliminación de ruido, empalme y eliminación de quimerismo. Cada secuencia deduplicada generada después del control de calidad de DADA2 se denomina variante de secuencia de amplicón (ASV) o secuencia característica (correspondiente a una secuencia representativa de OTU). A continuación, ASV y OTU se utilizaron para analizar la composición de especies, la diversidad alfa, la diversidad beta, las especies. análisis de diferencias y especies de símbolos, etc.

Cistanche puede antienvejecimiento

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 7 para el análisis estadístico.imperio perdido cistancheLos datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Se utilizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) para determinar una diferencia estadísticamente significativa (p<>

RESULTADOS

Propiedades probióticas

Primero, llevamos a cabo experimentos de tolerancia al ácido, tolerancia a las sales biliares y antibacterianos para evaluar las características probióticas de las cepas seleccionadas. Los cuatro probióticos seleccionados fueron tolerantes al ácido medio-fuerte (Figura 1A) y sobrevivieron en diferentes concentraciones de sales biliares (Figura 1B). Como se muestra en la Figura 1A, después de 4 h en PBS de pH 3, las tasas de supervivencia de L. fermentum SX-0718, L. Casey SX-1107, B. long SX-1326 y B. animalis SX -0582 fueron 80,2 por ciento, 92,4 por ciento, 99,0 por ciento y 99,5 por ciento, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1B, L fermentum SX-0718 tenía baja tolerancia a las sales biliares. B .fracción de flavonoides purificada micronizada 1000 mg usoslongum SX{{0}} mostró una excelente tolerancia a las sales biliares: a una concentración del 0,5 %, la tasa de supervivencia seguía siendo del 85,4 %. Además, los probióticos seleccionados inhibieron significativamente el crecimiento de los patógenos S. Typhimurium ATCC 1331l , Sh.flexneri ATCC 12022, P.acnes ATCC 11827, Sh.dysenteriae 301, E. coli O157, S. enteritidis ATCC 13076, L. monocytogenes ATCC 19111, Staph. aureus Cowan y C.albicans SC531, con un área de supresión de 15,25 mm a 22,5 mm (Figura 1C).

La combinación de probióticos mejoró el comportamiento en ratones SAMP8

La prueba del laberinto de Barnes se utilizó para evaluar el efecto de la combinación de probióticos en el aprendizaje espacial y las habilidades de memoria. En comparación con el grupo C, en el entrenamiento diario, los ratones del grupo M tardaron mucho más tiempo en encontrar la plataforma, mientras que la combinación de probióticos (grupo L y H) redujo en gran medida la latencia de escape, el período de latencia de búsqueda del foramen correcto.oteflavonoideEn la prueba de sonda, la latencia del tratamiento de combinación de probióticos fue significativamente más corta que la del grupo M (L vs.M=27.4svs.48.19s;p<0.001; vhs.m=""><0.001), and="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" low-dose="" and="" high-dose="" probiotics="" (figure="">

La prueba del polo se realizó para observar el efecto de la combinación de probióticos en la disfunción motora de los ratones SAMP8. Como se muestra en la Figura 2, en comparación con el grupo C, el grupo M mostró un retraso motor significativo (M vs. C=19.46 s vs.8.877 s;p<0.001), and="" treatment="" with="" either="" low="" or="" high="" concentrations="" of="" the="" probiotic="" combination="" significantly="" alleviated="" the="" motor="" dysfunction="" of="" samp8="" mice(l="" vs.m="13.78" s="" vs.19.46=""><0.001; vhs.m="10.73s" vs.19.46=""><>

La prueba de campo abierto se utilizó para detectar los cambios mentales y de comportamiento de los ratones en el nuevo entorno, como el comportamiento exploratorio y la ansiedad. Los parámetros experimentales mostraron que, en comparación con los ratones del grupo M (distancia =4384 cm, número=109, distancia =574 0,6), los ratones de los grupos C, L y H tenían un movimiento total más largo distancia(distancia =

5505 cm, distancia=5474 cm, distancia=5313 cm; C frente a M,P<0.05;l vs=""><0.05;h vs=""><0.05),more times="" to="" enter="" the="" central="" area="" (number="59.33," number="91.56," number="104.8;C" vs=""><0.05;l vs=""><0.05;h vs=""><0.05)and longer="" central="" movement="" distance="" (distance="1379" cm,="" distance="1187" cm,="" distance="1416" cm;="" c="" vs="" m,=""><0.05;l vs="" m,=""><0.05;h vs=""><0.05).in addition,there="" was="" no="" dose-dependent="" in="" probiotics="">

La combinación de probióticos redujo la muerte neuronal y evitó la disminución de la expresión de Sirt 1 en el hipocampo de ratones SAMP8 La reducción en el número de neuronas del hipocampo en ratones SAMP8 está estrechamente relacionada con la disminución del aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, detectamos el número de neuronas en el hipocampo de ratones SAMP8 mediante inmunotinción NeuN. En comparación con el grupo C, el grupo M tenía menos neuronas del hipocampo; la combinación probiótica protegió las neuronas del hipocampo en comparación con el grupo M (Figura 3A). La pérdida neuronal debida a la apoptosis, regulada por Bax y Bcl-2-desempeña un papel importante en la aparición y el desarrollo del envejecimiento. La p-AKT puede modular la apoptosis regulando Bcl-2/Bax. Evaluamos la expresión de Bax, Bcl-2 y p-AKT en el hipocampo de ratones usando Western blot. Los resultados mostraron que la expresión de la proteína proapoptótica Bax en los ratones del grupo M fue significativamente mayor que la de los ratones C, y la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y p-AKT fue significativamente menor que la de los ratones grupo M, mientras que la expresión de la proteína pro-apoptótica en los grupos L y H fue significativamente menor que la del grupo M, y la expresión de la proteína apoptótica fue notablemente mayor que la del grupo M. Además, la expresión de Sirt l en los grupos C, L y H fue notablemente más alta que en el grupo M, lo que indica que la combinación de probióticos podría inhibir la disminución de la expresión de Sirt 1 en ratones envejecidos. La combinación de probióticos inhibió la vía de señalización TLR4/NF-B y la inflamación del hipocampo en ratones SAMP8 La inflamación juega un papel importante en el mantenimiento y la promoción del envejecimiento, y la vía TLR4/NFkB está estrechamente relacionada con la inflamación. Por lo tanto, evaluamos la expresión de proteínas involucradas en la vía de señalización de TLR4/NFkB en el hipocampo mediante el uso de western blot. En comparación con el grupo M, la combinación de probióticos redujo significativamente TLR4,

Expresión de MyD88 y p-p65/p65 (Figura 4A, p<0.01). in="" addition,="" the="" detection="" of="" inflammatory="" factor="" protein="" levels="" showed="" that="" the="" probiotic="" combination="" significantly="" reduced="" the="" relative="" expression="" of="" the="" pro-inflammatory="" cytokine="" il-1β,="" il-6,="" and="" tnf-α="" compared="" with="" the="" m="" group,(figure="" 4b;=""><0.01). these="" results="" suggest="" that="" the="" probiotic="" combination="" modulates="" the="" upregulation="" of="" tlr4/nfkb="" signaling="" pathway="" components="" to="" reduce="" inflammation="" in="" samp8="">

La combinación de probióticos alteró la composición de la microbiota intestinal de los ratones SAMP8 La microbiota intestinal está estrechamente relacionada con la aparición y el desarrollo de la senescencia. Recolectamos las heces de los ratones y analizamos los cambios en su microbiota intestinal mediante secuenciación de alto rendimiento. Se obtuvieron un total de 1.138.968 etiquetas válidas y 10.202 OTU, con una media de 2550,25 por grupo (datos no mostrados). Para analizar la influencia de la combinación probiótica en la microbiota intestinal de ratones SAMP8, realizamos un análisis de diversidad de la microbiota . El índice de especies_observadas representó el número real observado de UTO, y el índice de Chaol indica la diversidad de la microbiota. Como se muestra en la Figura 5, el índice de especies _observadas y los índices de Chaol del grupo M de ratones se redujeron, mientras que la combinación de probióticos aumentó la abundancia y diversidad de la microbiota intestinal, aunque los cambios no fueron significativos (Figuras 5A, B). El diagrama de Venn muestra 441 OTU comunes entre todos los grupos, con 47, 42, 69 y 57 OUT únicos para los grupos C, M, L y H, respectivamente (Figura 5C). Además, el análisis de coordenadas principales (PCoA) utilizado para estudiar la similitud de las comunidades microbianas mostró que los puntos del grupo C están agrupados, los puntos del grupo M están relativamente dispersos y las muestras de los grupos C, L y Los grupos H tienen una gran similitud. Estos hallazgos indican que la combinación de probióticos altera la microbiota intestinal de los ratones envejecidos a un patrón similar al de los ratones normales (Figura 5D). Analizamos la abundancia relativa de los 20 principales géneros bacterianos entre los diferentes grupos. Hubo un notable aumento de la abundancia relativa de Alisipes, Prevotella, Odoribacter, Lactobacillus y Oscillibacter, y una disminución de la abundancia relativa de Alloprevotella, Barnesiella y Akkermansia. En comparación con el grupo M, la combinación de probióticos redujo la abundancia relativa de Alistipes y Prevotella y aumentó la abundancia relativa de Alloprevotella, Acetatifactor y Clostridium XIVa (Figura 5E). La combinación de probióticos alivió la inflamación del colon y disminuyó la expresión de la proteína de la unión estrecha en ratones SAMP8 El desequilibrio de la microbiota intestinal y la inflamación intestinal pueden estar causalmente relacionados entre sí. Por lo tanto, se utilizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) para detectar los cambios patológicos en el colon de los ratones, y se aplicó el western blot para detectar la expresión de proteínas clave en la vía inflamatoria TLR4/NFKB y proteínas relacionadas con la permeabilidad intestinal en el colon de los ratones. tejido. Como se muestra en la Figura 6, las células epiteliales de la mucosa se desprendieron y una pequeña cantidad de la estructura de la glándula intestinal se destruyó en el colon de los ratones del grupo M, mientras que no se desprendieron células epiteliales de la mucosa y la estructura de la glándula intestinal se mantuvo en los tejidos intestinales. de los grupos C, L y H. Además, usamos Western blot para examinar la expresión de proteínas clave en la vía inflamatoria TLR4/NFKB, así como

Proteínas relacionadas con la permeabilidad intestinal. En comparación con el grupo C, la expresión de ZO-1 y ocludina disminuyó y la expresión de TLR4, MyD88 y p-p65 aumentó en el grupo M. La combinación de probióticos aumentó significativamente la expresión de ZO-1 y Occludin, lo que indica una mayor integridad de la barrera intestinal, y redujo la expresión de TLR4, MyD88 y pp65 -, lo que indica una modulación de la inflamación intestinal (Figuras 6B , C).

DISCUSIÓN

El envejecimiento de la población es un problema global destacado en la sociedad actual. El envejecimiento puede provocar una serie de cambios físicos y comportamientos anormales, como pérdida de cabello, flacidez de la piel, reducción de la capacidad mental, disminución de la memoria e incluso demencia (21). Los problemas de salud causados ​​por el envejecimiento son grandes desafíos en el campo de la atención de la salud (12). Actualmente no existe una buena manera de prevenir o tratar el envejecimiento. Por lo tanto, se necesita con urgencia investigación relacionada con los tratamientos antienvejecimiento y las enfermedades relacionadas con el envejecimiento. El ratón SAMP8 exhibe un envejecimiento rápido que es consistente con lo que sucede en los humanos. Se caracteriza principalmente por reducción del aprendizaje y la memoria, deterioro cognitivo y cambios neurodegenerativos. Es un modelo de patogénesis natural común para el estudio de la demencia y el envejecimiento (22). En esta investigación, los ratones SAMP8 se utilizaron para evaluar los efectos de una combinación de probióticos. Primero, identificamos cuatro probióticos (L. fermentum SX-0718, L. casei SX-1107, B.longum SX-1326 y B.animalis SX-0582; Jiangxi Shanxing Biotechnology Co., Ltd, Nanchang, Jiangxi, PR China) de las heces de personas centenarias. Los experimentos in vitro verificaron que tenían buena resistencia a los ácidos, resistencia a las sales biliares y propiedades antibacterianas (Figura 1). Además, la combinación de probióticos podría aliviar la pérdida de peso y reducir la puntuación de envejecimiento de los ratones SAMP8 (Figuras complementarias 1B, C). En las pruebas de comportamiento, los ratones envejecidos mostraron deterioro de la memoria espacial, disfunción motora y disminución del comportamiento exploratorio (Figura 2). La combinación de probióticos pudo mejorar estos cambios, lo que indica que puede ejercer efectos antienvejecimiento. Dados los prometedores datos de comportamiento, estudiamos el posible mecanismo antienvejecimiento de la combinación de probióticos. El hipocampo está involucrado en el aprendizaje y la memoria y el daño a esta región del cerebro puede causar problemas de aprendizaje y memoria y trastornos de posicionamiento espacial (23). En comparación con el grupo C, había menos neuronas en el hipocampo del grupo M. La combinación de probióticos podría aliviar la pérdida de neuronas en ratones SAMP8 (Figura 3A). Muchos estudios han demostrado que la vía de señalización de AKT juega un papel importante en la apoptosis y el metabolismo de las neuronas. La vía de señalización de AKT mejora la supervivencia celular al regular el factor de transcripción forkhead (FKHR), así como el objetivo de rapamicina en mamíferos (mTOR) para aumentar la síntesis de proteínas y afectar los nervios. El crecimiento de las sinapsis y el desarrollo de la plasticidad sináptica afectan en última instancia al aprendizaje y la memoria.

funciones (24,25). La p-AKT puede regular directamente la formación del heterodímero Bcl-2/Bax a través de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K)-1 (26). Sirt I juega un papel importante en el desarrollo del cerebro y las neuronas, así como en la patogenia de la EA. La neurodegeneración y la función cognitiva mejoran significativamente después de la inyección de un virus que codifica Sirt l en el hipocampo (27). La investigación de Zhou et al. (28) también demostraron que el bloqueo de Sirt 1 con ARN de interferencia pequeño (ARNip) puede acelerar la patología de la EA y el deterioro cognitivo. Además, existe una interacción entre Sirt 1 y AKT. La histona acetiltransferasa (HAT) puede inhibir la fosforilación de AKT, mientras que Sirt l es una histona desacetilasa (HDAC) que usa NAD para desacetilar AKT en los residuos de lisina a los que se dirige HAT (29). Sirt 6 es otra desacetilasa dependiente de NAD plus, Kawahara et al. (30) encontraron que Sirt 6 puede reclutarse para los promotores de los genes aguas abajo de NFkB, lo que reduce el nivel de acetilación del promotor e inhibe la expresión de los genes aguas abajo relacionados con la apoptosis y la senescencia celular. Los estudios han demostrado que la sobreexpresión de Sirt 6 puede aumentar la vida útil saludable de los ratones en un promedio del 30 por ciento (31), por lo que Sirt 6 puede ser otro mecanismo por el cual los probióticos ejercen efectos antienvejecimiento, aunque esta eventualidad requiere más estudio. La detección de células positivas para NeuN, apoptosis, proteínas relacionadas con la proliferación y Sirt l en el hipocampo demostró que la combinación de probióticos puede prevenir la pérdida neuronal del hipocampo (Figura 3). El efecto neuroprotector de la combinación de probióticos en las neuronas del hipocampo puede ser a través de la regulación de la vía de señalización de AKT y Sirt 1.

La neuroinflamación juega un papel importante en las enfermedades neurológicas relacionadas con el envejecimiento como la EA y la EP(32). En estas enfermedades, varios factores inflamatorios (antígenos alimentarios, lipopolisacáridos, ácidos grasos libres, especies reactivas de oxígeno, etc.) se unen a TLR y activan NFkB , un factor importante en el sistema inmunológico y el proceso inflamatorio, después de la transducción de señales. Este fenómeno conduce a la liberación de muchos factores proinflamatorios (IL-1B, IL-6, TNF-x, etc.), causando neuroinflamación, daño cerebral y muerte neuronal (32, 33). Algunos fármacos pueden aliviar la progresión de enfermedades neurodegenerativas como la EA y la EP al modular la neuroinflamación (34,35). En este estudio, en comparación con el grupo M, los niveles de TLR4, MyD88, p-p65/p65, IL{{15 }} , TNF- e IL-6 se redujeron significativamente en los grupos L y H (Figura 4), lo que indica que la combinación de probióticos puede inhibir la neuroinflamación en ratones envejecidos y proteger las neuronas.

La microbiota intestinal está íntimamente relacionada con la salud humana. En condiciones fisiológicas normales, el huésped y la microbiota intestinal mantienen un equilibrio ecológico a través del antagonismo sinérgico. Las actividades anormales locales y continuas de los microbios intestinales pueden causar inflamación de la mucosa intestinal. Sin embargo, las reacciones inflamatorias locales a menudo conducen a la aparición de inflamación crónica de bajo grado en todo el cuerpo. La inflamación crónica de bajo grado en la mucosa intestinal resultará en la destrucción de la barrera intestinal y muchos factores dañinos (lipopolisacáridos, bacterias patógenas, etc.) ingresarán al cuerpo para inducir la neuroinflamación(14,16,32). Detectamos cambios en los microbios intestinales de ratones mediante secuenciación de alto rendimiento. En comparación con el grupo C, la diversidad y riqueza de la microbiota intestinal en el grupo M disminuyó. La combinación de probióticos contrarrestó estos cambios en la microbiota intestinal y promovió la restauración de la homeostasis intestinal (Figuras 5A, B). Con base en PCoA, encontramos que después del tratamiento con la combinación de probióticos, la microbiota intestinal de los ratones envejecidos se agregó a la microbiota intestinal del grupo C (Figura 5D), lo que indica que la combinación de probióticos restaura la microbiota intestinal de los ratones envejecidos a la composición de ratones normales. De acuerdo con los hallazgos de otros, la abundancia de Akkermansia muciniphila disminuyó y la abundancia de Prevotella aumentó en ratones de edad avanzada (15). Además, la combinación de probióticos redujo la abundancia relativa de Alistipes y Prevotella (Figura 5E). Akkermansia puede mejorar el metabolismo, ejerce actividad antiinflamatoria y aumenta la eficacia de la inmunoterapia; también está estrechamente relacionado con la función de barrera intestinal. La disminución de Akkermansia puede causar daño a la barrera intestinal y provocar inflamación en el cuerpo (36). Alistipes es un anaerobio gramnegativo y un patógeno facultativo. La abundancia de Alistipes aumenta en pacientes con depresión (37). En los microbios intestinales de pacientes con síndrome de irritabilidad intestinal, Alistipes tiende a aumentar, y este cambio puede ser una de las causas subyacentes de la depresión en dichos pacientes (38).puritanos vitamina cLos investigadores han descubierto que Alistipes puede afectar el uso de triptófano, alterando el equilibrio del sistema serotoninérgico en el intestino y luego inhibiendo la actividad eléctrica del cerebro, lo que puede conducir a una disfunción cognitiva (37). Prevotella es un género de bacterias esenciales en una biota intestinal sana. Sin embargo, estudios han demostrado que las bacterias Prevotellaceae aumentan en la microbiota intestinal de pacientes con esquizofrenia(39). La abundancia de Prevotella en la microbiota intestinal de pacientes con parálisis cerebral y niños con parálisis cerebral y epilepsia aumenta significativamente(40). La mayor abundancia de Prevotella puede estar relacionada con enfermedades como la periodontitis, la vaginosis bacteriana, la artritis reumatoide, los trastornos metabólicos y la inflamación sistémica de bajo grado(41-43). Esto puede deberse a que la colonización intestinal de Prevtella conduce a cambios en el metabolismo de la microbiota, reduciendo la producción de IL-18, lo que intensifica la inflamación intestinal y puede conducir a una autoinmunidad sistémica (44).

Los estudios han demostrado que la disfunción de la barrera intestinal y, por lo tanto, la inflamación crónica del intestino, juega un papel importante en el envejecimiento (45). Por lo tanto, examinamos los cambios patológicos en el colon en ratones y detectamos la expresión de componentes de la vía inflamatoria TLR4/NFKB (TLR4, MyD88 y p-p65) y proteínas de unión estrecha (ZO-1 y Occludin) en el colon. Las células epiteliales de la mucosa en el colon de los ratones envejecidos se desprendieron y se destruyó una pequeña cantidad de la estructura de la glándula intestinal. La combinación de probióticos contrarrestó estos cambios (Figura 6A). En comparación con el grupo C, la vía de señalización TLR4/NFKB se activó en el grupo M, con un aumento de la expresión de las proteínas relacionadas con la inflamación TLR4 y MyD88, lo que a su vez aumentó el nivel de p-p65 (Figura 6B). Al mismo tiempo,

la expresión de ZO-1 y Occludin disminuyó significativamente (Figura 6C). El tratamiento con la combinación de probióticos alivió la inflamación intestinal y aumentó la integridad de la barrera intestinal.

En resumen, hemos demostrado que la combinación probiótica, desarrollada a partir del cribado de heces de centenarios, aumenta la expresión de las proteínas relacionadas con la permeabilidad intestinal ZO-1 y Occludin mediante la regulación de la microbiota intestinal. También inhibe la inflamación intestinal inducida por TLR4/NFkB y, en consecuencia, la neuroinflamación a través del eje intestino-cerebro y aumenta la expresión de Sirt 1 para proteger las neuronas del hipocampo (Figura 7). Estos cambios subyacen a la mejora de la memoria espacial, la función motora y el comportamiento exploratorio de los ratones que envejecen. Nuestra investigación proporciona la base para que la combinación de probióticos se convierta en un suplemento dietético para combatir el envejecimiento.

Este artículo está extraído de Frontiers in Immunology|www.frontiersin.org Diciembre 2021|Volumen 12|Artículo 792746