Nuevos derivados de benzoquinona antienvejecimiento de Onosma Bracteatum Wall Parte 2

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2.3. Actividad antienvejecimiento en la cepa de levadura K6001

Las actividades antienvejecimiento de las benzoquinonas aisladas (1-5) se evaluaron mediante el uso de un sistema de bioensayo de vida útil replicativa de levadura K6001. El resveratrol (Res), una conocida sustancia antienvejecimiento, se utilizó como control positivo para comprobar la fiabilidad del sistema de bioensayo. La concentración más efectiva de Res fue de 10 μM en el sistema de bioensayo de vida útil replicativa de levadura, como se informó en nuestras publicaciones anteriores 【4-6】.hierba de cistancheComo se muestra en la Figura 4, la alomicrofilona (1) a 3 μM, la ehretiquinona (2) y la ehretiquinona C (4) a 1 y 3 μM, y la ehretiquinona D (5) a 1 μM, exhibieron un aumento significativo en la vida replicativa del cepa de levadura K6001, mientras que la ehretiquinona B (3) estaba inactiva. Este resultado indicó el potencial antienvejecimiento de las benzoquinonas (1, 2, 4 y 5) aisladas de O. bracteatum.

3. Discusión

En el contexto del envejecimiento global, la investigación y el desarrollo de medicamentos antienvejecimiento para mejorar la calidad de vida de las personas mayores y reducir la prevalencia de enfermedades relacionadas con la edad son de gran importancia.crecimiento del pene cistancheEste estudio informa sobre el aislamiento, la elucidación de la estructura, la actividad biológica y el breve estudio SAR de derivados de benzoquinona antienvejecimiento de O.bracteatum1.

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En este estudio, se aislaron dos derivados de benzoquinona conocidos (1 y 2) y tres nuevos (3-5) de una capa de acetato de etilo de muestras de O. bracteatum bajo la guía de un bioensayo de vida útil replicativa de levadura K6001. Las estructuras de las nuevas benzoquinonas (3-5) se aclararon mediante un extenso análisis espectroscópico. Las benzoquinonas conocidas, la alomicrofilona(1) y la ehretiquinona(2) se purificaron e identificaron comparando los datos espectroscópicos con los informados en la literatura [17-19]. Anteriormente, se informó que ambos compuestos tenían actividad antialérgica y antiinflamatoria, respectivamente [17,19]. Hasta donde sabemos, no se informó ningún estudio relacionado con el envejecimiento para estos compuestos. Estos compuestos aislados compartían el mismo esqueleto de benzoquinona y sus diferencias estaban en las modificaciones en las posiciones C-11 y C-11.

Cistanche puede antienvejecimiento

La evaluación de las actividades biológicas se realizó para el estudio de la relación estructura-actividad.beneficios de la salsa cistancheLos resultados en la Figura 4 indicaron que la alomicrofilona aislada (1), la ehretiquinona (2) y la CD de ehretiquinonas (4-5) prolongaron significativamente la vida replicativa de la levadura. Sin embargo, la ehretiquinona B (3) que poseía el mismo esqueleto de benzoquinona pero con diferentes modificaciones estaba inactiva. De acuerdo con el estudio de la relación estructura-actividad (SAR) dentro de estos compuestos aislados, concluimos que la presencia de grupos metilo y exometileno en C-9' es importante para la actividad antienvejecimiento como en la ehretiquinona (2) y la ehretiquinona C (4). La modificación como la hidroxilación del grupo C-11/metilo como en la ehretiquinona B (3) resultó en la pérdida de actividad. Además, una comparación de la ehretiquinona (2) y la ehretiquinona C(4) con mejor actividad que la de la alomicrofilona (1) y la ehretiquinona D (5) mostró que la presencia del grupo exometileno en C-9' jugó un papel importante papel en la actividad anti-envejecimiento de estas moléculas. La ehretiquinona C(4) mostró una mejor actividad antienvejecimiento que la del resveratrol porque el valor medio de vida útil de 4 a 1 uMis fue comparable con el resveratrol a 10 uM que mostró el mismo valor.dosis de cistanche tubulosa redditPor lo tanto, la ehretiquinona C(4) puede considerarse un compuesto líder prometedor, y su mecanismo de acción antienvejecimiento debe estudiarse más a fondo. Además, estos resultados también proporcionan información estructural importante para diseñar y sintetizar nuevos fármacos antienvejecimiento. Este estudio contribuirá a la prevención y tratamiento de enfermedades relacionadas con la edad. Los resultados también sugirieron que O.bracteatum enriquecido con ingredientes antienvejecimiento puede usarse como medicamento o como complemento alimenticio.

4. Materiales y Métodos

4.1.Generalidades

Se utilizó un polarímetro digital JASCO P{{0}} para las mediciones de rotación óptica. Se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) preparativa con un sistema equipado con bombas ELITE P-230 y un detector UV. Los espectros de masas de alta resolución (HR-ESI-TOF-MS) se obtuvieron con un sistema LC/MS TOF de masa precisa Agilent Technologies 6224A. Los espectros de RMN se observaron con un espectrómetro Bruker AVII-500 y los desplazamientos químicos de RMN en δ (ppm) se referenciaron a picos de disolvente de bc 77,0 y 6H7,26 para CDCl. La cromatografía en columna se realizó utilizando gel de sílice (200-300 mesh, Yantai Chemical Industry Research Institute, Yantai, China) o gel de sílice de fase inversa C18 (Octadecylsilyl, ODS) (Cosmosil 75C18-OPN, Nacalai Tesque, Kyoto, Japón).

4.2. Material vegetal

El material vegetal se compró en Mansehra, Khyber Pakhtunkhwa, Pakistán, y el Dr. Zafar Ulah Zafar, profesor asociado del Instituto de Biología Pura y Aplicada de la Universidad Bahauddin Zakariya, Multan, Pakistán, lo identificó como Onosma bracteatum Wall. El espécimen comprobante (20170220) de la planta se depositó en el Instituto de Materia Médica de la Universidad de Zhejiang.

4.3. Extracción1 y Aislamiento1

El material vegetal seco (1,5 kg) se molió hasta polvo y se extrajo con metanol (CH3OH) durante 3 días junto con agitación continua a temperatura ambiente. El extracto bruto obtenido (120 g) se repartió entre acetato de etilo (EtOAc) y agua (H,O). La muestra de la capa activa de acetato de etilo (30 g) se cromatografió en una columna abierta de gel de sílice. y eluido con n-hexano/CH,Cl(100:0,80:20, 50:50,0:100) y CH,Cl/CH3OH (98:2,95: 5,90:10 y 0:100). Se obtuvieron seis fracciones. La fracción 4 (8 g) que se eluyó con CH,Cl/CH3OH (95:5, 90:10) se procesó adicionalmente mediante una columna ODSopen. CH3OH/H,O(40:60,50:50,55:45,60:40,70:30,90:10 y 100:0) se usó como solvente. De las siete fracciones (Fr.{{46} }Fr.7) obtenidos, Fr.2-Fr.4, se separaron de la siguiente manera:

Fr.4 (500 mg) se separó mediante columna abierta de gel de sílice y se eluyó con CH2Cl2/CH3OH (100:0, 99:1,98:2,97:3,95:5 ,90:10 y 0:100). Se obtuvieron nueve muestras (Fr.4-1-Fr.4-9). La muestra Fr.4-3 se purificó adicionalmente por HPLC【C30- UG-5（φ10× 250 mm, Nomura Chemical）, fase móvil∶ acetonitrilo (CH3CN)/H2O(40:60), velocidad de flujo: 3 ml/min y detector: 210 nm] y compuesto producido (1) (65 mg, tR =21,2 min).

Fr.3 (113 mg) se separó usando una columna abierta de ODS y se eluyó con CH;OH/H2O(40:60, 45:55,50:50,55:45,60:40,80: 20 y 100:0). Se obtuvieron diez fracciones (Fr.3-1-Fr.3-10), y Fr.3-7 se purificó adicionalmente por HPLC【C30-UG{ {21}}（φ10×250 mm, Nomura Chemical）, fase móvil∶metanol (CH3OH)/HO(68:32), velocidad de flujo: 3 ml/min y detector: 210 nm] y produjo el compuesto (2) (20 mg, IR =20.3 min).

Fr.2(450 mg) se sometió a una columna abierta de gel de sílice y se eluyó con CH2Cl2:CH3OH (100:0, 99:1,98: 2,97:3,95:5,90:1{{105}},0:100).Nueve fracciones (Fr.2-1-Fr.{{20}}) y Fr.2-4(20 mg) se sometió a cromatografía en columna abierta de ODS con CH3OH/H2O(30:70, 32:68,35:65,40:60 y 100∶O）, y la quinta fracción （ 6,5 mg）fue purificado por HPLC 【C30-UG-5（φ10×250 mm, Nomura Chemical), fase móvil:acetonitrilo(CH3CN)/H,O(35:65), caudal: 3 ml/min y detector: 210 nm] para producir el compuesto (3)(3,5 mg, t=31,0). Fr.2-5(70 mg) fue separado por columna abierta de ODS usando CH3OH/H2O(25:75,27:73,30:70, 32:68,34:66,36:64,40:60 y 100:0) y la séptima fracción (11 mg) se purificó por HPLC 【C30-UG-5（φ10×250 mm, Nomura Chemical）, fase móvil∶acetonitrilo (CH,CN)/HO (32:68), caudal: 3 ml/min y detector: 210 nm] para producir el compuesto (4)(2,1 mg, tg=43,3).Fr.2-8(75 mg ) se separó por columna abierta de ODS usando CH3OH/H2O (20:80, 22:78.24:76.25:75.26:74,30:Z0.35:65.40:60 y 100:0) y la séptima fracción (10 mg) se purificó por HPLC 【C30-UG-5 (φ10×250 mm, Nomura Chemical), fase móvil∶ acetonitrilo (CH3CN)/H2O (30:70), velocidad de flujo: 3 ml/min y detector : 210 nml para producir el compuesto (5)(4,3 mg, tn=22,3). Alomicrofilona (1). polvo amarillo; [ ]6 más 0,02 (c 0,57, CHCl3); ESI-TOF-MS de alta resolución m/z 389,1359, calculado para C2H22O5Na （M más Na） más 389,1359; RMN 'H （500 MHz, CDCl3）∶bμ{{141 }}.83 (1H,dI=10.5Hz,H-5^),6.61(1H,d,J=8.6Hz,H-6), 6,56(1H,d, J=2,8 Hz,H-3),6,51(1H, dd, J=2,8, 8,6 Hz,H-5),6,51 (1H,d, J=10,5 Hz, H-6'),5,76(1H,d,J=15,9 Hz,H-8'),5,67 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7),5.65(1H,d,J=7.1Hz,H-8),3.77(1H, d,J=7.1Hz,H-7),2.73(1H,d, J=19.2Hz,Hb-10),2.50 (1H,d,J{ {206}}.2 Hz,Ha-10),1.69 (3H,s, H-11),1.22(6H,s, H-10'& H-11 ');13CNMR(125 MHz,CDCl3):6c=195.8(C-1'),193.1(C-4'),150.0(C-4), 145,0(C-1),143,3(C-8'),139,4(C-5'),138,6(C-6'),131,8(C{{245} }), 127,7 (C-2), 122,5 (C-8), 122,0 (C-7'), 117,6 (C-6), 114,9 (C{{260) }}),114,4(C-3),80,7(C-3'),71,0(C-9),54,9 (C-2'),39,1(C{ {275}}), 36.2(C-10),29.8(C-10'),29.8(C-11'),22.6(C-11).La estructura El re se identificó mediante la comparación de los espectros de MS, 'H RMN y 13C RMN, así como la rotación específica con la literatura [17,18]. Ehretiquinona (2). polvo rojo;[ ]16 más 1,01(c 0,12, CH3OH); ESI-TOF-MS de alta resolución m/z 371,1254, calculado para C2.H20OANa (M más Na) más 371,1252;1H RMN (500MHz, CDCl3)∶δμ=6,83 (1H,d,J{{ 312}}.5Hz,H-5'),6.62(1H,d, J=8.6Hz,H-6),6.58(1H,d,J=2 0,2 Hz,H-3),6,53(1H,m,H-5), 6,52(1H,d, J=10,5 Hz,H-6') ,6,25(1H,d,J=16,0Hz,H-8),5,65(1H,d,J=6,2Hz,H-8),5,50(1H ,d, J=16.0Hz,H-7),5,04(1H,s,Hb-10),4,97(1H,s,Ha-10'),3,83 (1H,d, J=6.2Hz,H-7),2.78(1H,d, I=19.1Hz,Hb-10),2.52(1H,d ,J=19,1 Hz,Ha-10),1,73(3H,s,H-11'),1,70(3H,s,H-11);13CNMR ( 125MHz,CDCl):6c=195.4(C-1),193.2(C-4),150.0(C-4),145.1(C-1 ),140,8(C-9),139,2(C-5),138,8 (C-6'),137,5(C-8'),131,9(C{{418 }}),127,7(C-2),124,1(C-7'),122,7(C-8),119,3(C-10'),117,6(C{ {433}}), 114,9 (C-5), 114,4 (C-3), 80,7 (C-3'), 55,3 (C-2'), 39,4 ( C-7),36.3(C-10),22.7(C-11),18.3(C-11).La estructura se identificó mediante comparación espectros de MS, 'H NMR y 13C NMR, así como rotación específica con la literatura [19].

Ehretiquinona B (3). Polvo rojo; [ |6 más 0.99(c 0.31, CH3OH); ESI-TOF-MS de alta resolución m/z 387,1208, calculado para C22H20OsNa (M más Na) más 387,1203; Los datos de 1H NMR y 13C NMR se describen en las Tablas 1 y 2 respectivamente.

Ehretiquinona C(4). polvo rojo; [ ] 16 más 0.37 (c 0.12, CH,OH); ESI-TOF-MS de alta resolución m/z 387,1174, calculado para C2H20O;Na (M más Na) más 387,1174; Los datos de 1H NMR y 13C NMR se describen en las Tablas 1 y 2 respectivamente.

Ehretiquinona D (5). polvo amarillo; [ l5 más 0.51(c 0.41, CHCl3); ESI-TOF-MS de alta resolución m/z 405,1300, calculado para C2,H,O,Na (M más Na) más 405,1300; Los datos para HNMR y 13CNMR se describen en las Tablas 1 y 2 respectivamente.

4.4. Ensayo de vida útil/

El método de bioensayo utilizado para el estudio antienvejecimiento se describió previamente [4]. La cepa de levadura K6001 se cultivó en un medio YPGalactosa o YPGlucosa. El medio YPGalactosa se preparó con un 3 por ciento de galactosa, un 2 por ciento de hipolipeptona y un 1 por ciento de extracto de levadura, mientras que el medio YPGlucosa contenía un 2 por ciento de glucosa en lugar de galactosa.cistanche แอ ม เว ย์Para preparar placas de agar, se añadió agar al 2 por ciento al medio. Para evaluar las muestras a través del bioensayo, la cepa de levadura K6001 se inoculó e incubó durante 24 h en el medio de levadura peptona galactosa junto con agitación. Después de 24 h, se centrifugó el medio que contenía la cepa de levadura. Los gránulos de levadura resultantes se lavaron con solución tampón de fosfato (PBS) tres veces y se diluyeron. Después de la dilución, las células se calcularon con un hemocitómetro y alrededor de 4000 células se inocularon en placas de agar que contenían muestras con varias concentraciones. Luego, las placas se colocaron en una incubadora a 28 grados durante 2 días. Las células de levadura en la placa de agar se observaron bajo un microscopio después de 48 h. Se seleccionó aleatoriamente un total de 40 microcolonias de cada placa y se contó y analizó el número de células hijas.

4.5. Análisis estadístico

Las diferencias significativas entre los grupos se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Se utilizó el software GraphPad Prism 5.0. valor ap de<0.05 was="" considered="" statistically="">

5. Conclusiones

Se aislaron y caracterizaron tres benzoquinonas nuevas y dos conocidas de O. bracteatum bajo la guía del ensayo de vida útil replicativa de levadura K6001. La estructura de las nuevas benzoquinonas (3-5) se elucidó mediante análisis espectroscópico, y las conocidas (1-2) se identificaron comparando los datos espectroscópicos con los de la literatura. Se evaluó la actividad antienvejecimiento de todas las benzoquinonas aisladas mediante un ensayo de vida útil replicativa de la levadura y 1,2,4 y 5 exhibieron una actividad antienvejecimiento significativa.cuanta cistanche tomarLa ehretiquinona C(4) mostró la actividad antienvejecimiento más prometedora y, por lo tanto, puede considerarse un compuesto principal potencial. Su mecanismo antienvejecimiento debe estudiarse más a fondo.

Materiales complementarios:Los espectros de RMN 1D y 2D están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1420-3049/24/7/1428/s1.

Contribuciones de autor:UF realizó el estudio químico y redactó el manuscrito. YP realizó los ensayos de vida útil replicativa. DDparticipó en la identificación de compuestos. JQdiseñó y supervisó este estudio y revisó el manuscrito.

Fondos:Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de I + D de China [No. 2017YFE0117200] y NSFC [Grant Nos. 21661140001, 21877098 y 21572204].

Expresiones de gratitud:Agradecemos a Michael Breitenbach de la Universidad de Salzburgo, Austria, por el obsequio de la cepa de levadura S. cerevisiae K6001. UF también reconoce el apoyo para estudios de doctorado de la Comisión de Educación Superior de Pakistán.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Este artículo está extraído de Molecules 2019, 24, 1428; doi:10.3390/molecules24071428 www.mdpi.com/journal/molecules