Evaluación del transporte intestinal de un extracto rico en glucósido feniletanoide de Cistanche Deserticola a través del modelo de monocapa de células Caco-2

Introducción

La línea celular Caco-2, que se deriva de adenocarcinomas de colon humanos, presenta características similares a las de los enterocitos. En condiciones normales, las células Caco-2 se diferencian espontáneamente de las células maduras y forman monocapas intactas. Las células adyacentes se adhieren a través de uniones estrechas formadas en el lado apical de la monocapa, que pueden discriminar pasivamentey transporta activamente fármacos a través de la capa epitelial. Debido a la similitud morfológica y bioquímica con los enterocitos normales, las monocapas de células Caco-2 sirven como un modelo in vitro bien aceptado para el estudio del potencial de absorción intestinal y las características de transporte de fármacos.

A diferencia de los productos químicos, los extractos de plantas (PE) son mezclas cuya actividad biológica y principios activos a menudo no están bien identificados. Además, las propiedades de transporte intestinal del PE, a diferencia de las propiedades de sus constituyentes, están estrechamente relacionadas con el uso clínico. Las mediciones de flujo para una muestra de prueba a través de una monocapa de células Caco-2 comúnmente implican métodos químicos, como HPLC, LC/MS, etc. Aunque estos métodos son herramientas poderosas, son complejos, requieren mucho tiempo, son costosos y, en ocasiones, requieren equipos sofisticados. Más importante aún, ni un componente individual ni uno minoritario pueden reflejar la PE en su conjunto. Por lo tanto, es necesario establecer un enfoque novedoso independiente de la determinación de los componentes para identificar y evaluar las características de transporte del PE.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), una planta holoparásita, es una medicina tradicional china común que se utiliza principalmente para tratar la deficiencia renal, la debilidad corporal y el estreñimiento, y estos usos se han registrado oficialmente en la Farmacopea China.Glucósidos feniletanoides (PhG), incluidos el equinacósido (EC), el acteósido (AC) y el isoactósido (IS), etc., son una clase de compuestos polifenólicos. Se consideran uno de los principales componentes bioactivos de las especies de Cistanche. Los estudios farmacológicos han demostrado que la bioactividad de los PhG es diversa e incluye efectos antioxidantes, antifatiga, hepatoprotectores, inmunomoduladores, antiinflamatorios y neuroprotectores. Sin embargo, no se han investigado las características del transporte intestinal de los PhG. En este estudio, exploramos la permeabilidad intestinal de un extracto rico en PhG (PRE) de CD como un sistema integrado y la permeabilidad de tres PhG principales (AC, IS y EC) en células Caco-2 diferenciadas. Nuestros resultados indicaron que el PRE se transporta principalmente a través de difusión pasiva poco absorbida a lo largo de un gradiente de concentración sin eflujo, lo que proporciona la base farmacocinética para la aplicación clínica de los PhG en la EC.

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Materiales y métodos

Materiales

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>El 98%) se compró a Must Biotechnology Co. (Chengdu, China). Gibco BRL (Grand Island, NY, EE. UU.) produjo medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS) y aminoácidos no esenciales (NEAA). Las placas 6-well TranswellTM (insertar área de crecimiento de la membrana 4,67 cm2) se obtuvieron de Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, EE. UU.). El colágeno de cola de rata se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los reactivos y productos químicos para el análisis de HPLC eran de calidad analítica.

Preparación de PRE a partir de CD

El material de CD secado al aire se pulverizó y se extrajo mediante percolación con etanol al 70%. La fracción rica en PhG se preparó como se describió anteriormente y se extrajo con alcohol n-butílico saturado con agua. El licor de extracto se concentró y se secó a presión reducida. La espectrofotometría UV de resina macroporosa midió un contenido de PhG del 78,4%. La muestra final representó un rendimiento de 1,75% de materia prima en peso seco. La muestra obtenida se almacenó a -20 grados hasta su uso posterior.

Determinación de AC, IS y EC por HPLC

Se utilizó un sistema HPLC Shimadzu equipado con software de solución LC para analizar los contenidos de AC, IS y EC en PRE. Se utilizó una columna Intersil C18 de fase inversa (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) y se mantuvo a temperatura ambiente. Las fases móviles fueron acetonitrilo y agua que contenía 0.1% de ácido fosfórico (v/v) con elución en gradiente (Tabla 1) a un caudal de 1,0 ml/min. El detector del espectrofotómetro UV se ajustó a 334 nm. Para determinar con precisión el flujo de AC e IS, desarrollamos un nuevo método de detección de fluorescencia por HPLC (HPLC-FLD). Después de un análisis estructural y un escaneo de longitud de onda de fluorescencia (datos no mostrados), obtuvimos las condiciones óptimas de detección de fluorescencia para AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) e IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm).

El método analítico de HPLC se validó utilizando las siguientes características de rendimiento: estabilidad, linealidad, sensibilidad, precisión (variabilidad intra e interdía) y exactitud. Los analitos en el tampón de transporte se almacenaron a 25 grados en la oscuridad durante 24 h y se midió su estabilidad. Los analitos fueron muy estables en presencia de vitamina C (0.4%) porque los valores de desviación estándar relativa (RSD) en las áreas de los picos fueron <3,5%. La ecuación de regresión lineal, el coeficiente de correlación, el rango de linealidad, el LOD y el LOQ para AC, IS y EC se muestran en la Tabla 2. Los LOD (18–30 nM) y LOQ (60–100 nM) Los valores ilustran que los métodos HPLC-FLD y HPLC-UV son muy sensibles. Los valores de RSD que expresan la precisión del método fueron todos <2% para la variabilidad intra e interdía, lo que indica una buena precisión. Para la evaluación de la recuperación, se agregaron AC, IS y EC al tampón de transporte para producir tres niveles de concentración (alto, medio y bajo). Los valores de recuperación del método para los analitos se resumen en la Tabla 3. Las recuperaciones promedio oscilaron entre 90,0% y 96,4%, lo que indica una buena precisión. En conclusión, los métodos de HPLC establecidos son satisfactorios en cuanto a linealidad, sensibilidad, precisión y exactitud para la cuantificación de AC, IS y EC en el tampón de transporte.

Determinación de PRE mediante sistema de bioensayo.

El bioensayo (capacidad antioxidante total) se basó en el ensayo FRAP (poder antioxidante/reductor férrico) que describimos anteriormente [16] y validamos en términos de linealidad y precisión (variabilidad intra e interdía). La linealidad del método de bioensayo se determinó basándose en las curvas de calibración. El rango de concentración de linealidad fue 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). La precisión del método de bioensayo establecido se determinó en términos de la variabilidad intra e interdía para un análisis de PRE (10,0 ug/ml). La repetibilidad intradiaria del método se determinó basándose en cinco determinaciones consecutivas en el mismo día. La repetibilidad entre días se midió basándose en cinco determinaciones consecutivas en tres días diferentes. Los valores de RSD para la precisión del método fueron 1,014% y 4,72% para la variabilidad intra e interdía, respectivamente, lo que indica una buena precisión. Por tanto, el método de bioensayo establecido es satisfactorio en cuanto a linealidad, precisión y exactitud para la cuantificación de PRE en un tampón de transporte.

Cultivo de células

Se cultivaron células Caco{{0}} a 37 grados y 95% de humedad relativa en una atmósfera que contenía 5% de CO2 y un medio que consistía en DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamina, penicilina. (100 U/ml) y estreptomicina (100 ug/ml). El medio se cambió cada dos días durante el crecimiento y diferenciación celular. Las células se cultivaron en matraces de plástico de 75- cm2 y se recogieron cada 3 a 5 días con EDTA-tripsina al 0,05 %. Para los experimentos de transporte, las células se sembraron a una densidad de 1 x 105 células/cm2 en insertos Transwell recubiertos con colágeno. Aproximadamente 21 días después de la siembra, se utilizaron las monocapas para los experimentos de transporte. Su integridad se determinó midiendo la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) a través de las monocapas con un EVOM equipado con ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., EE. UU.). Los valores TEER de la monocapa de células Caco-2 debían superar los 500 O∙cm2.

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Experimentos de transporte

La monocapa se lavó con tampón de transporte (tampón P que contiene HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glucosa 10 mM, CaCl2 3 mM y NaCl 145 mM, pH 7,4) y luego se preincubó durante 20 minutos. a 37 grados. Después de retirar el tampón de transporte, se añadió tampón de transporte nuevo que contenía muestras de prueba a la cámara apical (AP) (1,5 ml) en estudios direccionales AP a basolateral (BL) o a la cámara BL (2,5 ml) en estudios direccionales BL a AP. Para los ensayos de AC, IS y EC utilizando HPLC, se extrajo una alícuota (300 ul) de cada cámara receptora en diferentes intervalos de tiempo (30, 60, 90 y 120 min). La cámara receptora se rellenó con el mismo volumen de tampón de transporte fresco precalentado (37 grados) después de cada muestreo. Las muestras recolectadas se almacenaron a -20 grados para su uso posterior. Para la determinación PRE mediante bioensayo, solo se tomaron las muestras a los 120 min. Debido a la inestabilidad de PRE, AC, IS y EC, se añadió 0,4 % (p/v) de vitamina C para estabilizar las muestras y determinar los contenidos de AC, IS y EC mediante HPLC, y las muestras para el bioensayo PRE se ensayado inmediatamente después de ser muestreado. Se calculó el valor del coeficiente de permeabilidad aparente (Papp o 'Papp) de cada muestra.

Análisis de los datos

Los valores de Papp en las direcciones AP BL o BLAP de AC, IS y EC se calcularon con base en la siguiente ecuación: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), donde Papp es el coeficiente de permeabilidad aparente (cm/s) determinado por HPLC. (4Q/4t) es la velocidad de aparición del compuesto de prueba (AC, IS o EC) en el lado del receptor (μmol/s); A es el área de superficie del inserto (cm2); C0 es la concentración inicial del compuesto de prueba en el lado donante (μmol/ml). Específicamente, se utilizó la unidad de masa "ug" en lugar de "μmol" cuando se calcularon los valores de 'Papp. Los datos se expresan como medias ± DE.

Resultados

Composición de AC, IS y EC en PRE de CD

Debido a que AC, IS y EC se consideran los principales bioactivosPhG de especies de Cistanche, analizamos su contenido en PRE mediante HPLC-UV. El cromatograma representativo se muestra en la Fig. 1. La identificación de estos constituyentes se basó en comparar los tiempos de retención y el espectro UV con los de estándares auténticos a una longitud de onda de 334 nm. Los contenidos de AC, IS y EC en el PRE fueron 26,60%, 1,84% y 32,83%, respectivamente. Así, estos tres compuestos suponen el 61,27% del PRE; además, los resultados anteriores indican que el contenido de PhG en PRE es del 78,4%. Por lo tanto, AC, IS y EC representan aproximadamente el 80% de los PhG en PRE.

Capacidades antioxidantes totales de PRE, AC, IS y EC

Estudios de laactividad antioxidante de los PhGSe han informado casos de CD, y AC, IS y EC representan aproximadamente el 80% de los PhG en PRE. Por lo tanto, las capacidades antioxidantes totales de PRE, AC, IS y EC se analizaron y expresaron utilizando los valores de FRAP (× 10–6 mmol). Como se muestra en la Fig. 2, cuando el valor de FRAP fue de 8 × 10–6 mmol, las concentraciones finales de PRE, AC, IS y EC fueron 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml y 4,89 ug. /ml, respectivamente, lo que indica que la capacidad antioxidante total de estas cuatro muestras se clasificó de la siguiente manera: AC > EC > PRE > IS. La bioactividad del PRE se atribuye a sus grupos de principios activos (AIG). Aproximadamente el 60% de PRE, AC y EC mostraron una actividad antioxidante total más fuerte que PRE e IS. Dado que el IS (1,84%) constituye una fracción muy pequeña del PRE, otros componentes, como el IS, débilmente antioxidante, también son claramente activos en el PRE. Sorprendentemente, la actividad antioxidante total difería casi 7- veces entre AC y su isómero IS, lo que indica que no solo el número de grupos hidroxilo fenólicos sino también la posición de los grupos hidroxilo fenólicos en la molécula afectaban el efecto antioxidante. .

Validación de las monocapas Caco-2

Para validar el sistema de monocapas de células Caco-2, se midieron los valores de Papp de propranolol (un marcador bien transportado) y amarillo de Lucifer (un marcador mal transportado) desde AP hasta BL a través de las monocapas de Caco-2. determinado como 1,51 × 10–5 cm/s y 2,8 × 10–7 cm/s, respectivamente, y estos valores coincidieron con los publicados en informes anteriores. El ensayo de actividad de la fosfatasa alcalina también confirmó que las monocapas de células Caco-2 eran cualitativamente comparables al epitelio del intestino delgado.

La permeabilidad de AC, IS y EC.

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), mientras que los de los fármacos de mala absorción fueron bajos (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

La permeabilidad del PRE

Los resultados anteriores indican que la capacidad antioxidante total del PRE se debe al menos al 61,27% del AIG del PRE. Por lo tanto, evaluamos el TR de PRE en función de su curva concentración-efecto de capacidad antioxidante total y calculamos los valores de 'Papp para reflejar las características de transporte de PRE. Los valores 'Papp de PRE para AP!BL y BL!AP fueron (2,16 ± 0.26) × 10–7 cm/s y (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectivamente, lo que indica que este compuesto era poco permeable. Además, el flujo de salida o el transporte activo no fueron evidentes porque la proporción de 'Papp BL a AP/'Papp AP a BL para PRE fue 1,45. Además, la TR bidireccional de PRE aumentó linealmente entre aproximadamente 300 y 900 ug/ml (Fig. 5). La falta de preferencia direccional de los resultados sugiere que la difusión pasiva es el principal mecanismo de transporte del PRE.

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Discusión

En comparación con los medicamentos altamente purificados, el PE suele ser mezclas que constan de cientos de componentes con propiedades fisicoquímicas muy diferentes. Por lo tanto, el PE ejerce una acción sinérgica sistemática, multiobjetivo y multicanal debido a su complejo AIG [21], lo que dificulta el análisis de las características de transporte del PE. Para evaluar las propiedades de transporte del PE de manera más científica, algunos investigadores han identificado múltiples componentes, en lugar de un solo componente, en el PE [22-24]. Sin embargo, un número limitado de electores no puede reflejar el PE en su conjunto. Sin embargo, es imposible determinar todos los componentes del PE. Además, si diversos componentes del PE muestran características de transporte completamente diferentes, será difícil identificar las características de transporte holísticas del PE.

En la década de 1990, se utilizaron sistemas de bioensayo para evaluar la TR de agentes antimicrobianos [25]. En 2005, Eguchi y sus colegas [26] habían evaluado la actividad antioxidante del extracto de zanahoria utilizando medios BL de células Caco-2 diferenciadas; este enfoque es más apropiado para reflejar situaciones in vivo.

Según un informe anterior sobre la actividad de los PhG y nuestros resultados (Fig. 2), el TR de AIG en PRE se puede evaluar determinando la capacidad antioxidante total del medio en la cámara receptora. Después de los experimentos de transporte, encontramos que el TR de PRE era similar en ambas direcciones, y este transporte era insaturado y pobremente absorbido ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), y no indican flujo de salida, lo que sugiere que la difusión pasiva a favor de un gradiente de concentración es el principal mecanismo de transporte de PRE (Fig. 5). Además, las características de transporte de PRE son consistentes con las de AC, IS y EC, los componentes efectivos que muestran actividad antioxidante en PRE (Fig. 4 y Tabla 4). Este resultado era esperado e indicó que el presente sistema de bioensayo es apropiado y confiable para la evaluación de las características de transporte de AIG en PRE en células Caco-2 diferenciadas.

En contraste con el valor de Papp canónico, que se usa comúnmente para reflejar el transporte de un solo compuesto, el valor de Papp obtenido del TR basado en la curva de concentración-efecto puede no solo reflejar los componentes que penetran en monocapas con una estructura intacta, sino también También involucran otros factores relacionados con la actividad objetivo, como los metabolitos de los componentes, productos químicamente degradados e incluso algunas citoquinas secretadas por las células Caco-2 en respuesta a una estimulación que puede afectar la bioactividad objetivo. Por lo tanto, el multifactor mencionado anteriormente, y no sólo los componentes intactos transportados, determina el valor 'Papp. Por lo tanto, 'Papp puede correlacionarse más fuertemente con situaciones in vivo que el valor canónico de Papp. En este estudio, aclaramos la naturaleza pasivamente difundida y poco absorbida del PRE en función de su valor 'Papp, y esta naturaleza puede estar relacionada con las dosis altas y el largo período de tratamiento clínico de la EC. Sin embargo, estos hallazgos proporcionarán una guía más sistemática para los médicos en la aplicación de la CD cuando solo se hayan identificado las características de transporte de la mayoría de las AIG en la CD, no solo las PhG.

Sin embargo, el elemento de bioactividad seleccionado debe ser lo suficientemente sensible como para ser detectado en el medio de la cámara receptora, lo que presenta un desafío para el establecimiento de un sistema de bioensayo para evaluar las características de transporte de PE. Además, la bioactividad también debería depender de tantos componentes como sea posible. En nuestro estudio, el ensayo de capacidad antioxidante total fue más apropiado que otros métodos (S1 Fig.). Pero aun así, nuestro ensayo sólo puede detectar la TR de PRE a los 120 min.

En conjunto, el presente estudio estableció un nuevo sistema de bioensayo para evaluar la permeabilidad intestinal de PRE en células Caco-2 diferenciadas. Los resultados obtenidos mostraron que una difusión pasiva poco absorbida a lo largo de un gradiente de concentración sin eflujo es el principal mecanismo de transporte de PRE (Fig. 5), que proporciona la base farmacocinética para la aplicación clínica de los PhG en la EC. Es factible el uso de un nuevo sistema de bioensayo para evaluar el TR y así calcular los valores de Papp para evaluar la propiedad de transporte intestinal de AIG en PE. Este enfoque también puede ser adecuado para otros PE dada la bioactividad adecuada.

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