Interferencia de glucósidos feniletanoides de Cistanche tubulosa con el ensayo MTT

1. Introducción

La planta parásitacistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobancháceasfamilia) está ampliamente distribuida en los países del norte de África, árabes y asiáticos [1]. Los tallos deC. tubulosayC. deserticolason importantes en la medicina tradicional china y se han utilizado para tratar la impotencia, la esterilidad, el lumbago y el estreñimiento debido a la inercia del colon [2]. Además, el extracto etanólico deC. tubulosaSe ha demostrado que tiene un efecto protector significativo contra la hipoxia cerebral en ratones [3].

Las células endoteliales desempeñan un papel crucial en la patogénesis de la hipertensión pulmonar hipóxica. La línea celular endotelial EA.hy926 es considerablemente similar a las células endoteliales primarias. Durante nuestro estudio del efecto antihipóxico del extracto etanólico de C. tubulosa en las células endoteliales EA.hy926, notamos que el 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){{7 }},5-el ensayo de bromuro de difeniltetrazolio (MTT), que se utiliza comúnmente para evaluar la viabilidad celular en estudios de citotoxicidad y actividad citostática, generó resultados contradictorios al mostrar una mayor viabilidad de las células EA.hy926 después del tratamiento.

La evaluación precisa de la viabilidad celular es esencial para identificar posibles efectos citotóxicos o citoprotectores de un agente medicinal. Por lo tanto, investigamos qué componentes presentes en el extracto etanólico de C. tubulosa pueden ser responsables de los resultados contradictorios observados con el ensayo MTT. Aislamos dos principalesglucósidos feniletanoides (PhG)del extracto etanólico de C. tubulosa,echinacósido (en adelante compuesto 1) y acteosido (en adelante compuesto 2). Determinamos su efecto sobre la viabilidad de las células EA.hy926 utilizando una variedad de métodos. Además, para aclarar aún más qué sustituyente de los compuestos 1 y 2 puede ser responsable de los resultados contradictorios, probamos sus agliconas, ácido cafeico (en adelante compuesto 3) y 3,4-dihidroxilfeniletanol (en adelante compuesto 4), en EA. .viabilidad celular hy926 utilizando los mismos métodos.

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2. Resultados y Discusión

2.1. Identificación de compuestos

Las estructuras de los dos compuestos aislados deExtracto etanólico de C. tubulosase identificaron mediante análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas (EM), como se muestra en la Figura 1. El compuesto 1 se identificó como equinacósido en comparación con la RMN (Tabla 1) y la EM (m/z 785 [M-H) previamente informadas. ]- ) datos [4]. Los espectros de RMN del compuesto 2 fueron muy similares a los del compuesto 1, excepto por la ausencia de un grupo -D-glucopiranosilo (Tabla 1). El compuesto 2 (m/z 623 [M-H]-) se identificó comoacteosido[5]. Es importante destacar que ambos compuestos tienen la misma aglicona, que incluye ácido cafeico (compuesto 3) y 3,4-dihidroxilfeniletanol (compuesto 4).

2.2. Ensayos de viabilidad celular

Se utilizaron ensayos MTT y CCK{{0}} para analizar el efecto de los compuestos 1 a 4 sobre la viabilidad de las células EA.hy926. El ensayo MTT mostró que la viabilidad de las células EA.hy926 aumentó significativamente después del tratamiento con 25 y 50 μM de los compuestos 1, 2 o 3 (166,3 % y 174,1 % para el compuesto 1, 205,8 % y 224,3 % para el compuesto 2, y 164,8% y 189,6% para el compuesto 3, respectivamente; p <0,05) en comparación con las células de control (Figura 2A). Además, la inspección morfológica de las células determinó que el tratamiento con 50 μM del compuesto 1, 2 o 3 aumentó la formación de cristales de formazán de color púrpura, que son una indicación directa de la proporción de células vivas (Figura 3). Por el contrario, el ensayo CCK-8 sugirió que la viabilidad celular disminuyó significativamente después del tratamiento con 12,5, 25 y 50 µM del compuesto 1, 2 o 3 (75,5 %, 45,1 % y 43,7 % para el compuesto 1, 85,5 %. 51,8% y 34,3% para el compuesto 2, y 64,5%, 48,2% y 36,4% para el compuesto 3, respectivamente, p <0,05), en comparación con las células de control (Figura 2B). El compuesto 4 no afectó la viabilidad celular ni en el ensayo MTT ni en CCK-8. La discrepancia entre los resultados obtenidos con los dos ensayos sugiere que uno de los dos ensayos puede no reflejar con precisión los efectos de los compuestos 1 y 2 sobre la viabilidad de las células EA.hy926.

2.3. Evaluación de la apoptosis por Hoechst

Tinción Hoechst 33342 es una tinción de ADN permeable a las células que se excita con luz ultravioleta y emite fluorescencia azul de 460 a 490 nm. La cromatina condensada de las células apoptóticas se tiñe más intensamente que la cromatina de las células normales [6]. Mientras que las células de control exhibieron cromatina uniformemente dispersa, orgánulos normales y membranas celulares intactas, las células incubadas con compuestos 1, 2 o 3 50 μM durante 48 h mostraron la tinción típica de las células apoptóticas (Figura 4A). Por el contrario, la exposición de las células a 50 μM del compuesto 4 no aumentó el número de núcleos apoptóticos en comparación con el tratamiento de control.

2.4. Análisis de citometría de flujo de células apoptóticas

El ensayo de doble tinción con anexina V-FITC/PI identifica células apoptóticas mediante la unión de alta afinidad de la anexina V-FITC a la fosfatidilserina, que se externaliza en las células que experimentan apoptosis [7]. En este ensayo, las células viables no se unen ni a la anexina V ni a PI y, por lo tanto, no se tiñen (cuadrante inferior izquierdo), las células apoptóticas tempranas se tiñen de verde mediante la unión de la anexina V-FITC (cuadrante inferior derecho) y las células apoptóticas tardías se tiñen de verde y rojo por la unión de la anexina V-FITC a la fosfatidilserina y del PI a las células necróticas, respectivamente (cuadrante superior derecho). Como se muestra en la Figura 4B, las células incubadas con 50 μM de los compuestos 1, 2 o 3 durante 48 h, el porcentaje de células apoptóticas aumentó del 3,74% (células de control) al 10,32%, 12,95% y 11,30%, respectivamente. En comparación con las células de control, el compuesto 4 no aumentó el porcentaje de células EA.hy926 apoptóticas.

De acuerdo con los resultados obtenidos con el ensayo CCK-8 y mediante la tinción Hoechst 33342, el ensayo de citometría de flujo mostró que los compuestos 1, 2 y 3 indujeron apoptosis en células EA.hy926. En conjunto, estas observaciones sugieren que el aumento en la viabilidad de las células EA.hy926 observado con el ensayo MTT después del tratamiento con los compuestos 1 a 3 representó un resultado falso positivo.

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2.5. Discusión

En 1983, Mosmann desarrolló un ensayo colorimétrico en microplacas MTT para medir la proliferación celular y la citotoxicidad [8]. Este sencillo ensayo y sus modificaciones se utilizan ahora ampliamente en laboratorios de biología celular de todo el mundo. Los estudios de fraccionamiento en células de mamíferos indicaron que el cofactor de nucleótidos de piridina reducido, NADH, es responsable de la mayor parte de la reducción de MTT. Esto fue respaldado por estudios que utilizaron células enteras [9]. Por lo tanto, la reducción de MTT se asocia con células metabólicamente activas y no sólo está acoplada con la respiración mitocondrial sino también con el citoplasma y las membranas no mitocondriales, incluido el compartimento endosoma/lisosoma y la membrana plasmática [10]. La carga positiva neta de la molécula de MTT es el factor principal para su absorción celular a través del potencial de membrana plasmática.

En particular, es posible que en ocasiones el ensayo MTT no refleje con precisión el efecto real que tiene un compuesto probado en células específicas. Sin embargo, no se han identificado las estructuras o grupos químicos que pueden causar resultados contradictorios en el ensayo MTT. Estudios recientes han demostrado que el ensayo MTT podría subestimar el efecto antiproliferativo del galato de (-)-epigalocatequina-3-, el polifenol más abundante en el té verde [11]. En estudios que utilizaron el ensayo MTT para detectar la quimiosensibilidad tumoral, los agentes quimioterapéuticos anticancerígenos, como epirrubicina, paclitaxel, docetaxel y mesilato de imatinib (Gleevec), mostraron una mayor viabilidad celular [12,13]. Además, varios estudios han informado que ciertos extractos de plantas y polifenoles activos redox podrían interferir con el ensayo de MTT, ya que reducen directamente la sal de tetrazolio de MTT en ausencia de células [14].

La necesidad de solubilizar los cristales de formazán de MTT antes del análisis espectrofotométrico en un lector de microplacas y la naturaleza inherente del punto final de la reacción limitan el uso del ensayo de MTT a ciertas aplicaciones. Esto llevó al desarrollo de análogos de tetrazolio en los que los restos de fenilo estaban decorados con grupos sulfonato cargados negativamente, como 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT), una sal interna cargada negativamente [15] y 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo) -5-(3-carboximetoxifenilo)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), una sal interna débilmente ácida estrechamente relacionada con el MTT [16] . Estas modificaciones dieron como resultado la producción de productos de formazán solubles en medio de cultivo que eliminaron el requisito de un paso de solubilización antes de la cuantificación. En consecuencia, a medida que el aumento de la carga negativa de estas moléculas reducía su capacidad para moverse a través de las membranas celulares [17], los aceptores intermedios de electrones (AIE), como el metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazina ({{25 }}metoxi PMS) eran necesarios para facilitar la reducción del colorante tetrazol o para mejorar la velocidad de reducción.

Más recientemente, se ha desarrollado una nueva generación de sales de tetrazolio solubles en agua de las cuales WST-1 es el prototipo [18]. WST-1, una sal interna disulfonada cargada negativamente que contiene un residuo de yodo, es más estable que XTT y MTS en presencia de 1-metoxi PMS, es obligatoria IEA. Esto llevó a la comercialización de WST-1/1-metoxi PMS como un práctico kit de proliferación celular con un solo reactivo. Se han desarrollado varias otras sales de tetrazolio de la serie WST, la más útil de las cuales quizás sea WST-8 [19]. WST-8 parece tener propiedades de reducción celular muy similares a las de WST-1 y se comercializa de forma independiente como ensayo CCK-8. WST-8 es impermeable a las células y, por lo tanto, se reduce extracelularmente, mediante el transporte de electrones desde el NADH intracelular a WST-8 a través de la membrana plasmática mediado por 1-metoxi PMS. Aunque tanto la reducción de MTT como de WST-8/1-metoxi PMS son impulsadas por NADH intracelular, la fuente de NADH parece diferir dentro de estos dos métodos. La reducción de WST-8/1-metoxi PMS depende más de la lanzadera malato/aspartato que vincula el ciclo del ácido tricarboxílico mitocondrial-NADH con el espacio extramitocondrial [20].

En experimentos preliminares, confirmamos que los compuestos 1, 2, 3 y 4 no podían reducir directamente la sal de tetrazolio MTT (no se muestra). En el presente estudio, la influencia directa de los propios compuestos con el reactivo se eliminó lavando cuidadosamente las microplacas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de agregar la solución MTT o CCK-8, como se indica en los protocolos del fabricante. Sin embargo, los resultados obtenidos utilizando los dos métodos aún eran contradictorios (Figura 2). Como se esperaba, la incubación de células con los compuestos 1, 2 y 3 aumentó la reducción de la sal de tetrazolio a formazán púrpura, en comparación con el grupo de control (Figura 3), lo que sugiere que la mera reducción de la sal de tetrazolio en presencia de un compuesto específico no es suficiente para juzgar la capacidad del compuesto para interferir con el ensayo MTT.

Para determinar si los compuestos 1, 2, 3 y 4 podrían inducir apoptosis en células EA.hy926, se evaluaron los cambios morfológicos celulares y la externalización de fosfatidilserina. De manera consistente con la disminución en la viabilidad celular observada con el ensayo CCK-8, los resultados de la tinción de Hoechst y el análisis de citometría de flujo usando anexina V-FITC/PI sugirieron que la inhibición del crecimiento observada después del tratamiento con los compuestos 1, 2 y 3 fue debido, al menos en parte, a la apoptosis de las células EA.hy926. Nuestros resultados también respaldaron la idea de que el grupo cafeilo presente en los compuestos 1 y 2 fue responsable de los resultados contradictorios obtenidos con el ensayo MTT.

De manera similar a nuestros hallazgos, Rottlerin, un potente abridor de canales de potasio de gran conductancia, no mostró reactividad hacia MTT in vitro. Sin embargo, mejoró fuertemente la formación de cristales de formazán dentro de las células, un resultado que estaba en conflicto evidente con la inhibición de NF-κB por parte de Rottlerin y la proliferación celular observada mediante el análisis de la incorporación de [3 H]-timidina en el ADN [21]. El mecanismo por el cual Rottlerin mejoró la reducción de MTT se atribuyó a su efecto de desacoplamiento mitocondrial [22]. Rottlerin tiene un grupo sustituyente ácido cinamoílo. En comparación con el ácido cinamoílo, el compuesto 3 posee dos residuos hidroxilo adicionales, que se encuentran en C-3 y C-4. Por lo tanto, especulamos que el mecanismo por el cual los compuestos 1 y 2 causan resultados contradictorios en el ensayo MTT también puede estar asociado con sus efectos de desacoplamiento mitocondrial. Para probar esta hipótesis, se necesitan estudios comparativos entre los compuestos 1 y 2 y un desacoplador químico, como la trifluorocarbonilcianuro fenilhidrazona (FCCP).

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3. Sección Experimental

3.1. Reactivos y productos químicos

El compuesto 3 (ácido cafeico en polvo, pureza=98.6%) se adquirió de Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). El compuesto 4 (3,4-dihidroxilfeniletanol-aceite, pureza=98.5%) se obtuvo de Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). MTT y dimetilsulfóxido (DMSO) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El ensayo CCK-8 se adquirió en Dojin Laboratories (Kumamoto, Japón). Los kits de detección de apoptosis Hoechst 33342 y anexina V-FITC/PI se adquirieron en el Instituto de Biotecnología Beyotime (Haimen, China).

3.2. Material vegetal

C. tubulosaLos tallos se recolectaron de la prefectura de Yutian, Región Autónoma Uygur de Xinjiang, China. Las muestras de vales se depositaron en el Laboratorio Clave de Medicina de Gran Altitud de la Tercera Universidad Médica Militar (Chongqing, China) y fueron autenticadas por Yi Zhang de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Chengdu, China).

3.3. Extracción y aislamiento de material vegetal.

Los tallos de C. tubulosa (0.6 kg) secados al aire se pulverizaron y se extrajeron con etanol al 50% durante 2 h a 70 grados. Después de eliminar el disolvente a presión reducida, el extracto etanólico (212,5 g) se disolvió y se suspendió en agua (2 l) y se extrajo con n-butanol (2 l x 3). El extracto de n-butanol (110 g) se cromatografió en una columna de poliamida y se eluyó con etanol/agua (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) produciendo cinco fracciones (A-E). . La fracción B (65 g) se fraccionó en una columna ODS; elución con etanol: agua (1:9) y se separó el compuesto 1 (3 g). La fracción D (10,5 g) se fraccionó en una columna ODS; la elución con etanol/agua (1:4) separó el compuesto 2 (1 g).

Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance 600 en CD3OD con tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. Los espectros de masas se llevaron a cabo en un espectrómetro de masas BioTOF-Q.

3.4. Cultivo de células

Las líneas celulares EA.hy926 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE. UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino y 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina en un ambiente humidificado con 5% de CO2 a 37 grados.

3.5. Viabilidad celular

La viabilidad celular se evaluó mediante los ensayos MTT y CCK{{0}}. Los compuestos 1 y 2, y sus agliconas, ácido cafeico (3) y 3,4-dihidroxilfeniletanol (4) se disolvieron en DMSO hasta la concentración final de DMSO <0,1% (v/v) en medios de cultivo.

Se sembraron células EA.hy926 en placas 96-pocillos a 4 x 103 células/pocillo. Después de la incubación durante 24 h, las células se trataron con 6,25–50 μM del compuesto 1, 2, 3 o 4 durante 24 h. Se eliminó el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se agregaron alícuotas (10 µl) de solución madre de MTT (5 mg·mL-1) a cada pocillo que contenía 100 µl de medio y se incubaron con células durante 4 h. Después de la incubación, se eliminó el medio y se agregaron alícuotas de 150 µl de DMSO a cada pocillo para solubilizar los cristales de formazán. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, EE. UU.). La viabilidad celular se expresó como porcentaje de reducción de MTT, asignando el valor del 100% a la absorbancia de las células control. Todos los experimentos se realizaron tres veces y se presentaron como media ± desviación estándar (DE).

El ensayo CCK-8 se realizó siguiendo la literatura con ligeras modificaciones [23]. Específicamente, las células se trataron con compuestos 1, 2, 3 o 4 de 6,25 a 50 μM durante 24 h y se lavaron dos veces con PBS antes de agregar 10 μl de solución de CCK-8 y 100 μl de medio de cultivo. Después de incubar la microplaca a 37 grados durante 2 h, se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas. La viabilidad celular se expresó como el porcentaje de células viables con respecto a las células de control (100%). Todos los experimentos se realizaron tres veces y se expresaron como media ± DE.

3.6. Evaluación de la apoptosis mediante tinción Hoechst 33342

Se observaron cambios morfológicos apoptóticos mediante tinción con Hoechst 33342. Brevemente, se sembraron células EA.hy926 en placas 48-pocillos (2 x 104 células/pocillo) y se trataron con compuesto 1, 2, 3 o 4 50 μM durante 48 h a 37 grados, se lavaron dos veces con PBS. y se fijó con paraformaldehído al 4% (v/v) durante 15 min a temperatura ambiente. Después de enjuagar dos veces con PBS, las células se tiñeron con Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) durante 5 minutos a temperatura ambiente y se lavaron dos veces con PBS. Los núcleos teñidos con Hoechst se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón).

3.7. Análisis de apoptosis por citometría de flujo

Las células apoptóticas se detectaron mediante doble tinción con anexina V-FITC/PI y análisis de citometría de flujo. Brevemente, después del tratamiento con 50 μM del compuesto 1, 2, 3 o 4 durante 48 h, las células se recogieron y se resuspendieron en PBS a 1 x 105 células · ml-1. Después de la centrifugación a 500 x g durante 5 minutos a 25 grados, se agregaron 195 μl de tampón de unión de anexina V-FITC y 5 μl de anexina V-FITC. Después de mezclar suavemente con vórtice, la mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la centrifugación a 500 x g durante 5 minutos a 25 grados, se agregaron 190 µl de tampón de unión de anexina V conjugado con FITC y 10 µl de PI. Después de una suave mezcla con vórtice, las muestras se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA, EE. UU.) en 30 minutos.

3.8. Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se expresaron como media ± DE. La importancia de las diferencias entre las muestras experimentales y el control correspondiente se evaluó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando el software SPSS (versión 11.5). La significación estadística se fijó en p < 0.05.

4. Conclusiones

Nuestros resultados sugieren que una sobreestimación del número de células viables observadas en el ensayo MTT podría enmascarar la citotoxicidad de ciertos compuestos. Por lo tanto, durante los procesos de detección de fármacos, recomendamos utilizar una variedad de métodos para determinar el efecto del compuesto específico sobre la viabilidad celular (como los ensayos CCK-8 y 3 H-TdR) para evitar generar resultados engañosos.

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