Patrón de expresión de -tubulina, inversina y su diana despeinada-1 y morfología de los cilios primarios en el desarrollo y las enfermedades del riñón humano normal

edmund.chen@wecistanche.com

Resumen:La expresión espaciotemporal de las proteínas -tubulina, inversión y desordenado-1 (DVL-1) asociadas con la vía de señalización de Wnt y la morfología de los cilios primarios se analizaron en desarrolloriñones(semanas 14 a 38 de desarrollo), postnatal saludable (1.5- y 7-años) y humano con cambios patológicosriñones,incluyendo displasia multiquísticariñones(MCDK), glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS) y síndrome nefrótico de tipo finlandés (CNF). El análisis se realizó por inmunofluorescencia doble, microscopía electrónica, métodos semicuantitativos y estadísticos. Se observó coexpresión citoplasmática de -tubulina, inversión y DVL-1 en los túbulos contorneados proximales (pct), los túbulos contorneados distales (dct) y los glomérulos (g) de los tejidos analizados. Duranteriñóndesarrollo, la expresión global de -tubulina, inversión y DVL-1disminuyó, mientras que en el período posnatal aumentó ligeramente. Las expresiones más altas de -tubulina e inversión caracterizaron a dct yg, mientras que las altas DVL-1 caracterizaron a pct. -tubulina, inversión y patrones de expresión DVL-1 en MCDK, FSGS y CNFriñonesdifería significativamente del control sano. Comparado con saludableriñones, cambiado patológicamenteriñonesTenía cilios primarios dismórficos. Diferentes dinámicas de expresión de -tubulina, inversión y DVL-1 duranteriñónEl desarrollo podría indicar que el cambio entre la señalización Wnt canónica y no canónica es esencial para el normalriñónmorfogénesis. Por el contrario, su expresión alterada en los casos patológicosriñonespodría estar asociado con cilios primarios anormales, lo que lleva aenfermedades renales

Palabras clave:desarrollo del riñón humano; -tubulina; inversión; DVL-1; MCDK; GFS; CNF; riñón, renal

LA CITANCHE MEJORARÁ LA ENFERMEDAD RENAL/RENAL

Introducción 

El desarrollo de la definitiva o metanephricriñonescomienza durante la quinta semana gestacional (GW), que luego se diferencia continuamente para formar los riñones permanentes [1,2]. Las interacciones de señalización entre el mesénquima metanéfrico y la yema ureteral aseguran una adecuadariñóndesarrollo durante la nefrogénesis. Brevemente, la yema ureteral induce la transición de mesenquima a epitelio (MET) en el mesénquima metanéfrico, que se condensa y formarenalvesículas, seguidas por cuerpos en forma de coma y en forma de S, y finalmente conducen a la formación de glomérulos [3]. A cambio, el mesénquima induce una mayor ramificación de la yema ureteral. Los riñones metanéfricos se convierten en unidades excretoras funcionales en la semana 11 del desarrollo humano. Sin embargo, la nefrogénesis se completa dentro de la semana 34 a 36 del desarrollo fetal, cuando terminan múltiples eventos de ramificación, pero el proceso de diferenciación adicional de los riñones continúa en el período posnatal [4,5]. Las interrupciones de estas interacciones complejas dan como resultado diversas anomalías congénitas del riñón y del tracto urinario (CAKUT), que incluyen displasia, enfermedad renal poliquística, enfermedad displásica multiquísticaenfermedad del riñon(MCDK), lo que conduce a la crónicaenfermedad del riñon(ERC) [6].

En este estudio, nos enfocamos en la apariencia de los cilios primarios y la vía de señalización Wnt, que juega un papel importante durante la nefrogénesis normal y en elriñónproceso de reparación, después de agudo o crónicoenfermedad del riñon[7]. La existencia de cilios primarios durante la nefrogénesis y el gran número de problemas de desarrolloriñónLos defectos que ocurren en pacientes con enfermedad ciliar señalan que la función ciliar primaria genuina es necesaria para la normalidad.riñónorganogénesis [8,9]. El cilio primario es un orgánulo basado en microtúbulos importante para la homeostasis tisular, donde la -tubulina es el componente básico [10]. La pérdida de acetilación de -tubulina en células inmortalizadas desencadena la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT), lo que implica que la -tubulina acetilada es importante en la estabilización de los microtúbulos [11]. Durante el desarrollo humano, la vía Wnt primaria mediada por cilios permite la proliferación celular, la diferenciación y la morfogénesis tisular [12]. Un número significativo de niños con función de cilios primarios deteriorada y vía de señalización Wnt interrumpida desarrollan ERC, donde larenaltrastornos son responsables de casi la mitad de los casos [13]. La enfermedad quística congénita más frecuente en niños es la displásica multiquística.enfermedad del riñon(MCDK) [14]. Múltiples quistes que no se comunican [15] y carecen de normalrenalparénquima son hallazgos microscópicos característicos de MCDK. La glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS) es una de las enfermedades glomerulares más comunes que conducen a la etapa terminalenfermedad del riñon[dieciséis]. Al principio, la GFS se caracteriza por ser focal, involucrando solo una minoría de los glomérulos y segmentaria, involucrando cambios en solo un segmento del círculo glomerular [17]. El síndrome nefrótico congénito de tipo finlandés (CNF) es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva poco común.enfermedad del riñonrepresentado por un brote prenatal de pérdida extensa de proteínas [18], asociado con la cistogénesis de los túbulos proximales [19]. Muchas formas de enfermedades glomerulares primarias desarrollan proteinuria como resultado de la barrera de filtración glomerular dañada [20]. Una cantidad considerable de estudios implica que la lesión y la disfunción de los podocitos tienen funciones intrínsecas en la patogenia de la proteinuria de la ERC [21]. El estudio de Vukojevic et al. muestra un mayor número de podocitos ciliados y pobremente diferenciados en CNF [22]. Estudios previos indicaron que la vía de señalización Wnt/-catenina tiene un papel fundamental en la moderación de la disfunción podocitaria con proteinuria [23]. Hay dos vías principales de señalización de Wnt, una conocida como dependiente de -catenina canónica y otra no canónica, independiente de -catenina. durante el ratónriñóndesarrollo, la señalización Wnt canónica está activa en las puntas de las yemas ureterales y en los cuerpos en forma de S [24]. Además, Wnt a través de la señalización canónica tiene relevancia en el mantenimiento de MET durante la nefrogénesis [25]. Es decir, la unión del complejo proteico que contiene Dvl al receptor de membrana es obligatoria para la activación de la vía Wnt, mientras que la desactivación de los componentes clave de esta vía da como resultado una mortalidad perinatal temprana debido a la ausencia de la zona nefrógena en elriñón[25]. 

Se descubrió que una proteína crucial como interruptor molecular entre las vías de señalización de Wnt canónicas y no canónicas es la inversión [26]. Aunque se han detectado interacciones de varias proteínas con inversión, su función exacta aún no se ha aclarado por completo. En elrenalcélulas epiteliales, la inversión se localiza en los cilios primarios, actuando como una proteína ciliar [27]. Además, la inversión forma un complejo estable con tubulina en cultivos derenalcélulas, y se colocalizan in vivo [27,28]. La inversión parece desempeñar un papel esencial en la morfogénesis temprana del sistema pronéfrico y la determinación de la simetría izquierda-derecha durante el desarrollo [29,30]. Un evento significativo para las vías de señalización Wnt tanto canónicas como no canónicas en el reclutamiento de la Dvl citoplasmática en la membrana celular. Dado que los hallazgos anteriores mostraron que la inversión y Dvl se colocalizan en las células epiteliales renales, se puede especular que la inversión también podría tener un papel en la señalización no canónica. La desregulación de la señalización de Wnt mediada por la inversión desencadena una proliferación aberrante en los túbulos [31]. Las pruebas genéticas revelaron una mutación DVL-1 en pacientes con síndrome de Robinow autosómico dominante, presentando trastornos heterogéneos en algunos pacientes asociados con urogenital yrenalanomalías [32].

CITANCHE MEJORARÁ LA DIÁLISIS RENAL/RENAL

El patrón de expresión de desarrollo de -tubulina, inversión y DVL-1 se ha investigado en diferentes modelos animales. Por lo tanto, su expresión en pronefros de Xenopus laevis ha sido confirmada usando microscopía intravital [31], mientras que se encontraron en líneas celulares derivadas de células tubulares proximales murinas usando microscopía confocal y espectrometría de masas [33]. Además, la microscopía óptica y la inmunofluorescencia doble revelaron su presencia en secciones de ratones.riñones[34]. Los estudios en ratones knockout para inversión informaron quistes agrandados y difusos en elrenalmédula y corteza asociados con inversión del situs visceral [35]. En humanos, la mutación de inversión se presentó con nefronoptisis infantil que llevó a la interrupción del embarazo [36]. A pesar de numerosos estudios sobrerenal-tubulina, inversión y patrón y función de expresión de DVL-1, hasta donde sabemos, aún no se ha investigado un patrón de expresión de estas proteínas en el tejido humano postnatal y fetal humano y se ha llevado a una correlación. Además, no se ha informado evidencia que considere la expresión de inversión y DVL-1 en el desarrollo humano temprano. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo analizar el patrón de expresión espacial y temporal de -tubulina, inversión y DVL-1 durante las etapas fetal y posnatal de humanos sanos.riñones, así como enriñóntejidos de MCDK, FSGS y CNFriñonescon el fin de establecer un posible eslabón perdido entre estas entidades. Es decir, proponemos que los patrones de expresión alterados de las proteínas -tubulina, inversión y DVL-1 podrían ser el proceso de cistogénesis subyacente y una función anormal de los cilios primarios que conducen aenfermedades renales 

Resultados

El análisis del desarrollo y posnatalriñóntejidos se realizó en estructuras claramente diferenciadas de lariñón:túbulos contorneados proximales (pct), túbulos contorneados distales (dct) y glomérulos (g). Durante las etapas de desarrollo analizadas y en el postnatalriñóntejidos, -tubulina, inversión y DVL-1 mostraron patrones de expresión positivos pero con diferencias en intensidad, distribución y cantidad. El análisis de la patología.tejido renalde MCDK, FSGS y CNF se realizó en el recuento de imágenes completo de las células positivas en comparación con el control de tejido renal sano.

2.1. Microscopía óptica, microscopía electrónica e inmunohistoquímica (-tubulina) de tejido renal humano posnatal sano y con cambios patológicos

2.1.1. Luz renal postnatal saludable

microscopía del postnatalriñóntejido muestra bien definidoriñónestructuras, con una clara diferencia entre la médula y la corteza y la formación de pct, dct y g en la región cortical. La tinción inmunohistoquímica de -tubulina revela la presencia de un cilio primario en el centro de la superficie celular apical de cada célula tubular y en 0.018 por ciento ± 0,00014 por ciento SD en la superficie de las células glomerulares. La microscopía electrónica muestra la presencia de un solo cilio primario que surge del cuerpo basal en la superficie celular apical del túbulo (Figura 1a).

2.1.2. CNF

La mayoría de los g analizados son más pequeños y lobulados (80 por ciento), mientras que la minoría son de tamaño normal o hipertróficos (20 por ciento, n=100). Se encuentra esclerosis segmentaria o global de g, mientras que pct y dct están parcialmente dilatadas y recubiertas de epitelio atrófico. Ultraestructuralmente se observa pérdida de microvellosidades y disminución de la altura celular con multifragmentación de núcleos. En los podocitos, los procesos del pie se pierden de forma difusa. Los cilios primarios tubulares están desorganizados, particularmente en los quistes de los túbulos proximales, mostrando cambios en la longitud y posición citoplasmática (Figura 1b).

2.1.3. MCDK

En el tejido renal, se pueden encontrar células inmaduras y maduras esporádicas.Riñónel tejido está lleno de numerosos quistes ovales. Las células epiteliales columnares cubren los quistes y están rodeadas de tejido conectivo laxo. La tinción inmunohistoquímica para -tubulina muestra múltiples cilios primarios largos y desorganizados en la superficie de las células epiteliales (Figura 1c).

2.1.4. FSGS

En el 90 por ciento de g se encuentra esclerosis segmentaria extensa (n=100), asociada con fibrosis intersticial y signos de daño tubular. La disminución de la altura de las células epiteliales con pérdida de microvellosidades se encuentra en el microscopio electrónico, mientras que las células endoteliales y las regiones mesangiales tienen una ultraestructura regular. En el microscopio electrónico, se observa el cilio extremadamente largo y dislocado (descentralizado) en la superficie de la célula tubular distal (Figura 1e). Los podocitos muestran una pérdida difusa de los procesos del pie con un extenso tejido de microvellosidades. La tinción inmunohistoquímica para a-tubulina muestra múltiples cilios primarios largos y desorganizados en la superficie de las células epiteliales (Figura 1c).

2.2. Tinción inmunohistoquímica para 心tubulina, inversión y DVL-1- y análisis estadístico de riñones humanos posnatales sanos y en desarrollo

En las semanas 14, 15 y 16 de gestación, elriñónEl tejido se presenta con diferentes etapas de desarrollo de formación de nefronas: desde copas metanéfricas,renaletapas de vesículas para comandar nefronas en forma de S, formando así la zona nefrógena en la corteza externa (Figura 2). La diferenciación de pct, dct y g se puede observar en regiones corticales más cercanas a lariñónmédula. Durante el 22° GW, partes de la médula y la corteza se volvieron claramente distintivas, mientras que en el 38° GW,riñónlas estructuras aparecen como altamente diferenciadas, que contienen formas maduras de pct, dct y g

2.2.1. a-tubulina

Durante el desarrollo, la a-tubulina se expresa fuertemente en todos losriñónestructuras, visualizando principalmente la forma de cilios primarios en las superficies de las células epiteliales parietales de la cápsula de Bowman, g, pct y dct. Dentro deriñóntejido, 82-97 por ciento de las células pct expresan a-tubulina, mientras que en dct la expresión cae del 99 por ciento al 72 por ciento en la 38 GW (ver Figura 3, Tabla 1). Entre las diferentes etapas de desarrollo, la expresión más fuerte de a-tubulina se encuentra en el g de la 16 GWriñones, que contiene el 93 por ciento de las células positivas. las 14, 15 y 22 GW (ver Figura 3a,b, Tabla 1), alrededor del 70 por ciento de las células g expresan a-tubulina, mientras que la menor expresión se observa en la 38 GW (p < 0,01)="" con="" el="" 34="" por="" ciento="" de="" las="" células="" positivas="" (figura="" 3c).="" en="" el="">riñóntejido (1.5-años y 7-añosriñones), la inmunorreactividad más fuerte a la tubulina alfa se observa en la superficie celular apical de pct y dct (Figura 3d-f). La expresión de a-tubulina también está presente en el citoplasma perinuclear de la dct y las células epiteliales parietales de la cápsula de Bowman. la a-tubulina tiñe todorenalestructuras con una media de 50 por ciento de células positivas en pct, 94 por ciento en dct y 85 por ciento en g (Figura 3f). Dct se tiñe significativamente diferente de pct (p < 0,0001).="" todas="" las="" estructuras="" investigadas="" se="" tiñen="" con="" α-tubulina,="" con="" 77="" por="" ciento="" de="" células="" positivas="" en="" pct,="" 72="" por="" ciento="" en="" dct="" y="" 58="" por="" ciento="" en="" g="">

Figura 3. Tinción de inmunofluorescencia de -tubulina y DAPI en tejidos renales humanos posnatales y en desarrollo (a–e). Riñones de 14, 15/16, 38 GW (a–c);riñonesde 1.5- y 7-años de edad (d,e). La tinción positiva de -tubulina (flechas) se muestra en cada estructura de la corteza a través de las fases de desarrollo y posnatal (a–e), túbulos contorneados proximales (pct), túbulos contorneados distales (dct) y glomérulos (g). Los detalles de los cilios primarios en pct (d) y dct (a–c,e) se muestran como recuadros de mayor aumento (recuadro blanco). Ampliación ×40, barra de escala 100 µm. La distribución de células positivas para -tubulina por estructura a lo largo de diferentes etapas de desarrollo y en el período posnatal se muestra en el gráfico (f). El gráfico (g) (número total de células con proteína positiva en las estructuras observadas) muestra la expresión de proteína relacionada con el tiempo de desarrollo (regresión lineal) y la interrelación de -tubulina con DVL-1 a través del desarrollo y la maduración (ANOVA bidireccional seguido de prueba posthoc de SIDAK). Los datos se muestran como media ± SD.

La distribución de células positivas para -tubulina por estructura a lo largo de diferentes etapas de desarrollo y en el período posnatal se muestra en el gráfico (f). El gráfico (g) (número total de células con proteína positiva en las estructuras observadas) muestra la expresión de proteína relacionada con el tiempo de desarrollo (regresión lineal) y la interrelación de -tubulina con DVL-1 a través del desarrollo y la maduración (ANOVA de dos vías seguido de prueba post hoc de Sidak). Los datos se muestran como medias ± SD.

2.2.2. Tinción de inmunofluorescencia doble para inversión y tinción nuclear DVL-1 y DAPI en riñones posnatales sanos y en desarrollo Expresión de inversión en tejido renal posnatal y en desarrollo

En las SG 14, 15 y 16, la inversión muestra una expresión granular fuerte en g y una expresión granular leve en el citoplasma de pct y dct (Figura 4a,b), mientras que en las SG 22 y 38 (ver Figura 4c), la expresión granular fuerte se observa expresión positiva en g (Cuadro 1). Entre el 14 y el 22 GW, alrededor del 50 por ciento de las células expresan la versión. En la 16.ª GW, las células pct expresan inversión en el 73 % de las células, mientras que disminuyen hasta el 29 % de las células (p < 0,05)="" en="" la="" 38.ª="" gw="" (ver="" figura="" 4f).="" la="" expresión="" positiva="" de="" la="" inversión="" se="" encuentra="" en="" aproximadamente="" el="" 80-90="" por="" ciento="" de="" las="" células="" dct="" y="" g="" en="" el="">riñóntejidos de la 14.ª y 16.ª GW, con la expresión más baja en dct de la 38.ª GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" respectivamente)="" donde="" el="" 66="" %="" de="" las="" células="" fueron="" positivas.="" en="">riñones, pct se tiñe fuertemente en la membrana celular apical, mientras que dct se tiñe principalmente en la membrana celular basal y en el citoplasma perinuclear (Figura 4d,e). En esa etapa, encontramos expresión de inversión en todos los investigadosrenalestructuras, incluidas pct, dct y g, con una expresión media de células positivas del 92 por ciento para pct, 88 por ciento para dct y 90 por ciento para g (Figura 4f). No observamos una diferencia significativa en la intensidad de la señal de expresión de inversión entre estructuras. La expresión más alta de inversión se encuentra en g, con una media del 94 por ciento de células positivas (Figura 4f). Se encuentra una diferencia significativa al comparar la tinción de g (donde el 94 por ciento de las células se tiñen positivamente) con pct, donde el 58 por ciento de las células se tiñen positivamente (p <0.01) y="" con="" dct,="" donde="" el="" 49="" por="" ciento="" de="" las="" células="" se="" tiñen="" positivamente.="" positivo="" (p="">< 0,0001,="" figura="">

Expresión de DVL-1 en tejido renal posnatal y en desarrollo

Se observa una expresión de leve a fuerte de DVL{{0}} en el citoplasma de pct, dct y g en el período fetal (ver Figura 4a–c, Tabla 1). En pct, el 76–86 por ciento de las células expresan DVL-1 en la 14.ª–22.ª GW, mientras que en la 38.ª GW hay un 57 % de células positivas (Figura 4g). En el dct de 14th y 15th GW, 68–70 por ciento de las células expresan DVL-1, en 16th y 22nd GW, el número de células positivas cae a 42–5{{41} } por ciento, mientras que en la expresión GW 38 (p <0,001), se="" observa="" en="" el="" 19="" por="" ciento="" de="" las="" células="" dct.="" la="" expresión="" de="" dvl-1="" aumenta="" en="" g="" a="" lo="" largo="" de="" las="" etapas="" fetales:="" en="" el="" 14="" sg="" es="" del="" 6="" por="" ciento,="" mientras="" que="" en="" el="" 15,="" 16="" y="" 22="" sg="" aumenta="" al="" 10="" por="" ciento="" (p="">< 0,01).="" en="" los="" 38="" gw,="" el="" 14="" por="" ciento="" de="" las="" células="" g="" expresan="" dvl-1="" (figura="" 4="" g).="" en="" el="" período="" posnatal,="" la="" inmunorreactividad="" de="" dvl-1="" se="" dispersa="" en="" el="" citoplasma="" (tabla="" 1)="" tanto="" de="" pct="" como="" de="" dct="" (figura="" 4d,e).="" la="" señal="" se="" encuentra="" en="" todas="" las="" estructuras="" investigadas="" pero="" principalmente="" en="" el="" citoplasma="" perinuclear.="" la="" intensidad="" de="" la="" expresión="" de="" dvl-1="" es="" significativamente="" mayor="" en="" pct="" en="" comparación="" con="" dct="" y="" g="" (p="">< 0,01).="" del="" 39="" al="" 45="" por="" ciento="" de="" las="" células="" en="" pct="" y="" dct="" expresan="" dvl-1,="" mientras="" que="" en="" g,="" el="" 21="" por="" ciento="" de="" las="" células="" son="" positivas="" (figura="" 4="" g).="" no="" encontramos="" una="" diferencia="" significativa="" entre="" el="" porcentaje="" de="" células="" inmunorreactivas="" en="">renalestructuras El porcentaje de células inmunorreactivas DVL-1 es 34 por ciento en pct, 36 por ciento en dct y 27 por ciento en g, respectivamente (Figura 4g).

Figura 4. Tinción de inmunofluorescencia doble de inversión (verde), DVL-1 (rojo) y DAPI (azul) en los tejidos renales posnatales y en desarrollo (14th-38th GW, 1.5- and {{6 }}tejidos renales de años). La tinción positiva (flechas) se muestra en cada estructura a lo largo de todas las fases de desarrollo (a–c) y el período posnatal (d,e). Micrófonos fusionados junto con estructuras de interés en la corteza: túbulos contorneados proximales (pct), túbulos contorneados distales (dct) y glomérulos (g). La colocalización de inversión/DVL-1 (punta de flecha) se muestra en microfotografías fusionadas. Las tinciones de control negativo se muestran como recuadros en inversión y DVL-1 (a). Los eritrocitos pueden verse como células fuertemente teñidas cerca de dct. Los detalles se muestran como recuadros de mayor aumento. Ampliación ×40, barra de escala 100 µm. La distribución celular positiva dinámica de inversión y DVL-1 en las estructuras renales (pct, dct, g) a lo largo de las etapas de desarrollo y postnatales se muestra en los gráficos (f, g). El gráfico (h) muestra la expresión de proteínas (número total de células positivas en las estructuras) relacionada con el tiempo de desarrollo (regresión lineal) y la interrelación de inversión a DVL-1 a través del desarrollo y la maduración (ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Sidak ). Los datos se muestran como medias ± SD.

Se observa coexpresión de inversión y DVL-1 en el citoplasma del riñón g, dct y pct durante el desarrollo (consulte la Figura 4a-c, fusión). En el período posnatal, la coexpresión de inversión y DVL-1 caracteriza diferentes compartimentos celulares de células tubulares en pct y dct, mientras que la coexpresión en g se caracteriza por la fuerte prevalencia de expresión de inversión (consulte la Figura 4d, combine ). En los riñones posnatales 7-año, se observa coexpresión de inversión y DVL-1 en células tubulares de dct y pct, y en g donde la expresión de inversión prevalece ligeramente en comparación con DVL-1 (Figura 4e, fusión).

2.2.3. Diferencias en la expresión de tubulina, inversión y DVL-1 entre diferentes etapas de desarrollo renal y riñones posnatales

El número de células positivas para tubulina en porcentaje de tejido renal fetal fue significativamente mayor desde el punto de vista estadístico en comparación con el tejido renal de niños de 7-años de edad (13 (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15="" (p="">< 0.0001)="" y="" 16="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" de="" etapas="" fetales="" tempranas="" (13,="" 15,="" 16="" y="" 22="" gw)="" tenían="" más="" células="" positivas="" en="" comparación="" con="" el="" 38="" gw="" y="" el="" tejido="" renal="" de="" niños="" de="" 1.5-="" años="" (p="">< 0,0001,="" respectivamente,="" figura="" 3f).="" cuando="" se="" compararon="" diferentes="" etapas="" de="" desarrollo,="" encontramos="" niveles="" más="" bajos="" de="" expresión="" de="" inversión="" en="" el="" porcentaje="" de="" 13="" (p="">< 0,0001),="" 15="" (p="">< 0,00001),="" 22="" (p="">< 0,001)="" y="" 38="" (p="">< 0,0001)="" gw="" en="" comparación="" con="">renaltejido del niño de 1.5-año. En dct, se encontró una expresión menor de inversión estadísticamente significativa al comparar el tejido renal de la 16.ª GW con la de la 38.ª GW (p < 0.0001).="" además,="" se="" observó="" una="" menor="" expresión="" de="" inversión="" en="" dct="" en="" tejido="" renal="" de="" niños="" de="" 7-años="" de="" edad;="" comparando="" tejido="" renal="" de="" 13,="" 15="" (p="">< 0,001,="" ambos),="" 16="" y="" 1.5-años="" con="" tejido="" renal="" de="" 7-años="" (p="">< 0,00001,="" respectivamente,="" figura="" 4f).="" la="" señal="" observada="" de="" expresión="" de="" dvl-1="" a="" través="" de="" las="" diferentes="" etapas="" reveló="" que="" el="" porcentaje="" del="" 13="" (p="">< 0.01),="" 15,="" 16="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Relación entre las expresiones de -tubulina y la inversión a DVL-1 en tejido renal en desarrollo y posnatal

- Las expresiones de tubulina e inversión se compararon con la expresión de DVL-1 a lo largo de las etapas de desarrollo y en el tejido renal posnatal. -tubulina tuvo una expresión estadísticamente más alta en todas las etapas observadas, en comparación con la expresión de DVL-1 (p < 0.001,="" figura="" 3g).="" a="" través="" de="" todas="" las="" etapas="" observadas,="" la="" inversión="" tuvo="" una="" mayor="" expresión="" en="" comparación="" con="" dvl-1="" (p="">< 0.0001,="" figura="" 4="">

2.2.5. Comparación de tinción inmunohistoquímica con -tubulina, versión y DVL-1- y análisis estadístico de tejido renal con cambios patológicos (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulina La diferencia de la tinción de -tubulina en MCDK, FSGS y CNF fue estadísticamente significativa en comparación a tejido renal posnatal sano como grupo de control (p < 0.0001,="" respectivamente).="" los="" tejidos="" renales="" displásicos="" tenían="" una="" expresión="" significativamente="" mayor="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control,="" mientras="" que="" gefs="" y="" cnf="" mostraron="" una="" expresión="" significativamente="" menor="" de="" tubulina="" en="" comparación="" con="" el="" control="" sano="" (figura="">

inversión

La inversión se expresa en el citoplasma de células epiteliales desorganizadas y túbulos de MCDK (Figura 5a). En CNF, la expresión de inversión caracteriza g y dct, mientras que se muestra menos intensamente en quistes de pct (Figura 5b). En FSGS, la inversión se expresa fuertemente en g y dct pero menos intensamente en quistes de pct (Figura 5c). La expresión espacial de inversión mostró una tasa de tinción más alta y estadísticamente significativa en tejidos renales sanos (Figura 5g) en comparación con MCDK, FSGS y CNF (p <0.0001,>

Figura 5. Doble tinción de inmunofluorescencia de inversión (verde), DVL-1 (rojo) y DAPI (azul) en tejidos renales patológicos en MCDK (a), CNF (b) y FSGS (c): túbulos (t) , glomérulos (g), quiste pct (c), la altura de las células epiteliales pct (*). La estructura y la ubicación conjunta de celdas de inversión y DVL-1 (puntas de flecha) se muestran en las secciones fusionadas con detalles en recuadros de mayor aumento. Las tinciones de control negativo se muestran como recuadros en inversión y DVL-1 (a). Aumento ×40, barra de escala 10{{20}} µm. Relación de -tubulina (d) e inversión (e) con la expresión de DVL-1 en MCDK, FSGS y CNF (ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de SIDAK). La diferencia en la altura de las células epiteliales (f) de FSGS, CNF y MCDK pct en comparación con el control sano (ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey, n=50). La diferencia en el porcentaje general de células positivas de -tubulina, inversión y DVL-1 en MCDK, CNF y FSGS en comparación con el control sano (g–i), ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey). Los datos se muestran como medias ± SD. Las diferencias significativas se indican mediante el valor de p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" se="" expresa="" muy="" levemente="" solo="" en="" túbulos="" desorganizados="" de="" mcdk,="" mientras="" que="" en="" cnf,="" su="" expresión="" caracteriza="" a="" dct="" y="" g="" (figura="" 5a,b).="" en="" fsgs,="" dvl-1="" se="" observa="" como="" reactividad="" leve="" en="" g,="" dct="" y="" pct="" (figura="" 5c).="" los="" tejidos="" renales="" sanos="" teñidos="" con="" dvl-1="" mostraron="" una="" tasa="" de="" tinción="" significativamente="" mayor="" (figura="" 5="" h)="" en="" contraste="" con="" mcdk="" y="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" ambos),="" mientras="" que="" no="" se="" encontraron="" diferencias="" significativas="" para="">

2.2.6. Relación entre las expresiones de -tubulina y la inversión a DVL-1 en tejido renal con cambios patológicos (MCDK, CNF, FSGS)En MCDK, FSGS y CNF, la -tubulina se tiñe significativamente más que DVL-1 (p < 0.0001,="" respectivamente,="" figura="" 5d).="" la="" inversión="" se="" tiñó="" significativamente="" más="" alta="" en="" comparación="" con="" dvl-1="" en="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" y="" en="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" figura="">

2.2.7. Diferencias en la altura de las células epiteliales de los túbulos contorneados proximales entre el control sano y el tejido renal con cambios patológicos (MCDK, CNF, FSGS)Se comparó la altura de las células epiteliales pct (n {{0}} por grupo) entre células tubulares en tejidos renales sanos y tejidos renales con cambios patológicos (Figura 5b, c, f). La altura media de las células epiteliales en HC fue de 12,91 µm ± 1,847 µm y fue significativamente mayor en comparación con CNF y FSGS (p < 0,0001,="" respectivamente).="" la="" altura="" media="" de="" las="" celdas="" en="" cnf="" pct="" fue="" de="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" mientras="" que="" en="" fsgs="" fue="" de="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" las="" células="" epiteliales="" pct="" de="" mcdk="" no="" mostraron="" cambios="" significativos="" en="" la="" altura="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" en="" comparación="" con="">

2.2.8. Diferencias en la longitud de los cilios primarios entre el control sano y el tejido renal con cambios patológicos (MCDK, CNF, FSGS)

Se comparó la longitud del cilio primario (n= 50 por grupo) entre HC y tejidos renales con cambios patológicos (Figura 6c). Los tejidos renales sanos y MCDK se tiñeron con tubulina para asegurar la especificidad de la tinción del cilio de tubulina (Figura 6a, b). En tejidos renales sanos, el cilio primario fue de 5,065 µm ± 1,229 µm de largo, mientras que en MCDK, CNF y FSGS fueron significativamente más largos (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Discusión

El objetivo de nuestro estudio fue investigar una expresión inmunohistoquímica de atubulina, inversión y DVL-1 en fetosrenaltejido y tejido renal posnatal. Además, queríamos explorar si la expresión y el patrón de tinción de a-tubulina, inversión y DVL-1 se alteran en diferentes enfermedades renales en comparación con el control sano. Es decir, a pesar del gran interés de los otros investigadores sobre el papel de la tubulina alfa, la inversión y DVL-1 durante el desarrollo renal, la mayoría de los estudios anteriores han utilizado animales o modelos experimentales in vitro. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que ha mostrado la expresión y localización de a-tubulina junto con inversión y DVL-1 en riñones humanos fetales y posnatales, y que ha explorado la expresión de las proteínas mencionadas en riñones enfermedades, tales como MCDK, FSGS y CNF. También analizamos los cambios en la longitud y apariencia de los cilios mediante microscopía óptica y electrónica, ya que nuestro estudio anterior ya indicó que las alteraciones ciliares pueden estar asociadas con la cistogénesis en FSGF y CNF [19].

En la vía canónica de señalización de Wnt, la unión de los ligandos de Wnt a los receptores recluta a Dvl [37]. Los procesos de la MET y la vía de la polaridad de las células planas durante las primeras etapas de la morfogénesis renal están controlados por la señalización de Wnt. Al mediar en la vía Wnt, los cilios primarios controlan la proliferación celular, la diferenciación y la morfogénesis tisular [12] mediante la organización del citoesqueleto celular y la orientación celular, así como el alargamiento de la estructura tubular [2,38]. En nuestro estudio, -tubulina, inversión y DVL-1 estaban todos presentes en las estructuras renales, y todos colocados no solo durante el desarrollo del riñón fetal, sino también en el tejido renal del 1.5- y {{9 }}niños de años. Estos hallazgos están de acuerdo con la activación de la vía de señalización Wnt que se demostró que ya ocurre durante la tubulogénesis [39]. Además, nuestros resultados han revelado que la expresión de -tubulina e inversión están recíprocamente relacionadas con DVL-1 y que muestran una diferencia estadísticamente significativa entre sus patrones de expresión. Eso está en correlación con los modelos experimentales, ya que la mutación de la familia de proteínas Dvl completa en ratones da como resultado una falta de proceso de gastrulación, mientras que las mutaciones que no incluyen la familia de proteínas completa muestran defectos en la ubicación de los cilios nodales junto con defectos en los órganos [40]. . Hallazgos anteriores sugirieron que la inversión tiene un papel en la migración celular en Xenopus pronephros. Dado que ese segmento se correlaciona con el asa de Henle de los mamíferos y los túbulos distales, esto también podría indicar la importancia de la inversión durante el desarrollo renal en humanos [41]. De acuerdo con esa premisa, estudios previos revelaron que la mutación del gen de inversión podría resultar en nefronoptisis tipo 2, que está mediada por una expresión anormal de DVL-1 [42]. A pesar de que el papel del cilio primario es controvertido en la regulación de la vía de señalización de Wnt, encontramos que -tubulina se colocalizó con inversión y DVL-1 en las muestras de riñón analizadas. Además, estudios previos señalaron que el cilio primario junto con la inversión regula la degradación de Dvl al influir en la vía de señalización de Wnt [43]. En enfermedades renales humanas asociadas con el desarrollo de quistes, se han observado localización y función anormales de los cilios primarios [19]. De manera similar, el presente estudio también confirmó los cambios morfológicos de la formación de cilios primarios en condiciones patológicas como CNF, FSGS y MCDK. Hallazgos previos reconocieron que la sobreactivación de la vía Wnt canónica después del daño renal conduce a cambios estructurales irreversibles en el tejido renal [44]. Por el contrario, al cilio primario se le asignó el papel de cambiar de la vía Wnt canónica a la no canónica para ayudarrenalreparar. Además, se encontró que la sobreactivación de la vía Wnt canónica en el tejido renal trasplantado tiene un valor predictivo positivo hacia la fibrosis renal [45]. Si la vía Wnt canónica prevalece a expensas de la no canónica, apoya la teoría de la fibrosis renal como resultado. Nuestros hallazgos de expresión reducida de tubulina e inversión en CNF y FSGS implican inactividad de la vía Wnt no canónica, especialmente porque ambas condiciones tienden a conducir a la etapa finalenfermedad renal.Es decir, se cree que la localización y función normales del cilio primario podrían ser un factor para mantener una vía Wnt regular y, por lo tanto, un requisito previo para el desarrollo normal. Por el contrario, si se mejora la vía Wnt, puede dar lugar a una proliferación y diferenciación celular desreguladas que conducen a la carcinogénesis [46]. Como se describió anteriormente, la vía canónica de Wnt es obligatoria para el inicio de MET y la formación de la nefrona, mientras que su alteración podría conducir arenalhipoplasia [47]. Nuestros resultados respaldan esta idea al revelar la expresión más baja de DVL-1 con la expresión más alta de -tubulina en MCDK en comparación con el control sano. Estos resultados pueden implicar la menor activación de la vía canónica de Wnt, lo que podría ser una causa subyacente de la ausencia de formación de nefronas. Por el contrario, la expresión más alta de tubulina con la expresión más baja de DVL-1 podría explicar los hallazgos de múltiples quistes ya que no hay elongación organizada ni polarización celular guiada por la vía Wnt no canónica. Estudios previos también habían demostrado que la inversión inhibe la vía de señalización canónica de Wnt al dirigirse a Dvl para su degradación [26]. Se encontró que este paso en su interacción era necesario para inhibir la señalización Wnt canónica en el mantenimiento del alargamiento y posicionamiento tubular normal. La mutación de inversión da como resultado una regulación positiva de la señalización canónica de Wnt, que posteriormente provocó una proliferación anormal en las células tubulares. Se ha demostrado que este paso es crucial en la cistogénesis [42], mientras que la eliminación de la inversión en ratones conduce a la enfermedad renal poliquística [48]. Según la teoría derenalcistogénesis, la inversión se considera una "micoproteína", debido a su localización en los cilios primarios enrenalcélulas tubulares. En nuestro estudio, los cilios primarios estuvieron presentes en la superficie celular apical de las células tubulares en todas las etapas analizadas, mientras que durante las etapas fetales, la expresión de -tubulina fue más fuerte que en el período posnatal.

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Estudios previos han demostrado que la función de los cilios primarios puede verse afectada por la desregulación de la -tubulina durante el desarrollo, lo que puede provocar cistogénesis, desarrollo renal anormal y posible enfermedad renal crónica en la infancia [31,49]. Esto está de acuerdo con nuestros hallazgos de cilios primarios acortados y dismórficos observados en MCDK o con cilios múltiples y extremadamente alargados o dislocados encontrados en túbulos dilatados de CNF y FSGS en comparación con el control sano. Para respaldar el hecho de que las vías de señalización de Wnt canónicas y no canónicas, reguladas por los cilios primarios, se consideran obligatorias para el desarrollo renal normal, encontramos una tinción significativamente menor de inversión y DVL-1 en MCDK en comparación con el control sano [31,49]. Las diferentes dinámicas de patrones de expresión de -tubulina, inversión y DVL-1 a lo largo de diferentes fases de desarrollo renal pueden indicar un cambio entre la vía de señalización Wnt canónica y no canónica durante la morfogénesis renal normal. Sugerimos que su intercambio determina la transcripción en la vía canónica o el orden de migración y polarización celular durante el desarrollo renal en una vía de señalización no canónica. Su equilibrio y expresión en todas las estructuras renales investigadas implican su importante papel en el desarrollo renal normal. Durante el desarrollo normal del riñón (desde la 13.ª GW hasta la 38.ª GW), la expresión general de -tubulina, inversión y DVL-1 disminuye a medida que el tejido renal adquiere una morfología madura. En tejidos renales de 1.5- y 7-años, la -tubulina y la inversión mostraron un ligero aumento en la expresión, lo que respalda el hecho de que la vía Wnt no canónica permanece activa después del nacimiento. Por el contrario, DVL-1 persiste con un patrón de expresión disminuido, lo que podría contribuir a la conclusión de que la vía canónica de Wnt está silenciada en el tejido renal sano. Como resultado de condiciones renales patológicas, las células epiteliales del riñón pueden reaccionar con la reaparición de EMT y fibrosis [50] asociadas con la reactivación de la vía Wnt canónica [44]. Por lo tanto, las alteraciones de -tubulina, inversión y DVL-1 que se encuentran en los riñones enfermos podrían ser el mecanismo patológico subyacente y el resultado del cambio de la vía Wnt no canónica a la canónica en el riñón en desarrollo, aludiendo al cambio entre riñón reversible e irreversible. daño. Además, los cambios en su estado prenatal y posnatalrenalpatrón de expresión podría estar asociado con el deterioro de la función renal en la edad adulta, lo que lleva a enfermedades congénitas e insuficiencia renal crónica.

4. Materiales y Métodos

4.1. Muestras humanas

Se recolectaron muestras de tejido renal fetal después de la pérdida del embarazo en las semanas 14, 15, 16, 22 y 38 en el Departamento de Ginecología y Obstetricia del Centro Hospitalario Universitario de Split. Todo el material fetal adquirido fue examinado por un patólogo y solo se utilizaron para el estudio tejidos sin signos de anomalías, maceraciones o muerte intrauterina y con cariograma normal. Los registros médicos de las madres se examinaron antes de la recolección de muestras y, en caso de problemas de salud que pudieran influir en el resultado del embarazo, los tejidos renales se excluyeron del estudio. La madurez se determinó por el perímetro cefálico, el perímetro abdominal y la longitud del fémur [51] en correlación con los calendarios menstruales de las pacientes. Se recogieron muestras de tejido renal de 1.5- y 7-años de edad después de muertes accidentales. Las muestras se obtuvieron en el Departamento de Patología del Centro Hospitalario Universitario de Split. Las muestras de los tejidos renales displásicos multiquísticos (MCDK) se obtuvieron después de la pérdida del embarazo, la glomeruloesclerosis segmentaria focal (GSFS) y el síndrome nefrótico de tipo finlandés (CNF) se obtuvieron por nefrectomía. Todo el material adquirido fue examinado y evaluado por un patólogo, quien clasificó los diagnósticos. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Split (20 de mayo de 2016) de conformidad con la Declaración de Helsinki y sus actualizaciones (n.° de clasificación: 003-08/16-03/0001, nº de registro: 2181-198-03-04-16-0024, 20 de mayo de 2016) [52].

4.2. inmunohistoquímica

La fijación de la muestra de tejido recolectada se procesó con paraformaldehído al 4 por ciento en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 24 horas a 22 ◦C. Después de la deshidratación en etanol al 100 por ciento, las muestras se incluyeron en parafina, como se describió anteriormente [53]. Los especímenes se cortaron en secciones de 5 µm de espesor utilizando un micrótomo y posteriormente se montaron en portaobjetos de microscopio. Para verificar la conservación del tejido, cada décima sección se tiñó con hematoxilina y eosina [54]. La feminización y la inmunohistoquímica se realizaron como se describió previamente [2,55,56]. Después de enjuagar en PBS, los portaobjetos de microscopio se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios en una cámara húmeda a 22 ◦C (StainTray slide staining system; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los anticuerpos primarios utilizados fueron anticuerpo anti-alfa tubulina monoclonal de conejo (dilución 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anticuerpo anti-inversión policlonal de conejo (dilución 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Reino Unido), DVL monoclonal de ratón anticuerpo -1 (dilución 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) y anticuerpo policlonal de conejo anti-gamma tubulina (para verificar la tinción específica de cilios primarios con alfa- tubulina, dilución 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Después de enjuagar en PBS, se administraron anticuerpos secundarios durante una hora como se indica: burro anti-conejo IgG H&L, Alexa Fluor 488 (dilución 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y cabra anti-ratón IgG H&L, TRITC (dilución 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, Reino Unido) 4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI) se usó para teñir los núcleos y después de 2-min de incubación, los portaobjetos se lavaron en PBS y se cubrieron con medio de montaje y cubreobjetos. La tinción no específica se evitó mediante el uso de un bloque de proteínas (ab64226; Abcam, Cambridge, Reino Unido) antes de la aplicación del anticuerpo primario. Como control negativo, se realizó una prueba de preadsorción, mientras que la especificidad de los anticuerpos secundarios se comprobó omitiendo los anticuerpos primarios de los procedimientos de tinción.

4.3. Microscopio de electrones

Fijación deriñónLos tejidos se realizaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante 24 h, seguido de una fijación posterior en tetróxido de osmio al 1 por ciento durante 1 h. El proceso de deshidratación se realizó con series de etanol y finalizó con la incrustación en resina LX 112 [22]. Se tiñeron secciones delgadas de un micrómetro usando azul de toluidina y se estudiaron para seleccionar secciones ultrafinas. Se examinaron secciones ultrafinas con un grosor de 0,05 micrómetros después de teñirlas con acetato de uranilo y citrato de plomo. Para la obtención de las microfotografías se utilizó el microscopio JEOL 1200 EX.

4.4. Análisis genético

Como se describió anteriormente [19], utilizando leucocitos de sangre periférica, se extrajo el ADN genómico. Se encontró una mutación missense homocigota en el gen NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) lo que confirmó el diagnóstico de síndrome nefrótico congénito de tipo finlandés (CNF) [57].

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4.5. Análisis de los datos

El análisis de la sección se realizó en un microscopio de fluorescencia FL utilizando 3 canales de fluorescencia FL (Olympus BX51, Tokio, Japón). Las imágenes fueron capturadas por una cámara digital DP71 (Olympus, Tokio, Japón) con un aumento de alta potencia (x40). Solo elrenalLa corteza que contiene túbulos contorneados proximales (pct), túbulos contorneados distales (dct) y glomérulos (g) fueron de interés. Luego, las imágenes se procesaron con el software ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU., https://imagej.nih.gov/ij/ (consultado el 15 de octubre de 2018), 1997–2021. ) y Adobe Photoshop (Adobe Inc., San José, California, EE. UU.) para una evaluación adicional. Antes del recuento de células, se utilizó la herramienta ImageJ de canales divididos. Posteriormente, la foto microscópica de inmunofluorescencia original se restó por el canal rojo o verde (dependiendo de cuál era el canal original) utilizando la herramienta de calculadora de imágenes ImageJ para evitar la fuga de señal. Los valores por debajo del nivel umbral 50 se consideraron negativos. Contamos señales inmunorreactivas en células de al menos 20 estructuras (pct, dct o g) por etapa o número positivo general de células por microfotografía de displasia multiquística.riñóntejido, GEFS y CNF. Clasificamos las células como positivas si la señal de inmunofluorescencia se acumulaba en cualquier nivel de la membrana, el citoplasma o el núcleo por encima del valor 50 medido en el software ImageJ usando el comando de umbral. Las células negativas se clasificaron como células sin inmunorreactividad. Dos investigadores independientes analizaron los datos.

4.6. Análisis semicuantitativo

La intensidad de la señal de tinción de -tubulina, inversión y DVL-1 fue evaluada por dos investigadores independientes utilizando el software ImageJ. La intensidad general de la señal se midió después de configurar la imagen en el tipo 8-bit; luego, la intensidad de la tinción del marcador se evaluó en 20 pct, dct yg midiendo el área delineada de la estructura. Si los resultados entre evaluadores eran diferentes, un tercer investigador independiente aclaraba la duda. La intensidad de señal máxima para -tubulina fue de 84,125 ± 3,214 DE, para inversión fue de 71,50 ± 2,715 DE y para DVL-1 80,916 ± 1,875 DE. La saturación más alta del color de la señal en las fotografías del microscopio se marcó como 3 (66,66–99,99 % de la intensidad de la imagen de la señal general), seguida de 2 (33,33–66,66 %) para la intensidad intermedia de la señal y 1 (0,33 %–33,33 %) para baja intensidad de señal (Tabla 1.).

4.7. Análisis estadístico

Para la determinación de diferencias entre estadios y estructuras se realizó la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba post hoc de Dunn utilizando el software GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, EE. UU., www.graphpad.com (consultado el 15 de octubre de 2018.)). El número de células positivas se expresó en porcentaje como valor medio ± desviación estándar (DE), mientras que la significación estadística se reconoció en p < 0,05.="" el="" número="" de="" estructuras="" analizadas="" fue="" de="" 4200="" en="" 35="" muestras,="" con="" un="" número="" total="" de="" 135256="" células="" contadas.="" usamos="" 2-way="" anova="" con="" la="" prueba="" post="" hoc="" de="" sidak="" para="" probar="" las="" diferencias="" en="" la="" expresión="" de="" -tubulina,="" inversión="" y="" dvl-1="" en="" diferentes="" etapas="" de="" desarrollo.="" para="" estudiar="" la="" expresión="" de="" proteínas="" en="" relación="" con="" el="" tiempo="" de="" desarrollo,="" utilizamos="" la="" regresión="" lineal.="" se="" usó="" anova="" unidireccional="" seguido="" de="" la="" prueba="" post="" hoc="" de="" tukey="" para="" explorar="" las="" diferencias="" en="" la="" expresión="" de="" -tubulina,="" inversión="" y="" dvl-1="" en="" sujetos="">riñóntejido en comparación con los tejidos de MCDK, FSGS y CNF. Las diferencias en la expresión de proteínas entre MCDK, FSGS y CNF se investigaron con 2-way ANOVA seguido de la prueba post hoc de Sidak. Se usó ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey para evaluar las diferencias en la longitud de los cilios y la altura de las células epiteliales de pct entre el control sano y patológico.riñóntejidos Los datos se mostraron como valor medio ± desviación estándar (SD) con diferencia estadística reconocida en p <>