Propiedades beneficiosas para la salud del extracto de semilla de vid y su influencia en marcadores bioquímicos seleccionados en la sangre, el hígado y los riñones de Rattus Norvegicus
Mar 10, 2022
Resumen:El cadmio (Cd) es un metal pesado que se encuentra en todas las áreas del medio ambiente, incluida la cadena alimentaria. En el cuerpo, provoca estrés oxidativo al producir radicales libres que son dañinos para las células. El extracto de semilla de uva (GSE) contiene una amplia gama de componentes biológicamente activos que ayudan a neutralizar los efectos adversos de los radicales libres. En este estudio, se monitorearon los efectos del GSE preparado a partir del cultivar de vid semirresistente Season, que es rico en fenoles, en marcadores bioquímicos de ratas marrones expuestas a los efectos del cadmio. GSE aumentó la actividad antioxidante del plasma y, en elriñonesy el hígado, el contenido de Cd se redujo significativamente por la administración conjunta de GSE. En consecuencia, el aumento en el contenido de creatinina y la actividad de alanina aminotransferasa y la disminución de las actividades de catalasa y superóxido dismutasa causadas por el cadmio se ralentizaron con la administración conjunta de GSE. Los resultados de este trabajo revelan que el extracto de semilla de uva ofrece un efecto protector frente a la entrada de metales pesados en el organismo.
1. Introducción
El cadmio (Cd) es un metal pesado que se encuentra en todas las áreas del medio ambiente; forma parte de la corteza terrestre, está contenida en el agua, se acumula en las plantas y está presente en los organismos. Además de la cadena alimenticia (en términos de plantas, la mayoría de los cereales, tubérculos y vegetales son fuentes, mientras que entre los órganos animales, principalmente el hígado yriñonesson una fuente), una fuente importante de cadmio para los humanos es el humo del cigarrillo, las exhalaciones de varios tipos de combustión, las industrias metalúrgicas y algunas instalaciones eléctricas [1,2]. En el cuerpo, el cadmio se une predominantemente a la metalotioneína, la albúmina y otras proteínas plasmáticas en la sangre. El cadmio es un metal tóxico peligroso que causa estrés oxidativo al producir radicales libres que son dañinos para las células. Los radicales libres pueden dañar proteínas, lípidos, enzimas y ADN y, por lo tanto, deben ser neutralizados por antioxidantes antes de ingresar a las células [3].
Si no se neutraliza, el Cd provoca la desintegración de los glóbulos rojos [4], se acumula en el organismo—, especialmente en el hígado yriñones—y, por su similitud con el zinc, que es un elemento esencial, entra fácilmente en reacciones enzimáticas y participa en procesos bioquímicos [5]. Se excreta muy lentamente y con dificultad del organismo [6]. Es bien sabido que los antioxidantes pueden tener un efecto protector contra el estrés oxidativo y el daño por metales pesados, y este trabajo experimental se basó en este hecho. El extracto de semilla de uva (GSE) contiene una amplia gama de componentes biológicamente activos en su matriz [7] que ayudan a neutralizar los efectos adversos de los radicales libres. GSE protege a las células del daño al regular el daño oxidativo celular, reducir el daño a los órganos, mejorar el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes y reducir la liberación de mediadores inflamatorios. También tiene efectos antiinflamatorios, antiapoptóticos y pro-proliferativos [8]. El alto contenido de flavan-3-ol condensado o procianidinas, que están bajo investigación como método alternativo de tratamiento para enfermedades graves, es particularmente significativo [9,10]. Sin embargo, el contenido y la composición de los compuestos fenólicos de la semilla de uva, así como la actividad antioxidante del extracto de la semilla, pueden verse influenciados por el cultivo de la vid, el patrón, las condiciones climáticas o las técnicas de cultivo [11–13] y, por lo tanto, las propiedades antioxidantes, como así como los efectos protectores de un extracto concreto, no se pueden predecir fácilmente. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto protector del GSE preparado a partir de la variedad de vid semirresistente Cerason sobre marcadores bioquímicos en sangre, plasma, hígado yriñonesde ratas marrones que habían estado expuestas a los efectos del cadmio.
Palabras clave:extracto de semilla de uva; antioxidantes; cadmio; rattus norvegicus; marcadores bioquímicos; efecto protector; riñón, riñones
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2. Resultados y Discusión
2.1. Actividad antioxidante y composición fitoquímica del extracto de semilla de uva
El extracto de semilla de uva preparado a partir de la variedad semirresistente Cerason se probó en cuanto a actividad antioxidante, contenido polifenólico total y antioxidantes individuales seleccionados. La actividad antioxidante se determinó espectrofotométricamente utilizando cuatro métodos basados en diferentes principios (DPPH• , ABTS• plus , FRAP, FR) y los compuestos polifenólicos totales se determinaron con el método de Folin-Ciocalteu. Dependiendo del método utilizado, la actividad antioxidante osciló entre 7 y 31 mg/g equivalente de ácido gálico (GAE) y el contenido polifenólico total fue de 9,3 mg/g GAE (Cuadro 1). Los resultados de esta parte del experimento apuntaron al alto potencial antioxidante de las semillas de uva.
2.2. Determinación in vivo del efecto del extracto de semilla de uva en ratas
2.2.1. Determinación del contenido de cadmio en sangre, hígado y riñonesEl cadmio es el metal tóxico más frecuente en los alimentos. Después de la administración oral, se absorbe en el intestino, se transporta al hígado y se conjuga con los grupos tiol de la metalotioneína (MT). Aparte de esto, el Cd también puede unirse a la albúmina u otras proteínas en la sangre [14]. Posteriormente, el Cd se acumula en el cuerpo, se excreta lentamente del cuerpo a través de la orina y las heces y tiene una vida media biológica de unos 20 años. La mayor cantidad (alrededor de un tercio) de cadmio se encuentra en elriñóncorteza. En la sangre, la mayor parte del cadmio (alrededor del 90 por ciento) está presente en los glóbulos rojos. Es tóxico para una amplia gama de órganos y los principales objetivos son losriñones, huesos y pulmones [15-17]. Se ha informado que GSE reduce las concentraciones de cadmio en los glóbulos rojos y en elriñones,mientras que se ha informado que su contenido en el hígado aumenta [14]. Los resultados del contenido de cadmio en sangre en este estudio se muestran en la Figura 1A. Al inicio del experimento se encontraron 3,2 µg/kg de cadmio en la sangre de los animales. Durante el experimento, después de 14 días, el valor medio de cadmio en el grupo con la adición de GSE y cadmio fue significativamente mayor que en otros grupos (10,8 µg/kg, p=0,023). Después de 28 días, la variabilidad de los datos era demasiado alta para observar una significancia estadística.
Al comienzo del experimento, no se detectó cadmio en los hígados (Figura 1B) de los animales de experimentación. En consecuencia, no se detectó cadmio en los hígados de los animales de los grupos de control y GSE durante el experimento. Por otro lado, después de 14 días del experimento, el valor medio de cadmio en el grupo con adición de cadmio fue de 5,8 mg/kg y en el grupo con adición de cadmio y GSE el valor medio fue de 5,2 mg/kg. Ambos valores fueron significativamente diferentes del grupo de control (p=0.002 yp=0.018 para el grupo de cadmio solo y el grupo con cadmio y GSE, respectivamente). Después de 28 días, el valor medio en el grupo con la adición de cadmio había aumentado a 6,7 mg/kg, que difería significativamente del nivel de cadmio en el grupo con la adición de cadmio y GSE, que había disminuido ligeramente a 4,8 mg/kg. (pág= 0.008).
Al comienzo del experimento, no se detectó cadmio en elriñones(Figura 1C) de los animales de experimentación. En consecuencia, no se detectó cadmio en elriñonesde los animales de los grupos control y GSE durante el experimento. Por otro lado, después de 14 días, el valor medio de cadmio en el grupo con adición de cadmio fue de 9,5 mg/kg y en el grupo con adición de cadmio y GSE, el valor medio fue de 6,5 mg/kg. Ambos valores fueron significativamente diferentes del grupo de control (p < 0.001="" para="" ambos="" grupos).="" después="" de="" 28="" días,="" el="" valor="" medio="" en="" el="" grupo="" con="" la="" adición="" de="" cadmio="" había="" aumentado="" a="" 16,6="" mg/kg,="" que="" difería="" significativamente="" del="" nivel="" de="" cadmio="" en="" el="" grupo="" con="" la="" adición="" de="" cadmio="" y="" gse,="" que="" había="" aumentado="" solo="" ligeramente="" a="" 10,4="" mg/kg.="" kg="" (p="0.009)." así,="" en="">riñonesy en el hígado, el contenido de Cd se redujo significativamente con la administración de GSE. GSE contiene compuestos fenólicos que pueden quelar Cd, reduciendo así la acumulación de Cd. La formación de estos quelatos probablemente resultó en una capacidad reducida de las proteínas para unirse a Cd, que por lo tanto podría eliminarse más eficazmente del cuerpo [18].
2.2.2. Determinación del contenido de creatinina y urea
Con respecto a la acumulación de cadmio en elriñones, lariñónes uno de los órganos diana más importantes para la toxicidad inducida por Cd. Por lo tanto, losriñónSe determinaron los marcadores creatinina y urea en el plasma. La determinación de creatinina es un buen indicador del filtrado glomerular y se utiliza principalmente para monitorizar el curso deenfermedad del riñon. La relación entre la concentración de creatinina y el filtrado glomerular es hiperbólica; a medida que disminuye la filtración glomerular, también disminuye la secreción de creatinina [19]. El aumento de la ingesta del metal pesado cadmio conduce aDaño en el riñón, y por lo tanto redujo la eficiencia de secreción de creatinina. Como resultado, un nivel elevado de creatinina en sangre indica unarenaltrastorno [20].
En nuestro estudio, los niveles de creatinina aumentaron con Cd, en concordancia con los resultados publicados previamente [21]. El valor medio del contenido de creatinina (Figura 2A) en los animales de experimentación al comienzo del experimento fue de 3.0 mg/L. En el grupo que recibió cadmio, hubo un aumento significativo en los valores monitoreados a 5,1 mg/L (después de 14 días, p=0.015) y a 6,2 mg/L (después de 28 días, p < 0.001).="" en="" el="" grupo="" en="" el="" que="" se="" coadministró="" gse="" con="" cadmio,="" el="" aumento="" de="" este="" marcador="" fue="" menor="" (4,2="" mg/l="" después="" de="" 14="" días="" y="" 5,5="" mg/l="" después="" de="" 28="" días)="" y="" estadísticamente="" significativo="" solo="" después="" de="" 28="" días,="" en="" comparación="" con="" el="" control="" (="" p="">< 0,001).="" por="" lo="" tanto,="" el="" aumento="" en="" la="" concentración="" de="" creatinina="" fue="" frenado="" por="" la="" administración="" conjunta="" de="" gse,="" lo="" que="" sugiere="" una="" reducción="" del="" efecto="" tóxico="" causado="" por="" el="" cadmio.="" en="" el="" grupo="" que="" recibió="" solo="" gse="" hubo="" valores="">
La urea es cuantitativamente el producto degradante más importante de aminoácidos y proteínas. Se forma en el hígado a partir del amoníaco liberado por reacciones de desaminación durante el metabolismo de los aminoácidos. Se excreta del organismo principalmente porriñonespor filtración glomerular y reabsorción tubular [22]. En el caso deenfermedades renales, la tasa de producción de urea excede la tasa de eliminación, lo que da como resultado un aumento en el nivel de urea en sangre. Además, el cadmio inhibe la incorporación de aminoácidos en las proteínas, lo que provoca uremia [21]. Por otro lado, cuando la función hepática falla, la síntesis de urea disminuye y por lo tanto también su concentración en plasma [20]. Por lo tanto, la concentración de urea en sangre depende del contenido de proteínas en la dieta,renalexcreción y la función metabólica del hígado.
En nuestro estudio, los niveles de urea aumentaron con Cd, en concordancia con los resultados publicados previamente [21]. El valor medio del contenido de urea (Figura 2B) en los animales de experimentación al inicio del experimento fue de 207 mg/L. En el grupo que recibió cadmio, hubo un aumento significativo en los valores monitoreados a 329 mg/L (después de 14 días) y 425 mg/L (después de 28 días). En el grupo al que se le administró GSE junto con cadmio, el aumento de este marcador fue solo ligeramente inferior: 325 mg/L después de 14 días y 381 mg/L después de 28 días. Ambos grupos que recibieron solo cadmio y cadmio junto con GSE difirieron significativamente del grupo de control después de 14 (p=0.001 y p=0.002, respectivamente) y 28 días del experimento (p < 0.001="" para="" ambos).="" en="" el="" grupo="" que="" recibió="" solo="" gse,="" se="" encontraron="" valores="">
2.2.3. Determinación de la actividad antioxidante del plasma
El cadmio induce una serie de efectos relacionados principalmente con el estrés oxidativo. Como el Cd no es redox-activo, no genera directamente especies reactivas de oxígeno. Sin embargo, su producción después de la exposición a Cd ha sido reportada en muchos estudios y revisada por Cuypers et al. [23]. Los mecanismos que conducen a la alteración redox durante la exposición al Cd incluyen el agotamiento del glutatión reducido causado por la afinidad del Cd a los grupos tiol, el reemplazo de Fe por Cd en las proteínas que conducen a un aumento de las concentraciones de Fe libre activo redox, la disfunción mitocondrial y la inducción de NADPH oxidasas, que catalizan la formación de radicales superóxido [23]. Durante el estrés oxidativo, los compuestos antioxidantes como los fenólicos pueden terminar la producción de nuevas especies reactivas a través de su conversión a formas de radicales estables. Por lo tanto, los extractos de plantas ricos en fenoles pueden proporcionar efectos protectores contra Cd o compuestos que contienen Cd [24].
En este estudio, el valor medio de actividad antioxidante en plasma (Figura 3) en los animales de experimentación al comienzo del experimento fue de 0,71 mg/L. Se observó un ligero aumento en todos los grupos experimentales en comparación con el grupo de control. Sin embargo, la única diferencia significativa fue entre el grupo tratado con GSE y el grupo de control después de 28 días (p=0.012), lo que confirma un efecto positivo de GSE en la actividad antioxidante del plasma. Los resultados informados anteriormente son ambiguos; a veces, se encontró un aumento en el potencial antioxidante del plasma causado por GSE [25] y, a veces, no [14].
2.2.4. Determinación de actividades ALT y AST
El estrés oxidativo está relacionado con la pérdida de la integridad funcional de la arquitectura de la membrana causada por el aumento de la peroxidación lipídica. A su vez, el aumento de la permeabilidad de la membrana citoplasmática conduce a la fuga de enzimas marcadoras hepáticas (ALT y AST) a la sangre [14]. De hecho, la ALT y la AST son significativas desde el punto de vista diagnóstico incluso en el daño hepático limitado debido a la intoxicación y su aumento en el suero causado por el cadmio se informó anteriormente [14] y se confirmó en este estudio. El valor medio de actividad de ALT (Figura 4A) en los animales de experimentación al comienzo del experimento fue de 0,84 µkat/L. En el grupo que recibió cadmio, se registró un aumento significativo en los valores monitoreados a un promedio de 1.52 µkat/L después de 14 días (p < 0.001),="" y="" 1.87="" µkat/l="" después="" de="" 28="" días="" (p="" {{="" 13}}.004).="" en="" el="" grupo="" al="" que="" se="" coadministró="" gse="" con="" cadmio,="" el="" aumento="" de="" este="" marcador="" fue="" significativamente="" más="" lento="" que="" en="" el="" grupo="" que="" recibió="" solo="" cadmio="" (1,23="" µkat/l="" después="" de="" 14="" días="" y="" 1,92="" µkat/l="" después="" de="" 28="" días).="" después="" de="" 14="" días="" del="" experimento,="" este="" grupo="" fue="" diferente="" tanto="" del="" grupo="" de="" control="" (p="0.009)" como="" del="" grupo="" de="" cadmio="" (p="0.026)," mientras="" que,="" después="" de="" 28="" días,="" difirió="" significativamente.="" solo="" del="" grupo="" control="" (p="0.003)." en="" el="" grupo="" que="" recibió="" solo="" gse,="" los="" valores="" también="" aumentaron="" a="" 1,17="" µkat/l="" después="" de="" 14="" días.="" este="" valor="" difirió="" significativamente="" del="" grupo="" de="" control="" (p="0.024)" y="" fue="" comparable="" al="" valor="" del="" grupo="" que="" recibió="" gse="" y="" cadmio.="" después="" de="" 28="" días,="" los="" valores="" del="" grupo="" de="" gse="" solo="" se="" parecían="" al="" grupo="" de="">
El valor medio del contenido de AST (Figura 4B) en los animales de experimentación al comienzo del experimento fue de 2,07 µkat/L. En el grupo que recibió cadmio, se registró un aumento estadísticamente significativo en los valores observados solo después de 28 días del experimento (3.52 µkat/L, p=0.001). Sorprendentemente, en el grupo al que se le administró GSE junto con cadmio, el aumento de este marcador fue más rápido y significativamente diferente del grupo de control después de 14 y 28 días (2,67 y 2,84 µkat/L, respectivamente, p {{15 }}.043 para ambos), aunque el valor fue ligeramente inferior al del grupo de cadmio solo después de 28 días. La variante de solo GSE tenía valores normales.
En nuestro experimento, la administración de GSE pudo ralentizar el aumento de la actividad de ALT. Este efecto corresponde a los resultados informados anteriormente [14] y puede ser causado por la eliminación de peróxidos de lípidos a través de la transferencia de hidrógeno de un compuesto fenólico al peróxido de lípido que contiene radicales libres. Por otro lado, a más largo plazo, este efecto fue bajo. El aumento de la actividad de AST causado por el cadmio se aceleró bastante con la administración de GSE. Sin embargo, a más largo plazo, hubo una ligera disminución en la actividad de AST. Por lo tanto, GSE puede compensar parcialmente el efecto tóxico de Cd en las membranas celulares.
2.2.5. Determinación de las actividades de SOD y CAT en el hígado
Además de la participación directa en las reacciones oxidativas, el cadmio inhibe la actividad de las enzimas antioxidantes como SOD y CAT, enzimas capaces de detoxificar los radicales superóxido y el peróxido de hidrógeno, respectivamente [14]. SOD es una enzima que extingue eficazmente el radical superóxido y lo convierte en peróxido de hidrógeno menos tóxico, que puede descomponerse aún más por la catalasa o la peroxidasa [26]. CAT es una enzima que se encuentra en casi todos los organismos vivos que están expuestos al oxígeno. Actúa como catalizador para la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno [27]. Tiene uno de los números de conversión más altos entre las enzimas [28] y, como enzima antioxidante, es uno de los mecanismos protectores que conducen al mantenimiento del equilibrio en el cuerpo humano [29]. El mecanismo de la disminución de la actividad enzimática inducida por Cd es probablemente la unión directa de Cd a los sitios activos de las enzimas [30].
Las disminuciones en las actividades de SOD y CAT también se observaron en este estudio. Al comienzo del experimento, la actividad media de la enzima SOD en el hígado (Figura 5A) de los animales de experimentación fue de 18,4 U/mg de proteína. Después de 14 días del experimento, la actividad de SOD fue significativamente mayor en el grupo que recibió GSE (21,1 U/mg) que en los dos grupos que recibieron cadmio (p < 0.001="" y="" p="" {{="" 9}}.009="" para="" los="" grupos="" de="" cadmio="" solo="" y="" cadmio="" con="" gse,="" respectivamente),="" pero="" solo="" en="" el="" grupo="" que="" recibió="" cadmio="" solo="" la="" actividad="" de="" sod="" fue="" significativamente="" menor="" (16.7="" u/mg)="" que="" en="" el="" grupo="" de="" control="" (p="0" .005).="" después="" de="" 28="" días="" del="" experimento,="" ambos="" grupos="" que="" recibieron="" cadmio="" diferían="" significativamente="" del="" grupo="" de="" control="" (16,4="" u/mg,="" p="0,002" y="" 17,6="" u/mg,="" p="0,023" para="" cadmio="" solo="" y="" cadmio="" con="" gse,="" respectivamente)="" y="" el="" grupo="" tratado="" solo="" con="" gse="" (p="">< 0.001="" y="" p="0.005" para="" cadmio="" solo="" y="" cadmio="" con="" gse,="">
Al comienzo del experimento, la actividad media de la enzima CAT en el hígado (Figura 5B) fue de 32,7 U/mg de proteína. Después de 14 días del experimento, la actividad CAT fue significativamente mayor en el grupo que recibió GSE (33.5 U/mg) que en los dos grupos que recibieron cadmio (p=0.002 y p=0.031 para el cadmio solo y cadmio con GSE, respectivamente), pero solo en el grupo que recibió cadmio solo la actividad de CAT fue significativamente menor (23.8 U/mg) que en el grupo de control (p=0.005). Sin embargo, después de 28 días, la actividad de CAT en el grupo que recibió GSE junto con cadmio disminuyó aún más a 27,1 U/mg, alcanzó los valores del grupo de cadmio solo (25,8 U/mg) y difirió significativamente del grupo de control (p { {21}}.033). El grupo tratado con GSE solo difirió significativamente de ambos grupos de cadmio (p=0.026 yp=0.012 para cadmio solo y cadmio con GSE, respectivamente). Curiosamente, las disminuciones causadas por el cadmio fueron ralentizadas por la coadministración de GSE. Para CAT, estos efectos de GSE se han observado previamente [14]. Es probable que el efecto quelante de los compuestos fenólicos contenidos en GSE reduzca la capacidad del cadmio para unirse al sitio activo de la enzima.
2.2.6. Determinación del contenido de MT
El cadmio no está sujeto a ninguna conversión metabólica directa, pero en todos los tejidos se une principalmente a la metalotioneína (MT). La MT pertenece a un grupo de proteínas intracelulares ricas en cisteína, de bajo peso molecular, con un peso molecular de 6 a 10 kDa. El papel principal de la MT en el organismo incluye el mantenimiento de la homeostasis del zinc, la desintoxicación de metales pesados y la protección contra el estrés oxidativo. La expresión de MT es inducible por muchos factores exógenos y endógenos, como la radiación UV, los metales pesados, las hormonas del estrés, los radicales libres de oxígeno, los mediadores de la inflamación, la infección, el trauma y la oncogénesis [31,32]. La MT se sintetiza en gran medida en el hígado yriñóny liberado en la sangre. Aunque la MT es responsable de la acumulación de cadmio en los tejidos al reducir su excreción, la MT protege contra la toxicidad aguda y crónica inducida por Cd [33]. En nuestro estudio, se controló el contenido de MT en sangre, hígado yriñón.
El valor medio del contenido de MT en la sangre (Figura 6A) de los animales de experimentación al comienzo del experimento fue de 23,9 nmol/g. Después de 14 días, los cambios fueron mínimos y, después de 28 días, se observó una gran variabilidad entre las repeticiones, lo que provocó inconclusión estadística (p=0.948). El valor medio del contenido de MT para elriñones(Figura 6B) de los animales de experimentación al comienzo del experimento fue de 21,46 nmol/g. Los valores no cambiaron significativamente en ningún grupo experimental durante el experimento (p=0.938). El valor medio del contenido de MT en el hígado (Figura 6C) de los animales de experimentación al comienzo del experimento fue de 17,15 nmol/g. Después de 14 días, el contenido de MT aumentó ligeramente en todos los grupos experimentales y las diferencias con el grupo de control fueron significativas para el grupo de solo Cd y el grupo de solo GSE (p=0.008 y p=0 .046, respectivamente). Después de 28 días, el contenido de MT en el grupo GSE volvió al valor del grupo de control, mientras que el contenido de MT en el grupo de Cd permaneció aumentado y difería tanto del grupo de control como del GSE (p=0.046 y p=0.035, respectivamente). En el grupo que recibió GSE junto con cadmio, el contenido de MT no difirió significativamente del control, lo que estaba en concordancia con el menor contenido de cadmio encontrado en el hígado de este grupo, en comparación con el grupo de Cd solo (la diferencia fue significativa después de 28 días del experimento).
En conjunto, los cambios estadísticamente significativos en el contenido de MT causados por Cd solo se observaron en el hígado. Anteriormente, se informó un aumento de MT en la sangre de animales de experimentación que recibieron cadmio [34]. En este caso, los resultados sugieren que la desintoxicación de Cd a través de MT podría ocurrir más bien en el hígado.
3. Materiales y Métodos
3.1. Diseño de experimentosRatas marrones del género Wistar (ocho semanas de edad, 235 ± 3 g) se dividieron en cuatro grupos de seis individuos: A) un grupo control de ratas que seguían una dieta normal (n=6); B) un grupo de ratas a cuya dieta se añadió GSE (200 mg GSE/día) (n=6); C) un grupo al que se le dio cadmio (2 mg Cd/día—concretamente, CdCl2 disuelto en agua) (n=6); y D) un grupo que recibió una dieta que contenía cadmio (2 mg Cd/día) al que se le agregó GSE (200 mg GSE/día) (n=6). El extracto se tomó de las semillas de la variedad de vid Cerason; su preparación y caracterización se describen en la Sección 3.2. (Extracto de semilla de vid). El extracto se pesó diariamente a una dosis de 200 mg, antes de administrarse a las ratas marrones experimentales (200 mg GSE a cada rata; 0,85 g/L kg de masa corporal). El GSE se administró con agua. Las ratas recibieron mezclas de alimentos húmedos y agua inofensiva (para bebés) ad libitum. Una vez por semana, se cambió la ropa de cama de los animales. Después de 14 y 28 días experimentales, se sacrificaron tres animales de cada grupo y se extrajo su sangre mediante una punción cardíaca. Antes de la colecta, se asignó medicación intraperitoneal con Fraxiparina (0,01 mL/kg) y, posteriormente, los animales recibieron dietil éter bajo anestesia inhalatoria. Luego se recolectó una muestra de sangre en microtubos de ensayo recubiertos con heparina (o tubos con EDTA, para análisis de MT y cadmio; sin centrifugación posterior), y esto fue seguido por una centrifugación suave (800 g/10 min) y la recolección de sangre. plasma para su posterior análisis. El hígado y el derechoriñónfueron extraídos para su posterior análisis. El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y el protocolo fue aprobado por la Comisión de Expertos para Asegurar el Bienestar de los Animales de Experimentación de la Universidad de Mendel en Brno (para el proyecto IGA-ZF/2016-AP011).
3.2. Extracto de semilla de vid
Se clasificaron, limpiaron, secaron y molieron semillas de vid (variedad Cerason—Merlot × Seibel 13 666). La clasificación se realizó a través de los orujos en una máquina separadora, donde las semillas se separaron de las cáscaras. Las semillas separadas de esta manera se enjuagaron posteriormente, se retiraron las semillas vacías y se limpiaron las semillas restantes. Las semillas limpias y lavadas se secaron en un secador a 50 ◦C durante 12 h. Esto fue seguido por la molienda de las semillas utilizando un molinillo de laboratorio IKA MF 10 Basic (IKA Werke, Staufen im Breisgau, Alemania). Las semillas molidas se extrajeron en etanol al 75 por ciento durante 120 h (22 ◦C, agitadas a 50 RPM; IKA KS 260 Basic, fabricante: IKA Werke, Staufen im Breisgau, Alemania) en una proporción de una parte de semillas molidas por diez partes de etanol (m/m). Luego de esto, el extracto se colocó en tubos de ensayo de 25 mL (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se centrifugó (Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Westphalia, Alemania) a 4 ◦C y RCF 25,000× g. Se tomó una muestra centrifugada del tubo de ensayo y se transfirió a un matraz de destilación con evaporador al vacío (IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Alemania), donde se evaporó el etanol. La evaporación se realizó en vacío a 90 ◦C, y el extracto se transfirió a cajas Petri y se liofilizó en vacío a 53 ◦C (liofilizador Heto PowerDry PL 3000; Trigon-plus, Cestlice, República Checa). Una vez preparado, el extracto se administró a los animales de experimentación.
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3.3. Determinación de la Actividad Antioxidante y el Contenido de Polifenoles Totales
Para asegurar la objetividad de los resultados, se utilizaron cuatro métodos fundamentalmente diferentes para determinar la actividad antioxidante. Las muestras se analizaron en un espectrofotómetro automático BS-400 (Mindray, Shenzen, China). Todas las muestras se analizaron por triplicado, correspondiendo el valor resultante a la media de estas medidas. Estos análisis se realizaron siguiendo a Sochor et al. [35].
3.3.1. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método ABTS
Se preparó una solución para la determinación de la actividad antioxidante mediante el ensayo ABTS mezclando dos soluciones: solución 1: solución 7 mM de ABTS preparada pesando m=9,60 mg por 5 ml de agua destilada; y solución 2: solución de persulfato de potasio 4,95 mM preparada pesando m= 1,67 mg por 5 mL de agua destilada. La solución resultante se diluyó 1:10 con agua destilada y se dejó en la oscuridad y en frío durante 12 h. Luego, se pipetearon 150 µL del reactivo R1 (ABTS 7 mM y persulfato de potasio 4,95 mM) en cubetas de plástico, se agregaron 3 µL de la muestra y se midió en un espectrofotómetro (λ=660 nm) durante 12 mín. De acuerdo con la curva de calibración, la absorbancia se convirtió en el contenido equivalente de ácido gálico; la actividad antioxidante se calculó a partir de la curva de calibración usando ácido gálico como estándar (10–200 mg·L1), y los resultados se expresaron como equivalentes de ácido gálico.
3.3.2. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método DPPH
Primero se pesaron m {{0}}.35 mg de radical DPPH. Esta cantidad se transfirió a un matraz volumétrico de 250 mL y se completó con metanol. Luego, se pipetearon 150 µL del reactivo R1 (DPPH 0,095 mM) en cubetas de plástico, seguido de la adición de 15 µL de la muestra a medir. La prueba DPPH se basa en la capacidad del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo para reaccionar con donantes de hidrógeno. DPPH muestra una fuerte absorción en el espectro de espectroscopia ultravioleta-visible (UV-VIS). Se midió la absorbancia durante 12 min a λ=505 nm. De acuerdo con la curva de calibración, la absorbancia se convirtió en contenido de ácido gálico equivalente.
3.3.3. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del poder antioxidante reductor férrico
Se usaron tres soluciones para determinar la actividad antioxidante usando el método del poder antioxidante reductor férrico (FRAP): (1) solución de TPTZ: 10 mM TPTZ (m=78.02 mg) disuelto en 25 mL de HCl 40 mM; (2) Solución de FeCl3: FeCl3 20 mM (m=135.13 mg) disuelto en 25 mL de agua destilada; y (3) solución tampón de acetato: tampón de acetato 0,02 M pH 3,6 (m=775 mg de acetato de sodio disueltos en 250 mL de agua destilada, pH ajustado con ácido acético). Las tres soluciones se mezclaron en la proporción 1:1:10 (TPTZ: FeCl3: tampón acetato). Luego, se pipetearon 150 µL de reactivo en cubetas de plástico y se agregaron 3 µL de la muestra. Se midió la absorbancia durante 12 min a λ=605 nm. La actividad antioxidante se calculó a partir de la curva de calibración usando ácido gálico como estándar (10–200 mg·L1). Los resultados se expresaron como equivalente de ácido gálico.
3.3.4. Determinación de la actividad antioxidante utilizando el método de radicales libres de clorofilina
Se pipetearon un total de 200 µL del reactivo R1 (HCl 0,1 M, extracto de clorofila, tampón de reacción, catalizador) en cubetas de plástico y luego se agregaron 8 µL de la muestra. Este método utiliza la capacidad de la clorofilina (sal de sodio y cobre de la clorofila) para aceptar y donar electrones mientras cambia de manera estable el máximo de absorción. Este proceso está condicionado por el ambiente alcalino y la adición de un catalizador. Se midió la absorbancia durante 12 min a λ=450 nm. Los últimos valores de medición se utilizaron para el cálculo. Los resultados se expresaron como equivalente de ácido gálico.
3.3.5. Determinación de la concentración de polifenoles totales
Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu para determinar los compuestos polifenólicos totales. Todas las muestras se analizaron por triplicado y el valor resultante se obtuvo como la media de estas medidas. Se pipeteó una muestra de 40 µL en una cubeta (3 mL) y se diluyó con 1960 µL de agua destilada. Posteriormente, se añadieron a la cubeta 50 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu. La mezcla se agitó a fondo y, después de 3 min, se añadieron 300 µL de solución decahidratada de Na2CO3 al 20 por ciento. La mezcla de reacción se agitó y se incubó a 22 ◦C durante 120 min. Pasado este tiempo, se midió la absorbancia (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, Alemania) a λ=750 nm frente a un blanco. Los resultados se expresaron como equivalente de ácido gálico.
3.4. Determinación de Antioxidantes por HPLC
Determinación de componentes antioxidantes individuales mediante cromatografía líquida de alta resolución con espectrómetro de masas. Los análisis de muestras utilizadas para la estimación de flavonoides y proantocianinas se realizaron en un sistema cromatográfico Agilent Technologies 12{{10}}0 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) que consta de siguientes dispositivos: reservorios de fase móvil, desgasificador, bomba binaria, reservorio de muestras con muestreador automático y detector de masas con un LC/MS de triple cuadrupolo Agilent 6460 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La separación de las muestras se realizó en columnas cromatográficas Zorbax SB C18 con dimensiones de 50 × 2,1 mm y tamaño de partículas de 2,7 µm. El período de análisis fue siempre de 6 min. La tasa del compañero del gas portador fue de 0,6 mL·min1. El componente orgánico de la fase móvil era metanol grado gradiente (disolvente B) y el componente acuoso contenía formiato de amonio 0,05 M (disolvente A). El gradiente de la fase móvil fue el siguiente: tiempo 0 min: 50 por ciento de disolvente A y 50 por ciento de disolvente B; tiempo 2,5 min: 100 por ciento de disolvente A y 0 por ciento de disolvente B; tiempo 5 min: 50 por ciento de solvente A y 50 por ciento de solvente B. La temperatura del termostato de la columna se ajustó a 45 ◦C.
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3.5. Determinación de Marcadores Bioquímicos Seleccionados
Marcadores bioquímicos en sangre, plasma, hígado yriñónde los animales fueron monitoreados para determinar el efecto protector de GSE contra los efectos negativos del cadmio. Se realizaron los siguientes análisis: (1) Análisis de plasma: actividad antioxidante plasmática total, creatinina, urea, ALT, AST. (2) Análisis de sangre: MT. (3) Análisis hepáticos: SOD, CAT, MT. (4)Riñónanálisis: MT.
3.5.1. Determinación de la actividad antioxidante total del plasma,Creatinina, urea, ALT y AST Se utilizó un analizador bioquímico automatizado BS{{0}} (Mindray, Shenzen, China) para analizar la actividad antioxidante total del plasma, creatinina, urea, ALT y AST. Determinación de la actividad antioxidante total del plasma Se utilizó el método de radicales libres para determinar la actividad antioxidante del plasma [35]. Este método utiliza la capacidad de la clorofilina (la sal de sodio y cobre de la clorofila) para aceptar y donar electrones mientras cambia de manera estable el máximo de absorción. Este proceso está condicionado por el ambiente alcalino y la adición de un catalizador. Se pipetearon un total de 200 µL del reactivo R1 (HCl 0,1 M, extracto de clorofilina, tampón de reacción y catalizador) en cubetas de plástico, después de lo cual se añadieron 8 µL de la muestra. La absorbancia se midió durante 12 min a λ=450 nm y se utilizó el último valor de medición para el cálculo. La actividad antioxidante se calculó a partir de la curva de calibración usando ácido gálico como patrón y los resultados se expresaron como equivalente de ácido gálico.
Determinación del Contenido de CreatininaEl principio del método es la determinación fotométrica del complejo de color de creatinina con picrato alcalino, cuya velocidad de formación es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra. Se utilizó un kit de diagnóstico de Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Alemania) para determinar la creatinina. Se pipeteó un total de 180 µL del reactivo R1 (hidróxido de sodio 0,16 mM) en la cubeta, seguido de la adición de 10 µL de la muestra y 30 µL del reactivo R2 (ácido pícrico 4 mM). La absorbancia se midió durante seis minutos a λ=505 nm. Para el cálculo se utilizó el valor de absorbancia del reactivo R1 solo con la muestra y el valor de absorbancia después de 6 min de incubación con el reactivo R2.
Determinación de Alanina AminotransferasaSe utilizó un kit de diagnóstico de Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Alemania) para determinar la ALT. En primer lugar, se pipetearon automáticamente en las cubetas 150 µL del reactivo R1 (tampón Tris 100 mM pH 7,5; L-alanina 500 mM, lactato deshidrogenasa 1200 U/L) y 15 µL de muestra de plasma. Posteriormente, se pipetearon automáticamente 30 µL del reactivo R2 (2-oxoglutarato 15 mM, NADH 0,18 mM) y se incubó la mezcla durante 5 min. La absorbancia se midió a λ=340 nm. Se usaron para el cálculo los valores de absorbancia del reactivo R1 solo con la muestra y los valores de absorbancia después de 5 min de incubación con la muestra. El resultado se convirtió según la curva de calibración a la actividad enzimática en µkat/L.
Determinación de Aspartato AminotransferasaSe utilizó un kit de diagnóstico de Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Alemania) para determinar AST. En primer lugar, se pipetearon automáticamente en las cubetas 150 µL del reactivo R1 (tampón Tris 80 mM pH 7,8, L-aspartato 240 mM, malato deshidrogenasa 1200 U/L) y 15 µL de muestra de plasma de animales de experimentación. Posteriormente, se realizó la mezcla e incubación a 37 ◦C durante 270 s. A continuación, se pipetearon automáticamente 30 µl de reactivo R2 (2-oxoglutarato 15 mM, NADH 0,18 mM) y la mezcla se incubó durante 5 min. La absorbancia se midió a λ=340 nm. Se usaron para el cálculo los valores de absorbancia del reactivo R1 solo con la muestra y los valores de absorbancia después de 5 min de incubación con la muestra. El resultado se convirtió según la curva de calibración a la actividad enzimática en µkat/L.
Determinación de UreaSe utilizó el siguiente procedimiento para determinar la urea: 200 µL del reactivo R1 (tampón Tris pH 7,8, ADP, ureasa y GLDH) y 200 µL del reactivo R2 (2-oxoglutarato, NADH) se pipetearon automáticamente en cubetas, seguido de una muestra de volumen 4 µL, luego de lo cual la mezcla se mezcló y se incubó a 37 ◦C por 30 s. Posteriormente, se midió la absorbancia a λ=340 nm y después de otros 60 s, se midió nuevamente la absorbancia. Los valores de absorbancia después de 30 s y después de otros 60 s se usaron para el cálculo. Los valores se restaron unos de otros y el resultado se convirtió según la curva de calibración al contenido de urea.
Determinación de Proteínas Totales por el Método de BiuretLa determinación de proteínas totales por el método de Biuret se describe en detalle en otra publicación [9]. Se pipeteó un total de 180 µL de reactivo de Biuret (tartrato de sodio y potasio 15 mM, NaI 100 mM, KI 5 mM y CuSO4 5 mM) en la cubeta, seguido de 45 µL de la muestra. Después de diez minutos de incubación a 37 ◦C, se midió la absorbancia a la longitud de onda λ=546 nm. El principio aquí es la reacción del enlace peptídico con Cu (II) en un ambiente alcalino, con la formación de un color azul-violeta. Para el cálculo se utilizó el valor de absorbancia del reactivo solo y el valor de absorbancia después de diez minutos de incubación con la muestra.
3.5.2. Determinación de Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT) Determinación de la Actividad SOD, Se usó un kit comercial (19160 SOD, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) para determinar la actividad de SOD (SOD, EC 1.15.1.1). La medición se realizó en una cubeta de plástico en un analizador automático BS 400 (Mindray, Shenzen, China). En primer lugar, se pipetearon 200 µL del reactivo R1 (solución WST diluida en tampón 20x) en la cubeta y se incubó el reactivo a 37 ◦C durante 108 s (1 min, 48 s). Luego, se pipetearon 20 µL de muestra y, a los 378 s (6 min, 18 s), se inició la reacción agregando 20 µL del reactivo R2 (solución enzimática diluida en tampón 167X). La mezcla se incubó durante 72 s (1 min, 12 s) y luego se midió la absorbancia a λ=450 nm. La cinética de reacción se midió durante 180 s (3 min) y la absorbancia se leyó cada nueve segundos. El instrumento calculó el aumento promedio de absorbancia por minuto (∆A) y la actividad SOD de las muestras medidas, de acuerdo con la ecuación de calibración. Los resultados se expresaron en U/mL y posteriormente se convirtieron a mg de proteína.
3.5.3. Determinación del contenido de metalotioneínaLa determinación de la concentración de metalotioneína en sangre, hígado yriñonesde las ratas marrones se realizó utilizando la técnica de extracción por transferencia de adsorción (AdTS) con voltamperometría de pulso diferencial (DPV). Para el análisis se tomaron 200 µL del sobrenadante analizado y se mezclaron con 1 800 µL de reactivo de Brdiˇcka en un vaso medidor, luego de lo cual se realizó la determinación electroquímica propiamente dicha. El ensayo se realizó de conformidad con un protocolo descrito previamente [37]. Se utilizó una conexión clásica de tres electrodos. El electrodo de trabajo fue un electrodo colgante de gota de mercurio (HMDE) con un área de caída de 0.4 mm2, mientras que el electrodo de referencia fue Ag/AgCl/3 M KCl y el auxiliar fue un electrodo de platino. El electrolito base (1 mmol·L1 [CO(NH3)6] Cl3 y 1 mol·L1 de tampón de amonio; NH3(aq) más NH4Cl, pH 9,6) se cambió para cada muestra medida. Los parámetros DPV fueron los siguientes: potencial inicial 0.7 V, potencial final 1.75 V, burbujeo 5 s, tiempo de deposición 240 s, tiempo de modulación 0.0 5 s, intervalo de tiempo de 0,25 s, paso de potencial de 0,00105 V, velocidad de exploración de 0,0042 V/s y amplitud de modulación de 0,02505 V. La determinación de MT se realizó en un dispositivo de medición que consistía en un Automuestreador 695 conectado a una unidad de medición VA Stand 693 y controlado por una unidad de control 693 VA TraceAnalyser (todo Metrohm, Herisau, Suiza). Todo el sistema de medición se enfrió a 4 ◦C utilizando un Julabo F25 (Julabo, Seelbach, Alemania). Los voltamogramas obtenidos se exportaron al programa VA Database 2.2 (Metrohm, Herisau, Suiza), y las muestras analizadas se desoxigenaron mediante el burbujeo activo de argón con una pureza del 99,999 por ciento.
3.5.4. Determinación del Contenido de Cadmio en la Descomposición de Muestras en Sangre, Hígado y Riñón Se utilizó un extractor de microondas Ethos One (Milestone, Sorisole, Italia) para la descomposición del hígado yriñóny se usó un extractor de microondas Multiwave 3000 (Anton Paar Graz, Austria) para la descomposición de las muestras de sangre. La mineralización se llevó a cabo de forma húmeda, utilizando ácido nítrico al 65 por ciento (HNO3 supra puro) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y peróxido de hidrógeno al 30 por ciento (H2O2 supra puro) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) Un total de 0,4 g de hígado oriñónLa muestra se pesó en una serie de recipientes de teflón y se añadieron a la muestra 5 ml de HNO3 al 65 %, 3 ml de H2O2 al 30 % y 2 ml de Milli Q H2O. Los contenedores se cerraron y el instrumento se puso en marcha de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La descomposición por microondas duró 40 min a 210 ◦C. Posteriormente, las muestras se enfriaron durante 45 min y se almacenaron a 4 ◦C en recipientes de PE. Se pesó un total de 0,01 g de una muestra de sangre en una serie de recipientes de vidrio y se añadieron a la muestra 300 µL de HNO3 al 65 % y 200 µL de H2O2 al 30 %. Los contenedores se cerraron y el instrumento se puso en marcha de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La descomposición por microondas duró 40 min a una temperatura de 140 ◦C. Posteriormente, las muestras se enfriaron durante 45 min y se almacenaron a 4 ◦C hasta la determinación por AAS.
Determinación de Cadmio por Espectrometría de Absorción AtómicaEl cadmio se determinó en un dispositivo Agilent 280/240 Series AA Systems (Agilent Technologies). El hígado yriñónlas muestras se analizaron en llama de acetileno-aire (Fa AAS), y las muestras de sangre por atomización electrotérmica (ETA AAS) a una longitud de onda de 228,8 nm. A partir de una solución estándar de cadmio (Analytika Praha, Praga, República Checa), con una concentración de 1.000 ± 0,002 g·L1. Esto fue seguido por una medición de las soluciones de la serie de calibración y la construcción de las curvas de calibración, después de lo cual la mineralización de la sangre, el hígado yriñónse midieron las muestras.
3.6. Análisis estadísticoTodas las mediciones se realizaron por triplicado. Los valores atípicos se identificaron con la prueba de Grubbs y se excluyeron (en total, se encontraron dos valores atípicos). Antes del análisis estadístico, los datos se transformaron mediante transformación logarítmica y se analizaron mediante ANOVA unidireccional (cada punto de tiempo por separado) con una prueba post-hoc de Tukey HSD. El umbral de significancia estadística se estableció como p <>
4. Conclusiones
Ha habido una tendencia farmacéutica y económica reciente a buscar nuevos medicamentos entre los metabolitos secundarios de las plantas, que son sustancias que pueden ayudar a proteger contra una variedad de enfermedades. Gracias a los importantes componentes biológicamente activos que las semillas de vid contienen en su matriz, pueden ser (y ya son) utilizadas con fines médicos. Se sabe que los extractos de semilla de uva protegen los tejidos contra el daño relacionado con el estrés oxidativo causado por el cadmio, un metal pesado tóxico. Esta protección probablemente esté influenciada por la composición fenólica de las semillas de uva utilizadas. En este estudio, se probó un extracto de semilla de uva preparado a partir de la variedad semirresistente Cerason con un contenido fenólico bastante alto para determinar los efectos protectores contra las alteraciones inducidas por cadmio. El GSE estudiado pudo aumentar la actividad antioxidante del plasma cuando se administró solo y reducir el contenido de cadmio en el hígado yriñonesde las ratas cuando se administran conjuntamente. En consecuencia, los aumentos de la enzima marcadora hepática ALT yriñónel marcador de creatinina causado por el cadmio fue ralentizado por GSE. Además, las disminuciones en las actividades de las enzimas antioxidantes SOD y CAT causadas por el cadmio fueron ralentizadas por la administración conjunta de GSE. Estos resultados muestran que GSE es un potente agente protector contra los efectos de los metales pesados.
