El inhibidor de farnesiltransferasa LNK-754 atenúa la distrofia axonal y reduce la patología amiloide en ratones, parte 2

Imágenes en vivo de neuronas.

Para experimentos de imágenes en vivo, las neuronas se prepararon como se indica arriba y se colocaron en placas con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) durante 7 días en cultivo. Luego se añadió LNK-754 10 nM o lonafarnib a medios condicionados y los cultivos de control se trataron con DMSO como vehículo. Después de 48 horas de tratamiento, el medio se reemplazó con medio condicionado de placas de neuronas paralelas no tratadas. Se agregaron 25 nM de LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) al medio condicionado y las neuronas se incubaron durante 30 minutos a 37 grados.

Las neuronas son una parte importante del sistema nervioso, capaces de recibir, procesar y transmitir información, y son la base material de la inteligencia y el comportamiento humanos. La inmunidad es una garantía importante para que el cuerpo humano resista las enfermedades. Puede identificar y destruir patógenos y células anormales y mantener la salud del cuerpo.

Las investigaciones muestran que existe una fuerte conexión entre las neuronas y el sistema inmunológico. Las neuronas pueden afectar el sistema inmunológico al liberar una variedad de neurotransmisores, como norepinefrina, epinefrina, etc. Estos neurotransmisores pueden cambiar la actividad de las células inmunes, mejorar la proliferación y función de las células inmunes y mejorar la inmunidad del cuerpo. Al mismo tiempo, el sistema inmunológico también puede afectar la función de las neuronas a través de diversas vías. Las células inmunitarias pueden secretar una variedad de citocinas y hormonas, que afectan el crecimiento, el desarrollo y la función de las neuronas a través de vías inmunitarias.

Además, los factores psicológicos y sociales pueden influir en la inmunidad y la función neuronal. Las emociones negativas como el estrés, la ansiedad y la depresión pueden afectar negativamente al sistema inmunológico y a las neuronas, reduciendo la inmunidad del cuerpo. Las emociones positivas, las relaciones sociales positivas y un estilo de vida saludable pueden promover el desarrollo saludable de la inmunidad y las neuronas.

En resumen, existe una relación interactiva y de apoyo mutuo entre las neuronas y la inmunidad. Mantener la salud mental, afrontar la vida de manera positiva y adoptar buenos hábitos de vida puede promover la inmunidad del cuerpo y el desarrollo saludable de las neuronas. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, la carne también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Las imágenes de lapso de tiempo de las neuronas se realizaron utilizando un microscopio de campo amplio Ti2. Las imágenes comenzaron inmediatamente a los 30 minutos y continuaron durante no más de 30 minutos. Las exposiciones de 1- se tomaron cada minuto y se tomaron imágenes de 20 a 30 áreas separadas por plato en 30 minutos. Las cuantificaciones de distancia y velocidad de las partículas LysoTracker y los análisis de quimógrafo se realizaron utilizando el software NIS Elements y se describen en detalle a continuación. En experimentos separados, se añadió Lysosensor-Green DND-189 1 μM (#L7535, Invitrogen) a medios condicionados y se tomaron imágenes capturadas de neuronas vivas durante no más de 15 minutos usando un microscopio confocal Nikon A1 con un objetivo de 60X. (NA 1.4) y software NIS Elements.

Imágenes en vivo de tejidos cerebrales.

Se inyectó ip diariamente a ratones 5XFAD de {{0}} meses de edad durante 3 semanas y, al finalizar el tratamiento, se anestesiaron y se perfundieron con una solución que contenía KCl 1 M, MgCl2 1 M, 0. quinurenato 1 mM. , ácido DL-2-amino-5-fosfonopentanoico 0,01 mM, glutatión 5 mM, glucosa 25 mM, NaCl 125 mM, NaH2PO4 1,4 mM y NaHCO3 25 mM.

Luego, los cerebros se diseccionaron rápidamente en ACSF oxigenado y helado que contenía KCl 2,5 mM, NaCl 85 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, {{10}}.CaCl2 5 mM, 4 MgCl2 4 mM, sacarosa 75 mM, glucosa 25 mM, C6H7NaO6 50uM, 0.quinurenato 1 mM, 0.0ácido DL-2-amino-5-fosfonopentanoico 1 mM y glutatión 5 mM. Se obtuvieron cortes coronales de 300 μm utilizando un micrótomo vibratorio Compresstome VF-200 (Precision Instruments) y se dejaron reposar durante 30 minutos para su recuperación a 32 grados en una solución de ACSF oxigenada que contenía los siguientes KCl 2,5 mM, NaCl 85 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, CaCl2 0,5 mM, 4 MgCl2 4 mM, sacarosa 75 mM, glucosa 25 mM, C6H7NaO6 50 uM, quinurenato 0,1 mM, ácido DL2-amino-5-fosfonopentanoico 0,01 mM y glutatión 5 mM.

Luego, las rodajas se transfirieron a placas con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) que contenían ACSF oxigenado con LysoTracker-Green 25 nM y una dilución 1:10,000 de 1 mg/ ml de rojo tiazina (#S570435, Sigma Aldrich) que, por lo demás, era idéntico al ACSF utilizado durante el período de recuperación. La viabilidad del corte se confirmó mediante imágenes de tejido en intervalos de tiempo. Las rebanadas se incubaron con LysoTracker-Green y Tiazine Red durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se tomaron imágenes de las regiones corticales del cerebro inmediatamente en la misma solución a 32 grados en un microscopio confocal Nikon A1 con un objetivo de 60X (NA 1.4) y el software NIS Elements para no más de 30 minutos.

Extracción de cerebro e inmunotransferencia.

Los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de xilazina (15 mg/kg) y ketamina (100mg/kg), perfundidos con solución salina tamponada con fosfato (1XPBS) con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (20ug/ml), leupeptina (0,5 ug/ml), ortovanadato de sodio (20 μM) y ditiotreitol (0,1 mM), seguido de extirpación del cerebro. Todos los tampones utilizados para la extracción de proteínas contenían un cóctel inhibidor de proteasa III (n.° 535140, Millipore) y un inhibidor Halt fosfatasa (n.° 78420, Thermo Fisher Scientific). Los tejidos del hemicerebro se pesaron y se homogeneizaron manualmente utilizando un homogeneizador Dounce 1:10 (p/v) en 1XPBS.

Después de la homogeneización, los lisados ​​se centrifugaron a 20,8{{10}}0 g durante 30 minutos a 4 grados. Se eliminó la fracción soluble (sobrenadante) y el sedimento se resuspendió pipeteando en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) [Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, octilfenoxipolietoxietanol al 1 % (IGEPAL), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, SDS al 0,1 % y 0,5 %. % desoxicolato de sodio a pH 8] incubar en hielo durante 30 minutos.

Las muestras se sonicaron (Misonix XL{{0}}) durante 20 segundos en hielo y luego se centrifugaron a 20.800 g durante 30 minutos a 4 grados. Se eliminó la fracción soluble en RIPA (sobrenadante) y el sedimento se resuspendió en guanidina 5 M (pH 8,0) para el análisis de proteínas insolubles. Cada muestra se sonicó durante 20 segundos en hielo, se hizo girar durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se centrifugó a 20.800 g durante 30 minutos a 4 grados. Se utilizó el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (n.º 23225, Thermo Fisher Scientific) para medir la concentración de proteína de cada muestra.

Para las transferencias Western, se cargaron 20 µg de proteína de cada muestra en geles NuPAGE (Invitrogen) al 4–12 % y se separaron utilizando tampón MOPS en condiciones reducidas y desnaturalizadas. Las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno y se revelaron utilizando Pierce ECL (quimioluminiscencia mejorada; Thermo Fisher Scientific). Las señales desarrolladas se visualizaron utilizando ProteinSimple FCR (FluorChem R) y las señales quimioluminiscentes posteriores se cuantificaron utilizando el software AlphaView (ProteinSimple). Todas las transferencias se analizaron utilizando la herramienta de corrección de fondo local, excepto la transferencia HDJ-2, que se analizó utilizando la herramienta Enlace de fondo junto con la corrección de fondo multirregional (software AlphaView).

A 42 ELISA

Para medir A 42 en homogeneizados de hemicerebro de ratones 5XFAD, se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) siguiendo las instrucciones del fabricante para analizar guanidina y A 42 soluble en PBS en hemicerebros. Para medir A 42 en el cerebro de ratones hAPP/PS1, se utilizó un ELISA disponible comercialmente (h amiloide 42 ELISA de alta sensibilidad, Te Genetics Company, Zurich, Suiza). El ELISA se realizó según el protocolo del fabricante.

Inmunofluorescencia del tejido cerebral de ratón

Después de la perfusión, se extrajeron los cerebros y se fijaron los hemicerebros en formalina al 10 % seguido de criopreservación en solución de sacarosa al 30 % en 1XPBS. Se utilizó un micrótomo deslizante congelado para recolectar secciones coronales o sagitales de 30-μm. Las secciones se colocaron en serie en una placa 12-pocillos en una solución crioprotectora (1xPBS, 30 % de sacarosa y 30 % de etilenglicol) y se almacenaron a -20 grados hasta su uso. La tinción por inmunofluorescencia se realizó lavando primero las secciones tres veces en 1XTBS y luego incubando las secciones en glicina 16 mM en 1XTBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados adicionales en 1XTBS, las secciones se bloquearon en suero de cabra al 5 % en Triton X-100 al 0,25 % en 1XTBS durante 2 horas a temperatura ambiente.

Luego, las secciones se incubaron durante la noche en anticuerpos primarios en una solución de 0.25 % de Triton X-100, 1 % de albúmina sérica bovina y 1XTBS a 4 grados. Luego se realizó una inmunotinción secundaria con anticuerpos secundarios de burro marcados con AlexaFluor a una concentración de 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). Se utilizó ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) para montar secciones antes de tomar imágenes en un microscopio de campo amplio Ti2 o en un microscopio confocal de escaneo láser Nikon A1 para la cuantificación de imágenes utilizando el software Nikon NIS Elements para la adquisición.

Todas las configuraciones de adquisición permanecieron iguales entre los genotipos y todas las imágenes se adquirieron dentro del mismo período de obtención de imágenes para experimentos individuales (Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad Northwestern y Centro de Imágenes Nikon).

Cuantificación de imágenes

Cerebros de ratón

La cuantificación por inmunofluorescencia de la inmunotinción del tejido cerebral de ratón se realizó en 3 a 5 secciones por animal, desde coordenadas Bregma de aproximadamente −0.94 a −2,55 mm, de las que se tomaron imágenes utilizando un objetivo de 10X en un microscopio de campo amplio Ti2. Los análisis de cuantificación, incluidos los umbrales de tamaño e intensidad, se realizaron utilizando el software Nikon NIS-Elements (Centro de imágenes Nikon de la Universidad Northwestern).

Dependiendo de la señal, se establecieron umbrales utilizando la herramienta de Análisis General según el tamaño, la forma y el contraste del objeto, y luego se crearon máscaras binarias para cada canal y región de interés. El umbral se realizó por separado en cada canal para aislar señales de interés optimizando la relación señal-ruido y eliminando señales de fondo no específicas. Para el cálculo del área cubierta de LAMP1, BACE1 o LysoTracker-Green, así como las mediciones de intensidad de fluorescencia de LAMP1 y Lysosensor en neuronas primarias, las regiones de interés se rastrearon manualmente utilizando NIS-Elements y se creó una capa binaria para cada región de interés.

Para calcular la proporción de LAMP1 a A 42, el área de LAMP1 en neuritas distróficas se normalizó al área de A 42 en cada placa individual y se cuantificaron las proporciones promedio por ratón entre los grupos de tratamiento. El análisis del coeficiente de correlación de Pearson para BACE1 y LAMP1 se realizó utilizando NIS-Elements por placa en proyecciones de intensidad máxima de imágenes de pila Z de 30 μm tomadas con un microscopio confocal de escaneo láser Nikon A1 con un tamaño de paso de 1 μm.

Para calcular la proporción de LysoTrackerGreen a Tiazine Red, el área de LysoTracker-Green en neuritas distróficas se normalizó con respecto al área de Tiazine Red en cada placa individual y se cuantificó la proporción promedio por ratón entre los grupos de tratamiento. Se utilizaron cuatro secciones coronales de las coordenadas Bregma de aproximadamente −1,70 a −2,55 mm para calcular el área o la intensidad de cada señal en cada región cerebral respectiva de cada ratón. El análisis del área cubierta de placa y del tamaño de la placa se realizó utilizando el promedio de cinco secciones por ratón de las coordenadas Bregma de aproximadamente −0,94 a −2,55 mm. La selección de secciones, la adquisición de imágenes, el rastreo de imágenes y las cuantificaciones fueron realizadas por una persona ciega a los grupos de tratamiento y genotipos.

Neuronas primarias

Para la cuantificación de la inmunotinción de LAMP1 en neuronas primarias de ratón fijadas, se rastrearon manualmente los somas en función de la morfología utilizando NIS-Elements y se creó una máscara binaria para cada región de interés y canal. Se utilizó el umbral para optimizar las señales de LAMP1 y distinguir LAMP1 en neuritas, incluidas dendritas y axones, aislando píxeles de LAMP1 positivos para píxeles de tubulina.

Las señales de LAMP1 del soma celular se excluyeron del área total de LAMP1 para analizar las vesículas de LAMP1 en las neuritas. Para el análisis de la motilidad de LysoTracker-Green en neuronas, las imágenes se cuantificaron utilizando NISElements. La velocidad y la distancia del total de partículas LysoTrackerGreen en cada cuadro se rastrearon utilizando la función de seguimiento de movimiento automatizado en NIS-Elements. Se estableció y aplicó un umbral a todas las películas según el tamaño y la intensidad de fluorescencia de las partículas LysoTracker-Green para eliminar el ruido de fondo.

Para la generación de quimógrafos, se realizaron imágenes de lapso de tiempo de neuronas individuales en un microscopio confocal de 60X y los axones se identificaron morfológicamente. El porcentaje de frecuencia de partículas que se mueven en dirección anterógrada o retrógrada, o estacionarias, se cuantificó dividiendo el número de partículas de cada grupo por el número total de partículas. Para los análisis quimográficos, se definió que las partículas en movimiento tenían una velocidad superior a 0,1 μM/seg.

análisis estadístico

Se utilizó el software GraphPad Prism v8 para realizar análisis estadísticos, incluido el análisis de varianza (ANOVA) con pruebas post hoc al comparar más de dos muestras y pruebas t no apareadas cuando solo se compararon dos muestras. Los detalles específicos de las pruebas, incluido el número de réplicas, el tipo de pruebas post hoc y los valores de P, se indican en las leyendas de las figuras. Todas las cuantificaciones se representan en la media ± SEM. Se concluyó significancia cuando el valor de P fue menor que 0.05, indicado por *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

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