El ayuno y la sobrealimentación afectan la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado de las aves de corral a través de retrovirus endógenos

ABSTRACTO

Se sabe que la nutrición y la inmunidad están relacionadas, pero el mecanismo no está muy claro. Los retrovirus endógenos (ERV) representan del 8 al 10% de los genomas humanos y de ratón y desempeñan un papel importante en algunos procesos biológicos de los animales. Estudios recientes indican que la activación de ERV puede afectar la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación, y las actividades de ERV están sujetas a la regulación de muchos factores, incluidos factores nutricionales. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el estado nutricional puede afectar la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación a través de ERV. Para verificar esta hipótesis, se alteró el estado nutricional de los animales mediante el ayuno o la sobrealimentación, y se modificó la expresión de ERV intactos (ERVK18P, ERVK25P) y genes relacionados con la inmunidad o la inflamación (DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7, STAT3) en el hígado. se determinó mediante PCR cuantitativa, seguida de la sobreexpresión de ERVK25P en hepatocitos primarios de ganso y la determinación de la expresión de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación. Los datos mostraron que, en comparación con el grupo de control (sin ayuno), la expresión de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación aumentó en el hígado de los pollos en ayunas, pero disminuyó en el hígado de los gansos en ayunas. Además, en comparación con el grupo de control (alimentado habitualmente), la expresión de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación aumentaron en el hígado de los gansos sobrealimentados. Además, la sobreexpresión de ERVK25P en hepatocitos primarios de ganso puede inducir la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación. En conclusión, estos hallazgos sugieren que el ERV media los efectos del ayuno y la sobrealimentación en la expresión de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación; la mediación varió según la especie de aves de corral, y el ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación pueden estar involucrados en el desarrollo del hígado graso de ganso. Este estudio proporciona un mecanismo potencial para la conexión entre nutrición e inmunidad.

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Palabras clave: nutrición, inmunidad, aves de corral, hígado graso, retrovirus endógeno

INTRODUCCIÓN

Los retrovirus endógenos (ERV) se consideran restos de retrovirus exógenos (provirus). La mayoría de estas secuencias 'fósiles' restantes contienen varias mutaciones que se han acumulado en el proceso de evolución a largo plazo desde su integración en los genomas del huésped (Cañadas et al., 2018). Existen en casi todos los animales mamíferos (como humanos, ratones, gatos y ovejas) y otros vertebrados (como los pollos) (Melanie y Nair, 2014; Xu et al., 2014). En el pollo, el ERV representa más del 3% del genoma del pollo (Huda et al., 2008). Aunque los ERV abundan en los genomas animales, muchos ERV no están intactos. Los ERV intactos se refieren a aquellos cuyas estructuras no se distinguen fácilmente de los retrovirus exógenos. Estos ERV generalmente contienen 2 repeticiones terminales largas (LTR) que tienen elementos para la regulación transcripcional, las secuencias codificantes de proteínas virales (antígeno específico de grupo [Gag], transcriptasa inversa [Pol] y proteína de la envoltura [Env]), secuencia de pistas de polipurina y secuencias genómicas cortas flanqueantes de sus células huésped (Jern y Coffin, 2008; Dolei et al., 2015; K€ury et al., 2018). Hasta el momento, hay alrededor de 500 ERV relativamente intactos que se encuentran en el genoma del pollo (Bolisetty et al., 2012). Además del ERV relativamente intacto, existen otros tipos de ERV, incluido el ERV "delgado" que carece de uno o más genes codificantes necesarios para la autorreplicación (generalmente el gen Env) y el ERV "solo LTR". El número de ERV 'solo LTR' es aproximadamente 60 veces el número de ERV relativamente intactos (Bolisetty et al., 2012). El análisis filogenético indica que los proretrovirus aviares (es decir, ERV) pueden clasificarse en proretrovirus de clase I (similares a gamma), clase II (similares a alfa y beta) y clase III (lejanamente parecidos a espuma). Los proretrovirus de tipo alfa son superados en número por los proretrovirus de tipo beta, gamma y alfabético (Bolisetty et al., 2012). En comparación con los proretrovirus de los mamíferos, los proretrovirus aviares son más heterogéneos. Los pro retrovirus tipo beta han experimentado una transición evolutiva de tipo beta a tipo alfabético y luego a pro retrovirus tipo alfa, con una pérdida gradual de marcadores retrovirales beta. Los proretrovirus alfabéticos son el intermediario entre los de tipo alfa y beta, incluidos algunos proretrovirus aviares reconocidos anteriormente. Los pro retrovirus de clase III parecen ser los más antiguos, seguidos por los pro retrovirus de tipo beta y gamma, mientras que los pro retrovirus de tipo alfabeto y alfa parecen ser los más jóvenes. La mayoría de los proretrovirus se integran en los genes del huésped en la orientación sensorial (Bolisetty et al., 2012).

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Al igual que los transposones que no son LTR (p. ej., elementos nucleares intercalados largos o cortos), los ERV son elementos móviles que pueden transponerse en forma de secuencias de ADN de una ubicación a otra en el genoma del huésped. Esta transposición está mediada por el intermediario ARN. Aunque los ERV como retrotransposones tienen una fuerte capacidad de transposición en la etapa inicial de la evolución, la mayoría de ellos ahora han perdido esta capacidad (Jern y Coffin, 2008). Además, estudios de secuenciación profundos indican que muchos ERV generalmente son silenciosos. Por ejemplo, solo alrededor del 20 % de los ERV se transcriben en fibroblastos de embriones de pollo, y un subconjunto de estos también se transcribe in vivo (Bolisetty et al., 2012). Además, estudios recientes muestran que algunos ERV silenciosos pueden activarse y expresarse bajo ciertas condiciones (Crichton et al., 2014), y su expresión se ve afectada por muchos factores, como el tipo de célula o el tipo de tejido (especialmente placenta y células germinales). , proceso de diferenciación celular y envejecimiento, citocinas, factores que alteran el funcionamiento normal de las células y factores nutricionales (Taruscio y Mantovani, 2004; Denner, 2016; Elaheh et al., 2018). En las últimas décadas, las funciones biológicas de ERV se han ido descubriendo gradualmente: 1) La transposición de ERV puede desestabilizar los genomas del huésped, pero el ERV como material genético original permite a los animales huéspedes aumentar la diversidad entre y dentro de las especies, mejorar la adaptabilidad al medio ambiente y mantener una continuidad. evolución (Zhang et al., 2008); 2) Los promotores y potenciadores en las regiones LTR de ERV pueden afectar la transcripción de sus genes adyacentes y alterar el estado epigenético de las regiones adyacentes (como la metilación del ADN y la modificación de histonas) (Thompson et al., 2016); 3) Al unir las proteínas Env a los receptores del huésped, ERV puede bloquear la unión de virus exógenos a los mismos receptores, proporcionando así a las células huésped la capacidad de resistir virus exógenos (Nadeau et al., 2015); 4) Los transcritos de ERV pueden activar el sistema inmunológico innato e inducir la producción de citocinas como IFN a través de la vía de señalización TLR3/MDA5 dependiente de ARN bicatenario, inhibiendo así los tumores (Chiappinelli et al., 2015); y 5) los ERV también están involucrados en la aparición y desarrollo de algunas enfermedades, como el envejecimiento, la autoinmunidad y las enfermedades neurológicas degenerativas (Mager y Stoye, 2015; Nadeau et al., 2015).

El retrovirus endógeno del grupo K (ERVK) es el endogenizado más recientemente entre los diferentes grupos de ERV (ERVW, ERVH, ERVK, etc.). Contiene la secuencia codificante de proteínas funcionales, por lo que se considera el grupo ERV más intacto y biológicamente activo (Hohn et al., 2013). La expresión aumentada de ERVK se ha asociado con enfermedades inflamatorias, enfermedades neurológicas, enfermedades autoinmunes, etc. (Haraguchi et al., 1992; Tolosa et al., 2012). Estudios recientes muestran que la activación de ERVK por el inhibidor de la ADN metiltransferasa, 5-aza-2-desoxicitidina, puede mejorar la inmunidad celular innata (Nogues et al., 2018). En comparación con el ERVK humano que tiene muchos miembros, el ERVK aviar solo tiene varios miembros anotados en GenBank. Los miembros ERVK anotados que comparten el pollo y el ganso son solo ERVK18P (LOC106029425) y ERVK25P (LOC106046236). En la actualidad, se desconoce el papel biológico o patológico del ERVK aviar. Los estados de nutrición y energía son factores importantes que afectan el crecimiento, la reproducción y la inmunidad de los animales. Como se mencionó anteriormente, los factores nutricionales pueden activar la expresión de ERV, y ERV puede regular la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación de múltiples maneras. Por lo tanto, especulamos que el nivel de nutrición o energía puede afectar la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación a través de ERV. Para verificar esta especulación, se modificó el estado nutricional mediante ayuno o sobrealimentación en pollos o gansos experimentales, y luego se determinó la expresión de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado. Además, también se realizó la sobreexpresión de ERVK25P en hepatocitos primarios de ganso para abordar la relación entre ERV y los genes relacionados con la inmunidad (o la inflamación). Este estudio proporciona una nueva visión del mecanismo de conexión entre nutrición e inmunidad.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Animales experimentales

Todos los protocolos con animales se ajustaron a las directrices institucionales sobre el uso de animales agrícolas en investigación y fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Yangzhou en China.

Los polluelos de Jurong Siji del mismo lote de incubación se criaron en el suelo bajo iluminación natural y manejo de cría convencional en la Granja Experimental de Mali (Jurong, Jiangsu, China). A la edad de 70 días, 16 gansos sanos se dividieron aleatoriamente en 2 grupos: el grupo en ayunas (los gansos ayunaron durante 24 h con libre acceso al agua) y el grupo de control (sin ayuno, acceso ad libitum a alimento y agua). Después de 24 h de ayuno, todos los individuos experimentales fueron sacrificados y se recogieron muestras de hígado, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se transfirieron a 270 C para su almacenamiento. De manera similar, se sacrificaron pollos Rhode Island Red sanos de 20-semanas de edad para un experimento de ayuno. En contraste con el ayuno, se dividieron al azar e igualmente gansos de las Landas de dieciséis 70-días de edad (proporcionados por Licheng Animal and Poultry Co., Ltd., Huaian, Jiangsu, China) en la sobrealimentación (24 días de sobrealimentación). y el grupo de control (alimentación habitual). El protocolo para la sobrealimentación fue descrito previamente por Geng et al., 2016a. El día 24 de sobrealimentación, se recogieron muestras de hígado tanto del grupo de control como del grupo de sobrealimentación y se almacenaron a 270 C.

Aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios de ganso y sobreexpresión de ERV

Los hepatocitos primarios de ganso se aislaron y cultivaron a partir de embriones de ganso el día 22 o 23 de la eclosión, como se describió anteriormente por Osman et al., 2016. El vector de sobreexpresión personalizado del gen de ganso LOC106046236 (o miembro de ERVK 25 Pol similar a la proteína, ERVK25P ) y el vector vacío se adquirieron en Suzhou Jima Gene Co., Ltd. (Suzhou, China). El vector de sobreexpresión se construyó utilizando un vector pcDNA3.1 que contenía un promotor de CMV y el fragmento de ADN insertado que era la secuencia codificante del gen de la polimerasa ERVK25. El vector de sobreexpresión y el vector vacío se transfectaron por separado en hepatocitos primarios de ganso que se habían aislado y cultivado durante 24 h con Lipofectamine 2000 (cat# 11,668-019, Invitrogen, Co., Ltd., Camarillo). Después de 32 h de transfección, las células se recogieron para el análisis de la expresión génica mediante PCR de fluorescencia cuantitativa. La transfección se realizó como lo describieron previamente Geng et al., 2013.

Purificación de ARN y síntesis de ADNc

El ARN total se aisló de muestras de hígado utilizando el kit TRIzol (n.º de catálogo DP424; Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd., Beijing, China). Las muestras de ARN purificadas se transcribieron de forma inversa en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa HiS criptTM Q RTSuperMix (n.º de cat. R123-01; Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). La transcripción inversa se realizó según las instrucciones del fabricante.

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Análisis cuantitativo por PCR

Con base en la secuencia de referencia de cada gen en GenBank, se diseñaron cebadores de PCR cuantitativos para los genes de interés y el gen de referencia interno, GAPDH, utilizando el software en línea Primer 3.0 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) y el La especificidad de la secuencia se confirmó utilizando el programa Primer-BLAST (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Bethesda) en el sitio web del NCBI. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 1. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la PCR cuantitativa se realizó utilizando el kit Vazyme AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (n.º de catálogo Q111-02/03; Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) y muestras de ADNc. La expresión relativa de los genes de interés se calculó utilizando el método 22OOCT como lo describieron previamente Geng et al., 2016b.

Análisis de inmunotransferencia

Las muestras de tejido hepático se lisaron en un tampón que contenía 50 mmol de Tris, pH 7,5, 120 mmol de NaCl, 1 mmol de EDTA, 15 mmol de Na4P2O7, 20 mmol de NaF, Nonidet al 1 %. , 0.1% fenilmetilsulfluoruro e inhibidores de proteasa (0.08 mmol de aprotinina, 0,02 mmol de leupeptina, 0,04 mmol de bestatina y 15 mmol de pepstatina). El contenido de proteínas en cada lisado se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad RC DC (n.º de catálogo 500-0119; Bio-Rad, Hercules) según las instrucciones del fabricante. Las proteínas (10 mg) de los lisados ​​tisulares se separaron mediante SDS PAGE y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, que se incubaron durante la noche en leche al 5 % en PBS que contenía Tween 20 al 0,1 %. Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpo primario durante la noche a 4 C. En este estudio se utilizaron los siguientes anticuerpos en una dilución 1:1000: anti-STAT3 (cat no. bs- 1141R; Beijing Biosynchronous Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), anti-IFIH1 (cat no. bs-18740R; Beijing Biosynchronous Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), anti-actina (cat no. bsm-33036M; Beijing Biosynchronous Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China) y anti-GAPDH (cat no. NB300-221; Novus Biologicals Co., Ltd., CO). Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante en una dilución de 1:10.000. Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada y el sistema de detección de transferencia Western (Amersham Biosciences, Beijing, China).

Análisis estadístico

Se utilizó la prueba t de Student para analizar la significación estadística de la diferencia en la expresión génica entre los grupos de tratamiento y control, y se estableció P,0.05 como criterio de significación estadística. Todos los datos se presentan como media 6 SEM.

RESULTADOS

El ayuno suprimió la expresión de ERV y los genes relacionados con el sistema inmunológico en el hígado de ganso

Los cebadores de PCR cuantitativos para genes ERV de ganso (ERVK18P o LOC1{{10}}6029425, ERVK25P o LOC106046236) se diseñaron basándose en las secuencias de referencia en GenBank. El análisis cuantitativo de PCR mostró que el nivel de expresión de ERVK18P en el hígado de ganso era similar al de ERVK25P (Figura 1A). En comparación con el grupo de control (sin ayuno), la expresión de ERVK18P y ERVK25P se inhibió significativamente en el hígado de los gansos en ayunas durante 24 h (P, 0,05 o 0,01) (Figura 1B). En consecuencia, la expresión de ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación (DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7, STAT3) también se inhibió, y la diferencia en la expresión de ARNm de DDX41 e IFNG entre los gansos en ayunas y los de control alcanzó un nivel estadísticamente significativo. (P, 0,05) (Figura 1B). El análisis de inmunotransferencia mostró que el nivel de proteína de IFIH1 en el hígado de los gansos en ayunas parecía ser más bajo que el de los gansos de control (Figura 1 complementaria).

Tabla 1. Lista de secuencias de cebadores para PCR cuantitativa.

El ayuno indujo la expresión de ERV y genes relacionados con el sistema inmunológico en el hígado de pollo

El análisis cuantitativo de PCR mostró que, en comparación con el grupo de control (sin ayuno), la expresión de ARNm de ERVK18P y ERVK25P inducida por el ayuno en el hígado de pollo, y la inducción alcanzó un nivel estadísticamente significativo (P, 0.{{5} }5 o 0.01) (Figura 2). De manera similar, el ayuno también indujo la expresión de ARNm de estos genes relacionados con la inmunidad o la inflamación, y la diferencia en la expresión de ARNm de IFIH1, IFNG, IRF7 y STAT3 entre los grupos alcanzó un nivel estadísticamente significativo (P, 0,05 o 0,01) (Figura 2). ). El análisis de inmunotransferencia mostró que el nivel de proteína de IFIH1 en el hígado de los gansos en ayunas parecía ser mayor que el de los gansos de control (Figura 1 complementaria).

La sobrealimentación indujo la expresión de ERV y genes relacionados con el sistema inmunológico en el hígado de ganso

El análisis cuantitativo de PCR mostró que, en comparación con el grupo de control (alimentación habitual), la expresión de ARNm de ERVK18P y ERVK25 P en el hígado de gansos sobrealimentados durante 24 días aumentó, y la diferencia en la expresión de ARNm de ERVK18P entre los gansos de control y sobrealimentados alcanzó a un nivel estadísticamente significativo (P, 0.05) (Figura 3). En consecuencia, la expresión de ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en los hígados de los gansos sobrealimentados también aumentó, y la diferencia en la expresión de ARNm de IRF7 entre los gansos de control y los sobrealimentados alcanzó un nivel estadísticamente significativo (P, 0,05) ( Figura 3). El análisis de inmunotransferencia mostró que el nivel de proteína de IFIH1 en el hígado de los gansos sobrealimentados parecía ser mayor que el de los gansos de control (Figura 1 complementaria).

Figura 1. La expresión de ERV y genes relacionados con el sistema inmunológico en el hígado de ganso se inhibió mediante el ayuno. La expresión relativa de ERV y genes relacionados con el sistema inmunológico se determinó mediante PCR cuantitativa. (A) La expresión de ERVK18P y ERVK25P en el hígado de ganso adulto normal. (B) La expresión de ERVK18P, ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 y STAT3 en los hígados de los gansos en ayunas se presenta como el cambio en veces sobre el control (sin ayuno), n 5 6. *,** denota P, 0.05, 0,01 frente al control, respectivamente. Todos los datos se muestran como media 6 SEM. Abreviatura: ERV, retrovirus endógeno.

La sobreexpresión de retrovirus endógenos indujo la expresión de genes relacionados con el sistema inmunológico

Después de 32 h de transfección de hepatocitos primarios de ganso con los vectores vacíos o los vectores de sobreexpresión que contienen la secuencia codificante del gen Pol de ganso ERVK25P, la expresión de ARNm del gen Pol en las células transfectadas con vectores de sobreexpresión fue aproximadamente 97 veces mayor que la en las células transfectadas con vectores vacíos (P, 0.01) (Figura 4). Como se esperaba, la expresión de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación fue inducida por la sobreexpresión de ERVK25P, y la inducción de IFIH1, IFNG, IRF7 y STAT3 alcanzó un nivel estadísticamente significativo (P, 0.05 o 0,01). (Figura 4).

DISCUSIÓN

Los niveles de nutrición y energía son factores importantes que afectan el crecimiento, la reproducción y la inmunidad de los animales. El hambre (o ayuno) y la alimentación son dos estados típicos que afectan los niveles de nutrición o energía, por lo que a menudo se utilizan como modelo de investigación para dilucidar la regulación de la nutrición o la energía en las funciones fisiológicas de los animales. Por ejemplo, el ayuno o la alimentación pueden influir en la expresión de genes relacionados con el crecimiento, la reproducción y la inmunidad (Volkoff et al., 2016; Smati et al., 2020). Sin embargo, no está claro si el ayuno o la alimentación pueden activar el ERV y afectar la expresión de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación a través del ERV. Además, la sobrealimentación a corto plazo (3-4 semanas) puede conducir a la formación de hígado graso de ganso (comúnmente conocido como foie gras), que es similar a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) en humanos y roedores (Nahum et al. , 2010; Wang et al., 2019), pero se desconoce si el ERV se activa con la sobrealimentación y participa en el desarrollo del hígado graso de ganso. En este estudio, se determinó la expresión de ERV y algunos genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado de gansos o pollos después de alterar la nutrición o el estado energético del animal mediante ayuno o sobrealimentación, de modo que la relación entre el estado nutricional (o energético) y Se podría aclarar la expresión de ERV y los genes relacionados con la inmunidad (o la inflamación). Además, también se realizó la sobreexpresión de ERVK25P en hepatocitos primarios de ganso para verificar si la expresión de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación se veía afectada por ERV. De hecho, los resultados proporcionaron pruebas sólidas que respaldan la idea de que el estado de los nutrientes o la energía podría regular la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación a través del ERV en las aves de corral. Curiosamente, el efecto del ayuno sobre la expresión de ARNm de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado variaba según la especie de aves de corral, es decir, la expresión de ARNm de los genes en el hígado de pollo era contraria a la del hígado de ganso. . Además, la expresión de ARNm de los genes en el hígado de los gansos en ayunas era contraria a la de los gansos sobrealimentados. Además, los datos sugieren que los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación pueden mediar en la regulación del ERV en el desarrollo del hígado graso de ganso (o foie gras).

Figura 2. La expresión de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado de pollo se indujo mediante el ayuno. La expresión relativa de ERV y genes relacionados con el sistema inmunológico se determinó mediante PCR cuantitativa. Los niveles de expresión de ERVK18P, ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 y STAT3 en los hígados de los pollos en ayunas se presentan como el cambio en veces sobre el control (sin ayuno), n {{10}} . *,** denota P, 0.05, 0,01 frente al control, respectivamente. Todos los datos se muestran como media 6 SEM. Abreviatura: ERV, retrovirus endógeno.

Figura 3. La expresión de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado de ganso fue inducida por sobrealimentación. La expresión relativa de ERV y genes relacionados con el sistema inmunológico se determinó mediante PCR cuantitativa. Los niveles de expresión de ERVK18P, ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 y STAT3 en los hígados de los gansos sobrealimentados se presentan como el cambio en el control (alimentación de rutina), n {{10}} . * denota P, 0,05 frente al control. Todos los datos se muestran como media 6 SEM. Abreviatura: ERV, retrovirus endógeno.

Figura 4. La expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación fue inducida por la sobreexpresión de ERV en hepatocitos primarios de ganso. La expresión relativa de ERV y genes relacionados con el sistema inmunológico se determinó mediante PCR cuantitativa. La expresión de ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 y STAT3 en los hepatocitos primarios de ganso transfectados con vectores de sobreexpresión de ERVK25P se presenta como el cambio en veces sobre el control (los hepatocitos transfectados con vectores vacíos), n {{1{{11 }}}}. *,** denota P, 0.05, 0,01 frente al control, respectivamente. Todos los datos se muestran como media 6 SEM. Abreviatura: ERV, retrovirus endógeno.

Estudios anteriores han demostrado que los ERV generalmente se silencian mediante la metilación del ADN en las células huésped, pero los ERV pueden activarse mediante MER48 (Walsh et al., 1998; Gibb et al., 2015). La inducción de ERV también se muestra en varias enfermedades, incluidas algunas enfermedades metabólicas como la esclerosis múltiple, en las que están implicados genes relacionados con la inmunidad o la inflamación (Perron et al., 2000). Los estudios mecanicistas indican que la inflamación juega un papel importante en la patogénesis de enfermedades metabólicas generalmente causadas por la nutrición o el exceso de energía (Eo et al., 2017). Además, se ha descubierto que el ayuno o la sobrealimentación pueden cambiar el nivel de metilación del ADN de los genes receptores activados por los proliferadores de peroxisomas (Jacobsen et al., 2014; Hjort et al., 2017). Según estos hallazgos, es posible que el cambio nutricional active la expresión de ARNm de ERV mediante regulación epigenética. Por otro lado, el cambio nutricional puede inducir la expresión de ARNm de algunos genes relacionados con la inmunidad o la inflamación (Smati et al., 2020). De acuerdo con estos hallazgos, este estudio demostró que el ayuno o la sobrealimentación afectaban la expresión del ARNm de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación y que la expresión del ARNm de ERV está estrechamente asociada con la expresión del ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación. genes.

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Como el ERV abunda en los genomas animales, se podría subestimar el papel del ERV en la regulación de la nutrición o la energía en la inmunidad o la inflamación. Este estudio abordó principalmente ERVK18 y ERVK25 que median el efecto del ayuno o la sobrealimentación en la expresión del ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación. Los genes ERVK actualmente son solo los ERV relativamente intactos anotados en los genomas de ganso y pollo. Además de estos ERV relativamente intactos, los ERV "delgados" y los ERV "solo LTR" podrían activarse mediante ayuno o sobrealimentación y, por tanto, también contribuir al efecto del ayuno o la sobrealimentación sobre la expresión del ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación. Como los ERV 'delgados' y 'LTR solo' generalmente se encuentran cerca de algunos genes del huésped (Thompson et al., 2016), el ayuno o la sobrealimentación pueden regular la expresión del ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación a través del efecto cis del ERV activado. Desde este punto de vista, el mantenimiento de la inmunidad en el nivel básico puede deberse en parte a una pequeña porción de ERV activo. Estudios anteriores han demostrado que algunos ERV se transcriben regularmente tanto en fibroblastos embrionarios de pollo (alrededor del 20% de los ERV) como in vivo (Bolisetty et al., 2012). La regulación del ayuno o la sobrealimentación sobre la expresión del ARNm de ERV se debe probablemente a modificaciones epigenéticas (p. ej., metilación del ADN), como se mencionó anteriormente. Se ha informado que la AZA, un inhibidor de la ADN metiltransferasa, puede inducir significativamente la expresión del ARNm de ERV en la célula (Jaenisch et al., 1985; Deborah y Bestor, 2004). La expresión de ARNm de ERV se reguló diferencialmente en el hígado de pollo frente al hígado de ganso en ayunas, lo que sugiere que existe un grado diferente de modificación epigenética para controlar la expresión de ERV entre pollos y gansos. Esta inferencia está respaldada por la evidencia que muestra que la expresión de ARNm de ERV depende del tipo de célula (Nogues et al., 2018). Sin embargo, aún queda por aclarar cómo el ayuno o la sobrealimentación afectan la metilación del ADN del ERV. Además, las diferencias genéticas entre pollos y gansos podrían contribuir a la diferencia en la expresión de ERV entre las 2 especies, como las diferentes respuestas de los factores de transcripción a estímulos internos o externos. De hecho, nuestros resultados anteriores muestran que la expresión de ARNm de muchos genes en el hígado graso de ganso versus el hígado normal es contraria a la de humanos (o ratones) con NAFLD versus hígado normal (Liu et al., 2016). Además, factores ambientales y de otro tipo, como la edad, la alimentación, la luz y otras condiciones de cría, también podrían ser responsables de la diferente expresión de ERV entre pollos y gansos.

En este estudio, la sobreexpresión de ERVK25P aumentó la expresión de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación, lo que proporciona pruebas sólidas que respaldan la idea de que el ayuno o la sobrealimentación regula la expresión del ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado a través de ERV. Hay dos mecanismos potenciales por los cuales la sobreexpresión del ERV relativamente intacto aumentó la expresión del ARNm de los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación: 1) el ARN bicatenario formado dentro de las transcripciones del ERV o mediante la hibridación con ARN antisentido podría activar la señalización de NFkB. vía sobre la unión del ARN bicatenario a sus receptores (p. ej., TLR3) y, a su vez, induce la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación (Chiappinelli et al., 2015); 2) el ERV relativamente intacto también puede expresar sus proteínas o polipéptidos codificados, lo que lleva a la activación de vías de señalización posteriores y a la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación. Aunque este estudio no pudo detectar la expresión de las proteínas ERVK18P y ERVK25P debido a la falta de anticuerpos adecuados, estudios previos han demostrado que algunos ERV, especialmente ERVK, pueden sintetizar sus proteínas e inducir la expresión de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en neuronas. células (Manghera et al., 2015). Estas proteínas pueden ser detectadas por receptores animales como RIG-1, proteína quinasa K y la molécula corporal inflamatoria NLRP3 (Mitoma et al., 2013; Mu et al., 2016). La asociación entre nutrición (o energía) e inmunidad (o inflamación) se ha demostrado en varios trastornos relacionados con la nutrición o la energía, especialmente en enfermedades asociadas a la obesidad, como la diabetes y la NAFLD. La obesidad se ha considerado una inflamación crónica, ya que muchos genes relacionados con la inflamación (p. ej., factor de necrosis tumoral alfa de citoquinas proinflamatorias, MCP1 e IL6) se inducen en pacientes con obesidad frente a cohortes sanas (Ferreira et al., 2016). Estas citocinas pueden provocar resistencia a la insulina y, por tanto, deteriorar los trastornos metabólicos asociados a la obesidad (Li et al., 2019). En este estudio, los datos mostraron que el ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación se indujeron en el hígado graso de ganso frente al hígado normal. El hígado es un órgano extremadamente complejo, que no sólo desempeña un papel central en la conversión de nutrientes y energía, sino que también tiene funciones de desintoxicación y regulación inmunológica. El hígado contiene una gran cantidad de células inmunitarias, como las células de Kupffer (los macrófagos residentes), las células asesinas naturales y las células T asesinas naturales. El hígado también sintetiza componentes del complemento y una gran cantidad de otros receptores de reconocimiento de patógenos solubles (Keith et al., 2007). Por lo tanto, el hígado se considera actualmente un órgano inmunológico importante y desempeña un papel en la inmunidad innata (o inflamación) (Xia et al., 2008; Trigger, 2010). El ERV y sus genes inducidos relacionados con la inmunidad o la inflamación pueden ser esenciales para las funciones fisiológicas del hígado y servir como vínculo entre el metabolismo nutricional y la inmunidad (o inflamación). En este estudio, aunque el cambio nutricional (o energético) indujo la expresión de ARNm de ERV y los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación en el hígado graso de ganso frente al hígado normal, cabe destacar que los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación inducidos por ERV La retroalimentación puede regular el metabolismo nutricional (Volkman y Stetson, 2014; Cañadas et al., 2018). Por lo tanto, este estudio proporciona alguna evidencia que respalda la idea de que ERV participa en el desarrollo del hígado graso de ganso a través de genes relacionados con la inmunidad o la inflamación.

Beneficios del suplemento cistanche: cómo fortalecer el sistema inmunológico

En este estudio, también determinamos el nivel de proteína de IFIH1 en los hígados de los gansos en ayunas versus los gansos de control, los pollos en ayunas versus los pollos de control y los gansos sobrealimentados versus los gansos de control. Aunque los patrones del nivel de proteína IFIH1 fueron similares a los del nivel de ARNm de IFIH1, la diferencia en el nivel de proteína entre los grupos de tratamiento y control no fue tan obvia como la del nivel de ARNm. Las posibles explicaciones incluyen que el nivel de proteína de IFIH1 podría regularse postranscripcionalmente. En conclusión, el estado nutricional o energético afecta la expresión de algunos genes relacionados con la inmunidad o la inflamación a través del ERV, lo que proporciona un mecanismo potencial subyacente a la asociación entre nutrición (o energía) e inmunidad (o inflamación). El estado nutricional o energético puede regular la expresión de ERV mediante la metilación del ADN. Existe una diferencia en esta regulación epigenética entre las especies de aves de corral y es necesario estudiar más a fondo el mecanismo específico. Los genes relacionados con la inmunidad o la inflamación afectados por la nutrición o el estado energético pueden no solo participar en la respuesta inmune innata sino que también desempeñan un papel en la inflamación, el crecimiento animal y la apoptosis, y la regulación por retroalimentación de la nutrición o el metabolismo energético. Además, este estudio también reveló por primera vez que los ERV y sus genes regulados relacionados con la inmunidad o la inflamación estaban implicados en el desarrollo del hígado graso de ganso.

REFERENCIAS

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