LIMIT es un LncRNA inmunogénico en inmunidad e inmunoterapia contra el cáncer

Abstracto

MHC-I presenta antígenos tumorales a las células T CD8+ y desencadena inmunidad antitumoral. Los humanos pueden tener 30,000-60,000 ARN no codificantes (lncRNA) de largo. Sin embargo, aún no se sabe bien si los lncRNA pueden afectar la inmunidad tumoral. Aquí, identificamos un LncRNA, capaz de inducir MHC-I e inmunogenicidad del tumor (LIMIT) en humanos y ratones. Descubrimos que el grupo de genes LIMIT estimulado por IFN y la proteína de unión a guanilato (GBP) activada por cis LIMIT, y los GBP interrumpieron la asociación entre HSP90 y el factor de choque térmico -1 (HSF1), lo que resultó en la activación de HSF1 y la transcripción de MHC-I. maquinaria, pero no PD-L1. La activación CRISPR guiada por ARN de LIMIT impulsó GBP y MHC-I, y potenció la inmunogenicidad tumoral y la terapia de puntos de control.

El silenciamiento de LIMIT, GBP y/o HSF1 disminuyó el MHC-I, deterioró la inmunidad antitumoral y redujo la eficacia de la inmunoterapia. Clínicamente, las transcripciones y proteínas de señalización LIMIT, GBP y HSF1- se correlacionaron con MHC-I, células T infiltrantes de tumores y respuesta de bloqueo de puntos de control en pacientes con cáncer. En conjunto, demostramos que LIMIT es un lncRNA inmunogénico contra el cáncer previamente desconocido y que el eje LIMIT-GBP-HSF1 puede ser objetivo de la inmunoterapia contra el cáncer.

Palabras clave 

ARN largo no codificante; LÍMITE; MHC-I; IFN; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; inmunidad de células T; inmunoterapia contra el cáncer

Introducción

El bloqueo de puntos de control libera el poder inmunológico mediado por células T CD8+ contra el cáncer1. El complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) desempeña un papel clave en el cebado y activación de las células T CD8+2. Sin embargo, el MHC-I frecuentemente está regulado negativamente en las células cancerosas, lo que resulta en evasión inmune del tumor y resistencia a la inmunoterapia3,4. Es importante comprender cómo recuperar la expresión del MHC-I tumoral y revitalizar la respuesta inmune antitumoral5. Los LncRNA están surgiendo rápidamente junto con el avance en la secuenciación profunda de ARN, cubriendo muchos más loci en el genoma humano que los genes codificadores de proteínas6. Los LncRNA regulan genes que codifican proteínas en múltiples niveles7-9 y desempeñan funciones fundamentales en la impresión genómica10, la diferenciación celular11 y la progresión del cáncer12. Sin embargo, aún se desconocen la identidad, el modo de acción, la función y la relevancia clínica de lncRNA específicos en la inmunidad contra el cáncer y la inmunoterapia. Aquí, identificamos LIMIT como un lncRNA inmunogénico contra el cáncer previamente desconocido. LIMIT afecta la maquinaria del MHC-I y la inmunidad antitumoral. Hemos descubierto que LIMIT se dirige localmente a las GBP, formando así una cascada molecular de LIMIT-GBP-HSF1-MHC para alterar la inmunidad antitumoral y la eficacia de la inmunoterapia tumoral. Nuestro trabajo no solo revela la biología previamente desconocida de un lncRNA inmunogénico, LIMIT, sino que también sugiere que el eje LIMIT-GBP-HSF1 puede ser objetivo de la inmunoterapia contra el cáncer.

LIMIT es un lncRNA inmunogénico

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Para explorar genes reguladores desconocidos en la inmunidad tumoral, basados ​​en la infiltración de células T CD8+ del tumor, dividimos el melanoma humano (TCGA, SKCM) en tipos de tumores fríos y calientes y analizamos las correlaciones de genes inmunogénicos. Además de las transcripciones de CD8A, IFN y MHC-I (HLA-ABC), encontramos que un candidato de lncRNA estaba enriquecido en el tumor caliente, entre 3926 candidatos de lncRNA anotados por GENCODE13 (Fig. 1a; Tabla complementaria 1). Con base en estudios funcionales en los siguientes experimentos, designamos este candidato de lncRNA como LÍMITE: lncRNA induciendo MHC-I e inmunogenicidad del tumor (LIMIT). En el conjunto de datos de melanoma humano, los niveles de LIMIT se correlacionaron positivamente con los de IFN, MHC-I y CD8 (Fig. 1b-d). De acuerdo con esto, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló que la expresión de LIMIT se correlacionaba con los genes de respuesta de IFN, la presentación de antígenos a través de MHC-I y la activación inmune (Fig. 1e-h). Además, los niveles de LIMIT se correlacionaron con tasas mejoradas de respuesta a la inmunoterapia de puntos de control 14-17 (Fig. 1i) y se asociaron con la supervivencia en pacientes con melanoma (Fig. 1j). Además, la expresión de LIMIT se correlacionó con IFN, MHC-I y CD8 en múltiples tipos de cáncer (Datos ampliados, figuras 1a-l). Por lo tanto, LIMIT es un lncRNA potencialmente inmunogénico.

Validamos si LIMIT es un lncRNA. La transferencia Northern mostró que LIMIT tenía aproximadamente 2 kb de longitud en células de melanoma humano A375 (Fig. 1k). Aplicamos una amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) y caracterizamos los extremos del ADNc de LIMIT en células de melanoma tanto humanas (A375) como de ratón (B16) (Fig. 1l, m). A continuación, clonamos la longitud completa de LIMIT tanto en humanos como en ratones y lo alineamos con las secuencias del genoma correspondientes (Datos ampliados, Fig. 2a, b). El LIMIT humano se ubicó en el cromosoma 1, con 1967 nucleótidos y 6 exones (Datos extendidos, Fig. 2a), mientras que el Límite del ratón se ubicó en el cromosoma 3, con 1634 nucleótidos y 7 exones (Datos extendidos, Fig. 2b). LIMIT no contenía una secuencia Kozak válida. Cuando preparamos ARN a partir de fracciones nucleares y citoplasmáticas de células A375, LIMIT se detectó principalmente en la fracción nuclear (Fig. 1n). Por tanto, LIMIT no tiene potencial de codificación de proteínas. En conjunto, LIMIT cumple con todos los criterios para ser definido como un lncRNA. En particular, en el locus LIMIT, un candidato de ARNc, se encontró un pseudogén de GBP1 (GBP1P1) en el carcinoma hepatocelular (CHC)18. Sin embargo, LIMIT mostró pocas similitudes con GBP1P1 o GBP1 (Datos ampliados, figura 2c, tabla complementaria 2). Por lo tanto, LIMIT no es GBP1P1. Una alta correlación entre la firma genética sensible a LIMIT y IFN (Fig. 1e) sugiere que IFN puede estimular la expresión de LIMIT. De hecho, el tratamiento con IFN indujo la expresión de LIMIT, como lo muestra la transferencia Northern (Fig. 1k) y RNA-seq en células A375, HT29, Meijuso y A549 (Fig. 1o). Sin embargo, el tratamiento con otras citocinas, como IFN y TNF, no logró inducir la expresión de LIMIT (Fig. 1k). Además, el IFN no logró inducir LIMIT en las células A375 knockout (KO) de STAT1 (Fig. 1p). Por lo tanto, LIMIT es un lncRNA sensible a IFN previamente desconocido en células humanas y de ratón.

LIMIT aumenta la expresión de MHC-I

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Para estudiar la función de LIMIT en las células tumorales, primero eliminamos LIMIT con pequeños ARN en forma de horquilla (shLIMIT). Empleamos la herramienta Blast para seleccionar LIMIT shRNA que no tienen candidatos fuera del objetivo (Tablas complementarias 3-6). ShLIMIT no se dirigió a los genes codificantes de GBP (Datos ampliados, figura 3a). En las células A375, shLIMIT suprimió la expresión de LIMIT (Fig. 2a), pero no afectó la fosforilación de STAT1 (Fig. 2b) en respuesta al IFN, lo que sugiere que LIMIT no afectó la señalización global del gen IFN. MHC-I y PD-L1 son genes diana de IFN19-21. ShLIMIT provocó una disminución en la expresión de MHC-I (Fig. 2c), pero no de PD-L1 (Datos ampliados, Fig. 3b), en respuesta a la estimulación con IFN. De acuerdo con estos datos en humanos, el límite de silenciamiento en células de melanoma murino YUMM1.7 o células de cáncer de colon CT26 resultó en una expresión reducida de MHC-I en respuesta al IFN (Fig. 2d-g). En las células A375, shLIMIT afectó no solo la expresión de MHC-I (HLA-ABC, HLA-E y HLA-F) sino también la expresión de MHC-II (HLA-DRA y HLA-DMA); mientras que LIMIT no alteró la expresión de otros genes de señalización de IFN (Datos ampliados, Fig. 3c). Por tanto, LIMIT participa en la regulación de la expresión de MHC-I y MHC-II inducida por IFN sin alterar la vía de señalización global de IFN.

LIMIT es un gen interrumpido con intrones grandes que ocupa alrededor de 17 kb en el genoma. No pudimos eliminar el locus LIMIT con sgRNA emparejados y Cas9. Dado que hay 5 sitios de unión STAT1/IRF1 predichos en el promotor LIMIT, diseñamos 4 sgRNA emparejados para eliminar estos sitios de unión en el promotor LIMIT (Datos ampliados, figura 3d). Generamos células A375 con la eliminación del promotor LIMIT en las 4 combinaciones de sgRNA. Descubrimos que el IFN ya no era eficaz para inducir la expresión de LIMIT y MHC-I en células tumorales con eliminación del promotor LIMIT en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. 2h, i). Además, empleamos un sistema de activación CRISPR guiado por ARN para activar la expresión límite en células tumorales22. Establecimos 4 ARN guía dirigidos a la región promotora de Límite (sgLimit) y los coexpresamos con dCas9-VPR, un activador transcripcional tripartito fusionado con Cas9 nulo a nucleasa, en células B16 (Datos ampliados, figura 4a). Los 4 sgLimit mejoraron la expresión de Limit, así como MHC-I (Datos ampliados, Fig. 4b, c). Cuando transfectamos células B16 con sgLimit agrupados y sgRNA no dirigidos (sgNT), sgLimit indujo la expresión de Limit y MHC-I, pero no de PD-L1 (Fig. 2j, k). Por lo tanto, Limit se dirige selectivamente al MHC-I, pero no al PD-L1. En conjunto, los experimentos de pérdida y ganancia de función demuestran que LIMIT puede alterar 1,{37}} veces la expresión de MHC-I en múltiples células cancerosas en ratones y humanos. A continuación, investigamos si la expresión de MHC-I alterada por LIMIT afecta la destrucción de tumores mediada por células T CD8+ específicas de TAA in vitro. Con este fin, primero eliminamos genéticamente B2M con shRNA específicos en ovoalbúmina (OVA)--que expresan células B16. shRNA-B2M resultó en una reducción de 1,5- veces en la expresión de OVA-H2Kb (Datos ampliados, figura 4d). Cuando las células B16-OVA que portaban shFluc y shB2M se incubaron con células OT-I, observamos una disminución en la destrucción de células shB2M-B16-OVA mediada por OT-I en comparación con shFluc-B{{63 }}Células OVA (Datos ampliados Fig. 4e-g). Los datos sugieren que los cambios de 1,5-3-veces en la expresión de MHC-I controlada por LIMIT podrían ser funcionalmente relevantes para afectar las actividades de CTL específicas de TAA. Para validar esto, activamos LIMIT en células B16-OVA que expresan goma laca y shB2M. Como se esperaba, la activación CRISPR de LIMIT indujo una expresión mínima de MHC-I en células shB2M, en comparación con las células de control (Fig. 2l). En consecuencia, las células OT-I mediaron una destrucción mínima de tumores en células shB2M-OVA-B16 en comparación con las células de control (Fig. 2m, n). Los datos sugieren que la expresión de MHC-I inducida por LIMIT es importante en la activación y función de las células T específicas de TAA. Las células presentadoras de antígenos (APC), incluidos los macrófagos y las células dendríticas (DC), expresan MHC-I, presentan antígenos y activan las células T específicas de TAA. Ampliamos nuestros estudios de células tumorales a APC. IFN estimuló potentemente la expresión límite en células dendríticas y macrófagos derivados de la médula ósea (Datos ampliados, Fig. 4h, i). Transfectamos macrófagos con límite de focalización de ARNip marcado con 5'FAM (siLIMIT). Derribar LIMIT resultó en una menor expresión de MHC-I en respuesta a la estimulación de IFN, en comparación con el control (Datos ampliados, Fig. 4j, k). Por lo tanto, LIMIT es un lncRNA sensible a IFN y puede promover la expresión de MHC-I tanto en células tumorales como en APC.

LIMIT mejora la inmunidad antitumoral

Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral

La expresión insuficiente de MHC-I confiere evasión inmune del tumor y resistencia a la inmunoterapia3. Para comprender el papel de Limit en las respuestas inmunes antitumorales in vivo, inoculamos células tumorales YUMM1.7 de control (shFluc) y de silenciamiento de límite (shLimit) en NOD scid c-deficiente (NSG, inmunodeficiente) y C57BL/6 de tipo salvaje. ratones (inmune competentes). En comparación con los tumores de control, los tumores shLimit YUMM1.7 crecieron de manera comparable en ratones NSG (Fig. 3a), mientras que progresaron más rápido en ratones de tipo salvaje (Fig. 3b). Además, inoculamos tumores shLimit CT26 en ratones BALB/c de tipo salvaje. Nuevamente, el límite de silenciamiento resultó en un mayor crecimiento del tumor CT26 en el modelo inmunocompetente (Fig. 3c). Los datos sugieren que el límite de silenciamiento puede afectar la inmunidad antitumoral y facilitar el crecimiento del tumor de una manera inmunodependiente. En apoyo de esto, detectamos una reducción de células T CD3+, IFN + y TNF + en los tumores shLimit YUMM1.7 (Fig. 3d, e). En conjunto, silenciar a Limit perjudica la inmunidad antitumoral. Para determinar la expresión de MHC-I y MHC-I:SIINFEKL in vivo, establecimos células YUMM1.7 que expresan de manera estable OVA (YUMM1.7-OVA) y las transducimos con shRNA dirigido a Limit o Fluc. Después del tratamiento con IFN, detectamos una expresión superficial reducida de OVA-H2Kb en células shLimit-YUMM1.7 (Datos ampliados, figura 5a). Inoculamos células shLimit YUMM1.7-OVA y células shFluc-YUMM1.7-OVA en ratones C57BL/6. Luego, diseccionamos tejidos tumorales y detectamos la expresión de H2Db y OVA-H2Kb en células tumorales. Observamos una reducción de H2Db y OVA-H2Kb en células shLimit-YUMM1.7-OVA en comparación con las células de control (Datos ampliados, figuras 5b-f). Los datos indican que Limit puede afectar MHC-I y MHC-I: expresión de antígenos in vivo. Además, inoculamos células B16 de control (sgNT) y de activación de límite (sgLimit) en ratones C57/BL6 de tipo salvaje. Como se esperaba, sgLimit (activación de límite) redujo drásticamente el crecimiento del tumor (Fig. 3f). Esto estuvo acompañado por un aumento en el número y activación de células T infiltrantes de tumores (Fig. 3g, h). El melanoma B16 es un modelo tumoral relativamente insensible al bloqueo de PD-L123. De acuerdo con esto, el bloqueo de PD-L1 no logró controlar el crecimiento del tumor sgNT B16 en ratones. Curiosamente, limite la activación en el tumor B16 con sg Limite la respuesta tumoral sensibilizada al bloqueo de PD-L1, como lo muestra la reducción de la progresión del tumor (Fig. 3i). En conjunto, Limit potencia la inmunidad tumoral y sensibiliza la respuesta de inmunoterapia tumoral.

LIMIT cis activa las GBP para estimular el MHC-I y la inmunidad tumoral

A continuación, exploramos cómo LIMIT afecta el MHC-I y la inmunidad tumoral. Los LncRNA pueden regular localmente la expresión de genes vecinos24. LIMIT se localiza estrechamente en un grupo de genes, las proteínas de unión a guanilato (GBP), tanto en el genoma humano como en el de ratón (Datos ampliados, Fig. 2a, b). Preguntamos si LIMIT podría regular la expresión de las libras esterlinas. El silenciamiento de LIMIT redujo los niveles de ARNm de GBP precursores y maduros (Fig. 4a) y proteínas GBP1-5 (Fig. 4b) en células A375 humanas en respuesta al tratamiento con IFN. Los datos sugieren que LIMIT puede promover la transcripción de GBP en cis. En apoyo de esta posibilidad, el silenciamiento Limit también disminuyó la expresión de Gbp2 en células YUMM1.7 y CT26 de ratón (Datos ampliados, Fig. 6a, b). Además, la activación CRISPR de Limit indujo la expresión de Gbp2 en células B16 (Fig. 4c). Para probar si LIMIT podría transregular las GBP, forzamos la expresión del ADNc de LIMIT en células A375. Descubrimos que GBP1 y múltiples factores inmunes (incluidos IRF1, HLA-ABC y PD-L1) no se vieron alterados por la sobreexpresión de LIMIT (Datos ampliados, figura 6c). Por tanto, LIMIT es un lncRNA de acción cis capaz de inducir la expresión de GBP. Entre los miembros de la familia Gbp, Gbp2 es un miembro de la familia Gbp predominante en células de ratón (Datos ampliados, figura 6d). Para probar si LIMIT puede regular el MHC-I a través de GBP, establecimos células YUMM1.7 estables que portan goma laca, shLimit, shGbp2 o shLimit más shGbp2. Descubrimos que en respuesta a la estimulación con IFN, shLimit y shGbp2 condujeron a una disminución comparable en la expresión de Gbp2 y MHC-I; El silenciamiento simultáneo de Limit y Gbp2 no logró alterar adicionalmente la expresión de Gbp2 y MHC-I (Fig. 4d, e). Además, nos preguntamos si la sobreexpresión de GBP podría rescatar la expresión de MHC-I regulada a la baja en Limit derribando las células tumorales. Forzamos la expresión de GBP1 en células shLIMIT A375 (GBP1OE) y tratamos estas células con IFN. Observamos que shLIMIT dio como resultado una expresión reducida de MHC-I en las células de control, pero no en las células GBP1OE (Datos ampliados, figura 6e). La expresión de PD-L1 e IRF1 no se vio afectada por shLIMIT o GBP1OE (Datos ampliados, Fig. 6e, f). Por lo tanto, Limit puede regular la expresión de MHC-I de manera dependiente de GBP. A continuación, inoculamos células YUMM1.7 con silenciamiento Limit y/o Gbp2-en ratones C57BL/6. El silenciamiento de Limit y el silenciamiento de GBP dieron como resultado de manera similar un crecimiento tumoral más rápido en comparación con el grupo de control, mientras que el silenciamiento simultáneo de LIMIT y GBP no afectó aún más la progresión del tumor (Fig. 4f). Además, detectamos una disminución en el número de células T infiltrantes de tumores y activación en tumores shLimit, tumores shGbp2 y tumores shLimit más shGbp2 (Fig. 4g y Datos ampliados Fig. 6g). Juntos, LIMIT aumenta la expresión de MHC-I y la inmunidad tumoral de una manera dependiente de GBP. Los GBP son genes que responden al IFN en fibroblastos25 y macrófagos26 en el contexto de la defensa del huésped contra patógenos. Sin embargo, se desconoce el papel de las GBP en la inmunidad al cáncer. Dado que el silenciamiento de las GBP redujo la expresión de MHC-I y la activación de las células T CD8+ (Fig. 4g y Datos ampliados, Fig. 6g), planteamos la hipótesis de que las GBP podrían afectar la eficacia de la inmunoterapia contra el cáncer. Para probar esta hipótesis, silenciamos Gbp2 en células MC38, un modelo de tumor sensible a la inmunoterapia23. Como se esperaba, silenciar Gbp2 en células MC38 redujo la expresión de MHC-I tras el tratamiento con IFN (Fig. 4h) y anuló en gran medida la eficacia del bloqueo de PD-L1 (Fig. 4i). Esto, junto con los datos antes mencionados, sugiere la participación de LIMIT y GBP en el control de la eficacia de la inmunoterapia contra el cáncer. En apoyo de esta posibilidad, el análisis de datos clínicos reveló que los niveles altos de expresión de GBP se correlacionaban con LIMIT, la expresión de MHC-I y la respuesta a la inmunoterapia (Datos ampliados, figuras 6h-j) en pacientes con melanoma14-17. Además, los niveles de expresión de GBP se asociaron positivamente con la supervivencia del paciente (Datos ampliados, figura 6k). Para validar si los GBP son genes que responden al IFN en las células cancerosas, estimulamos las células A375 con IFN y otras citoquinas. Las GBP fueron inducidas por IFN, pero se vieron mínimamente afectadas por otras citoquinas inmunes (Fig. 4j). A continuación, utilizamos el sistema CRISPR-Cas9 para apuntar a las secuencias compartidas entre GBP1-5 y generamos células GBP1-5 knockout (KO) A375 (Fig. 4k). Observamos que el IFN estimulaba mal las transcripciones de la maquinaria del gen MHC-I (Fig. 4l) y las proteínas HLA-ABC de superficie en células GBP KO A375 (Fig. 4m). Por lo tanto, LIMIT cis activa las GBP para estimular la maquinaria del MHC-I y la inmunidad tumoral.

Los GBP activan HSF1 para estimular el MHC-I y la inmunidad tumoral

Para demostrar cómo las GBP pueden regular la expresión de MHC-I y la inmunidad tumoral, forzamos la expresión de GBP en células A375. Curiosamente, la sobreexpresión de GBP aumentó la expresión de MHC-I humano, como lo muestra la qRT-PCR (Fig. 5a), la tinción de la superficie de la membrana (Fig. 5b) y la transferencia Western (Fig. 5c). Los datos sugieren que las GBP pueden activar el MHC-I a nivel transcripcional. Consistentemente, la sobreexpresión de Gbp2 aumentó la expresión de MHC-I de ratón en células YUMM1.7 y B16 (Fig. 5d). Para identificar los factores de transcripción que regulan el MHC-I a través de GBP en respuesta al IFN, realizamos una predicción bioinformática con PROMO27. Encontramos 8 factores de transcripción alterados por IFN en células A375, que pueden apuntar a HLA-ABC, HSPA5, CALR y TAP1. Además de varios factores bien conocidos, la actividad de HSF1 fue altamente inducida por IFN (Datos ampliados, Fig. 7a). Al procesar conjuntos de datos de ChIP-seq en ENCODE28, encontramos que tanto STAT1 como HSF1 estaban enriquecidos en los promotores de genes asociados a MHC-I con diferentes patrones de unión (Datos ampliados, figura 7b). Realizamos un ensayo de ChIP con anticuerpo anti-HSF1 en células A375 estimuladas con IFN. HSF1 se enriqueció en los promotores de HLA-ABC, HSPA5, CALR y TAP1, pero no en HPRT1, un control negativo (Fig. 5e). Los resultados sugieren que HSF1 es un factor de transcripción del MHC-I. HSF1 suele activarse mediante la interrupción de la proteostasis29. Para probar si la activación de HSF1 mejorará la expresión de MHC-I, tratamos las células A375 con una lista de factores estresantes30: choque térmico, estrés oxidativo (Luperox), inhibidores de la traducción (puromicina), proteasoma (MG-132) y acompañante (17-AAG). Curiosamente, estos factores estresantes estimularon universalmente la expresión de MHC-I, mientras que KRIBB11, un inhibidor de HSF1, redujo este efecto (Fig. 5f y Datos ampliados Fig. 7c). Por tanto, la activación de HSF1 generalmente induce la expresión de MHC-I. A continuación nos preguntamos si las libras esterlinas podrían activar el HSF1. La expresión forzada de GBP indujo la actividad luciferasa del indicador HSE-Luc de HSF1 (Fig. 5g), así como la fosforilación de HSF1 (Fig. 5h). Esto sugiere que las libras esterlinas podrían activar HSF1. El IFN no logró inducir la expresión de HSPA5 en células GBP-KO A375 (Fig. 5i). Por tanto, el IFN activa HSF1 al inducir la expresión de GBP. Además, el tratamiento con KRIBB11, un inhibidor de HSF1, anuló la regulación positiva de MHC-I mediada por la sobreexpresión de GBP1 (Fig. 5j). Por lo tanto, las GBP estimulan la expresión de MHC-I de manera dependiente de HSF1-. Para solidificar la relación mecanicista entre GBP y HSF1, silenciamos Gbp2 y/o Hsf1 en células MC38 (Fig. 5k). Tras el tratamiento con IFN, el silenciamiento de Gbp2 o Hsf1 solo disminuyó la expresión de MHC-I, pero el silenciamiento simultáneo de Gbp2 y Hsf1 no logró modular adicionalmente la expresión de MHC-I (Fig. 5l). Para demostrar la relevancia funcional de la interacción entre GBP y HSF1 en la inmunidad tumoral, inoculamos células tumorales MC38 que expresan goma laca, shGbp2, shHSF1 o shGbp2 más shHSF1 en ratones C57BL/6. En comparación con los controles de shFluc, silenciar Gbp2 y silenciar Hsf1 aceleró de manera comparable el crecimiento tumoral (Fig. 5m) y disminuyó el número y la activación de células T infiltrantes de tumores (Fig. 5n y Datos ampliados, Fig. 7d). Además, el silenciamiento simultáneo de Gbp2 y Hsf1 no logró afectar aún más el crecimiento del tumor y las células T que se infiltran en el tumor (Fig. 5m, n y Datos ampliados, Fig. 7d). En conjunto, las GBP estimulan la expresión de MHC-I y la inmunidad antitumoral activando HSF1.

El eje LIMIT-GBP-HSF1 impulsa el MHC-I y la inmunidad tumoral

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A continuación, examinamos cómo las GBP activan HSF1 para alterar la expresión de MHC-I y la inmunidad tumoral. En condiciones normales, el HSF1 monomérico está asociado y suprimido por chaperonas, como HSP9031. La interrupción de su interacción permite la trimerización y acumulación de HSF1 en el núcleo, lo que resulta en la activación transcripcional de sus genes diana32. Nuestra hipótesis es que las GBP pueden alterar la asociación entre HSP90 y HSF1, lo que resulta en la activación de HSF1. Para probar esta posibilidad, tratamos células A375 con IFN y realizamos Co-IP con un anticuerpo HSP90. Descubrimos que las GBP endógenas inducidas por IFN estaban asociadas con HSP90 (Fig. 6a). Además, transfectamos células A375 con Flag-GBP1 exógeno y realizamos el experimento Co-IP con Flag-anticuerpo. Se detectó HSP90 en el producto IP de células transfectadas con Flag-GBP1, pero no en células de control transfectadas con vector (Fig. 6b). La tinción por inmunofluorescencia demostró que las GBP y HSP90 estaban localizadas en gran medida en el citoplasma (Fig. 6c). Cuando transfectamos células 293T con dosis crecientes de plásmidos GBP1, el HSF1 asociado a HSP 90- se redujo de manera dependiente de la dosis (Fig. 6d). Los datos sugieren que los GBP interactuaron con HSP90 y esta interacción interrumpió la asociación entre HSF1 y HSP90. HSP90 es un chaperona para el plegamiento y la estabilidad de múltiples proteínas, nos preguntamos si las GBP pueden alterar la actividad chaperona de HSP90. Aunque el inhibidor de HSP90 suprimió la expresión de las proteínas cliente de HSP90 (como RAF1, BCL2 y CDK433), la sobreexpresión de GBP no logró hacerlo (Fig. 6e). Por lo tanto, las GBP interactúan con HSP90 y liberan HSF1 asociado a HSP90-, pero no alteran la actividad de HSP90. Luego, examinamos directamente el papel de HSF1 en la expresión de MHC-I. Tratamos células A375 con IFN en presencia del inhibidor de HSF1 KRIBB11. Como se esperaba, el tratamiento con KRIBB11 redujo la expresión de ARNm estimulada por IFN de genes relacionados con MHC-I, incluidos HLA-ABC, TAP1, HSPA5 y CALR, pero no IRF1 (Fig. 6f). Curiosamente, KRIBB11 redujo la expresión de MHC-I inducida por IFN, pero tuvo un efecto mínimo sobre la expresión de PD-L1 (Fig. 6g). Por tanto, HSF1 puede regular la expresión de MHC-I inducida por IFN sin alterar la señalización global de IFN. Para investigar si el MHC-I regulado por HSF1-era funcional, cultivamos B16-OVA con células OT-I en presencia de KRIBB11 e IFN. KRIBB11 inhibió la expresión inducida por IFN de MHC-I unido a OVA (Datos ampliados, figura 8a). De acuerdo con esto, KRIBB11 también suprimió los efectos citotóxicos mediados por células OT-I en B16-OVA (Datos ampliados, figura 8b). Para ampliar nuestras observaciones a tumores adicionales, silenciamos Hsf1 con shHsf1 en células YUMM1.7 y CT26. El silenciamiento de Hsf1 resultó en una disminución de la expresión de MHC-I en células YUMM1.7 (Fig. 6h, i) y CT26 (Datos ampliados, Fig. 8c) en respuesta a la estimulación con IFN. En las células YUMM1.7, el silenciamiento de HSF1 no logró afectar la expresión de Gbp2 en respuesta al IFN (Fig. 6h), lo que indica que Gbp2 no es un gen diana de HSF1. En las células shHsf1 YUMM1.7, KRIBB11 no logró suprimir la expresión de MHC-I estimulada por IFN (Datos ampliados, figura 8d). Los datos sugieren que HSF1 mejoró la expresión de MHC-I en respuesta al IFN, y que Hsf1 es el objetivo mecánico de KRIBB11 para regular el MHC-I. Dado que HSF1 afectó la expresión de MHC-I, planteamos la hipótesis de que HSF1 regulaba la inmunidad antitumoral in vivo. Para probar esta hipótesis, inoculamos células tumorales control y shHsf1 YUMM1.7 en ratones NSG y C57BL/6. Observamos que el silenciamiento de HSF1 ralentizó parcialmente la progresión del tumor YUMM1.7 en ratones NSG (Fig. 6j), lo que respalda que Hsf1 ayudó a mantener la homeostasis de las proteínas y la progresión del tumor en el modelo inmunodeficiente. Sin embargo, silenciar Hsf1 aceleró drásticamente el crecimiento del tumor YUMM1.7 en ratones C57BL/6 de tipo salvaje (Fig. 6k). Los datos indican que Hsf1 puede sorprendentemente promover una potente inmunidad antitumoral en el modelo inmunocompetente. En apoyo de esto, detectamos una reducción de los porcentajes de células T CD3+, Ki67+, IFN + y TNF + infiltrantes de tumores (Fig. 6l y Datos ampliados Fig. 8e) en los tumores shHsf1 YUMM1.7 en comparación con los controles codificados de shFluc. Además, inoculamos células shHsf1 CT26 en ratones BALB/c de tipo salvaje. Nuevamente, el silenciamiento de Hsf1 resultó en un mayor crecimiento del tumor CT26 (Datos ampliados, figura 8f). Esto estuvo acompañado por una reducción de los porcentajes de células T CD3+, Ki67+, IFN+ y TNF+ infiltrantes de tumores (Datos ampliados, Fig. 8g, h). En conjunto, los datos sugieren que el eje GBP-HSF1 impulsa la expresión de MHC-I y la inmunidad antitumoral. Para conectar mecánicamente Hsf1 y LIMIT, silenciamos LIMIT en las celdas A375. El silenciamiento de LIMIT redujo la actividad transcripcional de HSF1 en respuesta a IFN, según lo determinado por el ensayo indicador de luciferasa (HSE-luc) (Fig. 6m). Los datos sugieren que LIMIT contribuye a la activación de HSF1 en respuesta al IFN. Para probar una posible participación de HSF1 en la inducción de MHC-I mediada por LIMIT, estimulamos LIMIT mediante la activación CRISPR en células B16, en presencia de KRIBB11. Observamos que la regulación positiva de MHC-I, inducida por la activación LIMIT, fue anulada por un inhibidor de HSF1 (Fig. 6n). Los datos sugieren que LIMIT aumenta la expresión de MHC-I de manera dependiente de HSF1-. Finalmente, analizamos un vínculo entre LIMIT, GBP y HSF1 en el contexto de la expresión de MHC-I, la inmunidad tumoral y la inmunoterapia en pacientes con cáncer. El análisis clínico mostró que los genes de señalización de HSF1-se correlacionaban con la expresión de MHC-I, la infiltración de células T CD8+ y la supervivencia del paciente (Datos ampliados, figuras 9a-c). En un estudio de bloqueo de puntos de control inmunológico en pacientes con carcinoma de células basales34, el análisis de secuenciación de ARN unicelular reveló 2 grupos de tumores; un grupo de tumores fue más sensible al tratamiento anti-PD-1, como lo demuestra una población de tumores muy reducida (Datos ampliados, figura 9d). Curiosamente, este grupo de tumores sensibles a puntos de control inmunológico expresó niveles más altos de genes de señalización HSF1-así como de maquinaria genética MHC-I (Datos ampliados, figura 9e). Además, en un estudio de bloqueo de puntos de control inmunológico en pacientes con melanoma35, el análisis proteómico demostró que la expresión de proteínas de GBP, genes de señalización HSF1 y MHC-I fue mayor en los que respondieron clínicamente que en los que no respondieron (Datos ampliados, figura 9f). Además, observamos una correlación positiva entre los genes de señalización GBP1 y HSF en cánceres humanos (datos ampliados, figura 9g). Los datos respaldan que el eje LIMIT-GBP-HSF1 puede activar la expresión de MHC-I y favorecer la inmunidad antitumoral (Datos ampliados, figura 10).

Discusión

Planta de hierba china cistanche-Antitumoral

Los humanos tenemos 30,000-60,000 lncRNA. Sin embargo, las identidades y funciones biológicas de la gran mayoría de estos potenciales lncRNA siguen siendo poco conocidas. En el campo de la biología del cáncer, los lncRNA se han estudiado en gran medida en el modelo de inmunodeficiencia, lo que deja un vacío en el conocimiento de los lncRNA en el contexto del sistema inmunológico. Se ha informado que un puñado de lncRNA afectan la función de las células inmunitarias36,37, la progresión del cáncer y la eficacia de la quimioterapia38,39. Sin embargo, sigue sin respuesta si los lncRNA específicos están involucrados en la inmunidad antitumoral y la respuesta a la inmunoterapia. En el presente estudio, hemos identificado que LIMIT es un lncRNA que responde a IFN no caracterizado previamente en células humanas y de ratón. LIMIT puede inducir la expresión de MHC-I y MHC-II, promoviendo la respuesta inmune tumoral mediada por células T y mejorando la eficacia de la inmunoterapia. Por lo tanto, LIMIT es un lncRNA inmunogénico tumoral previamente desconocido. La vía de señalización del IFN desempeña un papel clave en la determinación de la respuesta terapéutica a la inmunoterapia contra el cáncer40 a través de múltiples mecanismos19,20,41,42. Las mutaciones genéticas en los genes de señalización de IFN contribuyen a la resistencia al bloqueo de los puntos de control en pacientes con cáncer43-48. Sin embargo, la señalización de IFN puede inducir la expresión inhibidora de PD-L149. Por lo tanto, es ideal identificar y apuntar a un gen clave de señalización de IFN que media selectivamente la inmunidad antitumoral, en lugar de la evasión inmune del tumor. De acuerdo con esta noción, demostramos que LIMIT media la regulación positiva de MHC-I y MHC-II, pero no afecta la expresión de PD-L1 en respuesta al IFN. Por lo tanto, LIMIT puede estar en una posición única para ser un objetivo inmunogénico para la inmunoterapia contra el cáncer. Se han propuesto varias estrategias para atacar terapéuticamente los lncRNA patógenos50. Sin embargo, sigue siendo un desafío cómo elevar los niveles de lncRNA beneficiosos. Como los lncRNA que actúan en cis funcionan localmente, la expresión forzada de estos lncRNA puede ser incapaz de localizarse con precisión51. Si bien los lncRNA de acción trans pueden funcionar a través de estructuras secundarias específicas, es posible que la sobreexpresión de estos lncRNA no pueda generar sus estructuras naturales debido a la falta de acompañantes de ARN apropiados52. Mediante el uso de una estrategia de activación CRISPR guiada por ARN22, activamos directamente la expresión LIMIT en células tumorales en modelos preclínicos. La activación CRISPR LIMIT guiada por ARN puede impulsar la expresión de MHC-I en el tumor y potenciar la terapia de bloqueo de puntos de control. Dado que la pérdida de las firmas de los genes MHC-I e IFN ocurre con frecuencia en tumores humanos, sugerimos que la activación CRISPR de lncRNA beneficiosos, como LIMIT, puede rescatar la expresión del MHC-I tumoral y ser un enfoque terapéutico potencial. Mientras buscábamos el mecanismo por el cual LIMIT afecta la inmunidad tumoral, aclaramos que LIMIT se dirige a las GBP de manera cis. Los GBP desempeñan un papel en la inmunidad innata26,53,54. Los ratones que carecen de todo el grupo de Gbps manifiestan una respuesta anti-Toxoplasma gondii deficiente55. Sin embargo, antes de nuestro trabajo, la conexión mecanicista entre LIMIT y GBP, y la función biológica de GBP en la inmunidad tumoral y la inmunoterapia estaban indeterminadas. Hemos descubierto que las GBP son necesarias para la expresión de MHC-I tumoral inducida por IFN, la eficacia de destrucción de células T CD8+ y la terapia de punto de control eficaz. Los datos sugieren que los GBP son genes diana potenciales para aumentar la inmunogenicidad del tumor. Hemos descubierto inesperadamente que las GBP activan HSF1 para estimular la expresión genética del MHC-I y del MHC-I. La activación de HSF1 mediada por inhibidores de HSP90 se correlaciona con el control tumoral en modelos inmunocompetentes. Sin embargo, a pesar de múltiples ensayos clínicos con inhibidores de HSP90, hasta el momento ninguno de los inhibidores de HSP90 evaluados ha sido aprobado por la FDA para la terapia contra el cáncer. Este hecho decepcionante plantea la posibilidad de que los inhibidores de HSP90 puedan ser perjudiciales para la inmunidad tumoral. La toxicidad de estos inhibidores de HSP90 puede fomentar la destrucción de varias proteínas cliente de HSP90, como RAF1 y BCL2, que pueden ser críticas para la proliferación y supervivencia de las células T efectoras59,60. Dado que las GBP interactúan con HSP90 y liberan HSF1 señuelo para HSP90-, pero no alteran la actividad de HSP90, nuestros datos sugieren que apuntar a GBP puede ser una estrategia segura y no apreciada anteriormente para activar HSF1 para la inmunoterapia contra el cáncer. En resumen, identificamos LIMIT como un lncRNA inmunogénico contra el cáncer previamente desconocido. Nuestro trabajo sugiere que apuntar al eje de señalización LIMIT-GBP-HSF1 puede rescatar la expresión y función de MHC-I, lo que presenta un enfoque inmunoterapéutico contra el cáncer prometedor.

Métodos

Experimentos con animales

NSG hembra de seis a ocho semanas (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stock# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stock# 000664), BALB/c (BALB /cJ, n.º de stock 000651) y los ratones OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, n.º de stock 003831) se obtuvieron del Laboratorio Jackson. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. La sala de animales tiene una temperatura controlada (18-23 grados), humedad (40-60%) y un ciclo de 12 luces/12 oscuridad. Se inyectaron por vía subcutánea células YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2,5 × 106) y B16 (1 × 105) en el flanco derecho de los ratones. Para el tratamiento anti-PD-L1 en el modelo MC38, se administraron por vía intraperitoneal 5 mg/kg de anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) y anticuerpo de control (InVivoMAb, LTF-2) los días 6, 9, y 12 post inoculación tumoral. Para el tratamiento anti-PD-L1 en el modelo B16, se administraron por vía intraperitoneal 5 mg/kg de anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) y anticuerpo de control (InVivoMAb, LTF-2) el día 0, 3, 6, 9, 12 y 15 post inoculación tumoral. Los diámetros de los tumores se midieron utilizando calibradores. El volumen del tumor se calculó mediante Largo × Ancho × Ancho/2. Los estudios en animales se realizaron bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (PRO00008278). El estudio cumple con todas las normas éticas pertinentes relativas a la investigación con animales. En ninguno de los experimentos, el tamaño del tumor del xenoinjerto superó los 2 cm en ninguna dimensión, y ningún animal tuvo distensión abdominal severa (mayor o igual al 10% de aumento del peso corporal original). El tamaño de la muestra se eligió en base a datos preliminares. Después de la inoculación del tumor, los ratones fueron aleatorizados y asignados a diferentes grupos para recibir tratamiento.

reactivos

KRIBB11 y 17-AAG se adquirieron de Cayman Chemical. MG-132, Puromicina y Luperox eran de Sigma-Aldrich. IFN humano recombinante (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) y el IFN de ratón (485-MI) procedían de I+D.

Plásmidos

Para generar HSE-LUC, se sintetizaron, fusionaron y ligaron secuencias de ADN correspondientes a elementos de choque térmico (HSE) en un plásmido PGL3-básico (Promega). FLAG-HSF1 fue un regalo de Stuart Calderwood (Addgene #32537). Para la expresión forzada de GBP1, GBP2, GBP5 y Gbp2 de ratón, las respectivas secuencias codificantes se amplificaron por PCR a partir del ADNc generado a partir de células A375 o células B16 pretratadas con IFN y posteriormente se insertaron en el plásmido PCI-Flag. El plásmido PCI-Flag se preparó insertando la siguiente secuencia de Kozak más la etiqueta Flag más la secuencia de glicina 5 × en el plásmido PCI-neo (Promega) entre NheI y XhoI. Para anular el LIMIT humano y el LIMIT de ratón, se diseñaron shRNA y se insertaron en el plásmido PLKO.1 (Addgene #10879). El shRNA dirigido a la luciferasa de luciérnaga (shFluc) sirvió como control negativo. Para apuntar a la región promotora de Límite para la activación de CRISPR, se diseñaron sgRNA (sgLimit) y se insertaron en el plásmido phU6- sgRNA (Addgene #53188). El sgRNA no dirigido (sgNT) sirvió como control negativo. Para eliminar los sitios de unión STAT1/IRF1 en el promotor LIMIT, se diseñaron sgRNA emparejados (psgLIMIT) y se insertaron en el plásmido PX459 (Addgene #48139). Para derribar Hsf1 y Gbp2 de ratón, se diseñaron shRNA y se insertaron en el plásmido PLKO.1 (Addgene #10879). Para eliminar GBP1-5, se diseñó sgRNA y se insertó en el plásmido PX459 (Addgene #48139). Las secuencias diana se enumeran en la Tabla complementaria 7. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla complementaria 8.

Cultivo de células

Línea celular de melanoma humano A375 (CRL-1619), líneas celulares de melanoma de ratón, B16-F0 (CRL-6322) y YUMM1.7 (CRL-3362 ), la línea celular de cáncer de colon de ratón CT26 (CRL-2638) y 293T (CRL-3216) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). La línea celular de cáncer de colon de ratón MC38 se utilizó previamente en el laboratorio de Zou23,48. Las células B16- OVA se establecieron como se informó anteriormente42. En este estudio se generaron líneas celulares con deleción del promotor A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO y A375 LIMIT. Todas las líneas celulares se analizaron de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasma y se confirmó que eran negativas para micoplasma. Las células se cultivaron en medio RMPI (Gibco n.° 11875) suplementado con 10 % de FBS, excepto las células A375 y 293T, las dos últimas líneas se cultivaron en DMEM (Gibco n.° 11965) suplementado con 10 % de FBS. Todas las células se mantuvieron a 37 grados y 5% de CO2. Para el choque térmico, las células se colocaron en una incubadora a 43 grados y 5% de CO2 durante 2 horas. Para generar líneas celulares de eliminación, se produjeron partículas lentivirales mediante la transfección del plásmido de shRNA PLKO.1 con psPAX2 (Addgene #12260) y pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) en células 293T, y posteriormente se transdujeron en células tumorales. células con polibreno (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) durante la noche. 48 horas después de la transfección, las células se seleccionaron con puromicina (1-2 ug/ml) durante 2 semanas adicionales. Para establecer líneas celulares inactivadas, se transfectaron plásmidos de ARNsg PX459- en células tumorales durante 2 días y se seleccionaron con puromicina (1-2 ug/ml) durante 2 días adicionales. A continuación, las células se diluyeron en serie y se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 2-3 semanas, las colonias de células individuales se disociaron y se volvieron a colocar en placas de 6 pocillos. Tras la confluencia celular, la mitad de las células se recogieron y se validaron para determinar la eficacia de eliminación (KO) mediante transferencia Western. Para aplicar el sistema de activación CRISPR para activar el límite del ratón, se transfectaron phU6-sgRNA junto con SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) en células B16. Todas las transfecciones se realizaron con lipofectamina 2000 (Thermofisher) en una proporción de 1 ug de plásmido: 2 ul de regente de transfección. La dosis de transfección se determinó mediante titulación.

Ensayo de actividad luciferasa.

Se transfectaron células A375 con HSE-LUC y PRL-SV40P (Addgene #27163) durante 24 horas, junto con PCI-neo (vector) o GBP1, GBP2 durante 48 horas. Se transfectaron células A375 shFluc o A375 shLIMIT con HSE-LUC y PRL-SV40P (Addgene #27163) durante 24 horas y luego se trataron con IFN durante 48 horas adicionales. La actividad de luciferasa para la luciferasa de luciérnaga (HSE-LUC) y la luciferasa de renilla (PRL-SV40P) se midió con el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega). La actividad relativa de la luciferasa de luciérnaga se normalizó con la actividad de la luciferasa de renilla.

Tinción de superficies y análisis de citometría de flujo (FACS)

Las células se tripsinizaron y se lavaron con tampón MACS (PBS, FBS al 2%, EDTA 1 mM). La tinción de la superficie se realizó añadiendo los siguientes anticuerpos a la suspensión celular en 50 ul de tampón MACS: anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience), y anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Después de incubar durante 30 minutos, las células se lavaron con tampón MACS y se analizaron en un citómetro de flujo BD Fortessa.

Análisis de PCR cuantitativa (qPCR)

El ARN total se aisló de las células mediante purificación en columna (kit Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research) con tratamiento con ADNasa. El ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific) con cebadores hexámeros aleatorios. La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó en ADNc utilizando Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). La expresión génica se cuantificó utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 8. Los cambios en la expresión del ARNm se calcularon mediante el método ΔΔCt utilizando ACTB como control endógeno. Los resultados se expresan como veces de cambio normalizando a los controles.

transferencia Northern

El análisis de transferencia Northern se realizó con 10 ug de ARN totales preparados a partir de células A375 pretratadas con IFN, IFN y TNF. Los ARN se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante (Ambion) y se transfirieron a membranas Hybond-XL (GE Healthcare). LIMIT se detectó utilizando sondas de ADN marcadas con digoxina con el kit DIG Northern Starter (Roche). Las secuencias de sonda dirigidas a LIMIT se enumeran en la Tabla complementaria 7.

Amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE)

RACE se realizó para identificar los extremos del ADNc de LIMIT humano o de ratón con el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech). Los cebadores para RACE se enumeran en la Tabla complementaria 8.

Clon de LIMIT completo

Después de obtener las secuencias finales del ADNc, se amplificó por PCR LIMIT de longitud completa y se insertó en el plásmido PCI-neo entre XhoI y NotI. Los cebadores clonados para LIMIT humano y Limit de ratón se enumeran en la Tabla complementaria 8.

Fraccionamiento celular para RT-PCR.

Se recogieron células A375 pretratadas con IFN de placas de 15 cm mediante raspado y se lavaron una vez con PBS frío. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 700 g durante 5 minutos y se lisaron con tampón de lisis hipotónico (Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, NP{{ 12}}, 10% (vol/vol) de glicerol) para recoger la fracción citoplasmática. El ARN citoplásmico se obtuvo mediante precipitación con etanol durante la noche a -20 grados, seguido de una nueva extracción con reactivo TRIZOL. El sedimento nuclear restante se lavó tres veces con el tampón de lisis hipotónico, seguido de extracción con reactivo TRIZOL según las instrucciones del fabricante. Los ARN aislados de fracciones nucleares o citoplasmáticas se transcribieron de forma inversa y se realizó RT-PCR para LIMIT con los cebadores indicados. Los ACTB maduros o no empalmados se utilizaron como controles para el ARN nuclear o citoplasmático. Los cebadores para ACTB se enumeran en la Tabla complementaria 8.

transferencia Western

Las células se lavaron en PBS frío y se lisaron en 1 x tampón de lisis RIPA (Pierce) con 1 x inhibidor de proteasa (Pierce). Los lisados ​​se incubaron en hielo durante 10 minutos y se aclararon mediante centrifugación a 15,000g durante 15 minutos. La concentración de proteína se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher). Se mezclaron treinta microgramos de proteína con tampón de muestra (Thermo Fisher) con -ME y se desnaturalizaron a 95 grados durante 5 minutos. La muestra se separó mediante SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon con 5% p/v de leche en polvo descremada y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados y anticuerpos secundarios conjugados con HRP (CST) durante 1 hora a temperatura ambiente. La señal se detectó utilizando los sustratos de transferencia Clarity y Clarity Max Western ECL (Bio-Rad) y se capturó utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad). Los anticuerpos fueron los siguientes: anti-GBP1-5 humano (Santa Cruz, 166960, 1:500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1:1,000), anti-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1:1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1:1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1:1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1:1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1:1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1:1 ,000), anti-Fosfo-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000) y anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5000). Para la transferencia Western de MHC-I humano, los lisados ​​celulares totales se desnaturalizaron en el tampón de muestra sin -ME (no reductor) para mantener los puentes disulfuro y la conformación de las proteínas que se detectarán mediante el anticuerpo anti-HLA-ABC (W6/32 , Novus Biologicals, 64775, 1:1.000).

Co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Las células se recogieron con tampón de lisis IP (Pierce, 87787) más inhibidor de proteasa. La concentración de proteínas se determinó con un kit de ensayo de proteínas BCA. Se agregaron muestras de proteína 200-500 ug a 1-3 ug de anticuerpos primarios anti-HSP90 (Proteintech, 13171) o anti-HSF1 (CST, 12972) y se incubaron con balanceo suave a 4 grados durante la noche. Luego, las muestras se incubaron adicionalmente con 20 ul de Proteína A/G PLUS-Agarosa (Santa Cruz, sc-2003) durante 2 horas a 4 grados; y se centrifugó a 7500 xg durante 30 segundos a 4 grados. Los sedimentos celulares se lavaron 4 veces con tampón de lisis IP, se resuspendieron con 40 ul de tampón de muestra 2x con -ME y se calentaron durante 5 minutos a 95 grados. Las muestras de proteínas desnaturalizadas se analizaron mediante transferencia Western. Para Flag IP, los lisados ​​​​celulares se incubaron con 20 ul de EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) y se lavaron, desnaturalizaron y analizaron como se describe anteriormente.

Tinción de inmunofluorescencia

Las células A375 montadas sobre cubreobjetos se trataron con IFN durante 24 horas. Después de lavar 2 veces con PBS, las células se fijaron con PFA al 4% durante 15 minutos y se lavaron 2 veces con PBS durante 5 minutos cada una. Luego, las células se permeabilizaron con 0.5% triton x-100 en PBS durante 10 minutos y se enjuagaron 2 veces con PBS durante 5 minutos cada una. Los antígenos se bloquearon con suero de cabra normal al 10% en PBS durante 30 minutos. Luego, se agregaron anticuerpos primarios en diluciones 1:50 de anticuerpo GBP1-5 antihumano de ratón (Santa Cruz, 166960) o anticuerpo HSP90 antihumano de conejo (CST, 4877) y se incubaron a 4 grados durante la noche. Posteriormente, las células se lavaron y se incubaron con diluciones 1:500 de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con Qdot 605 (Thermo Fisher, Q11002) o anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con AF488- (Thermo Fisher, A11034). y luego se montó en portaobjetos de vidrio con reactivo ProLong Gold que contenía DAPI. Las imágenes de fluorescencia confocal se recogieron utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63X (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Los ChIP se realizaron con cromatina reticulada de células A375 tratadas con IFN y anticuerpo HSF1 (CST, 12972) o IgG de conejo normal (CST, 2729), utilizando el kit IP de cromatina enzimática Simple ChIP Plus (perlas magnéticas) (CST, 9005). El ADN enriquecido se cuantificó mediante PCR en tiempo real utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 8. La cantidad de ADN inmunoprecipitado en cada muestra se representó como una señal relativa a la cantidad total de cromatina de entrada, que equivale a 1.

Aislamiento de células OT-I y cocultivo con células tumorales OVA+

Se adquirieron ratones C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (número de stock JAX 003831) de The Jackson Laboratory. El bazo se homogeneizó y las células individuales se suspendieron en 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma-Aldrich) durante 1 minuto. Los esplenocitos se sedimentaron, se lavaron y se resuspendieron a 2 x 106 células por ml en medio de cultivo RPMI que contenía 1 ug/ml de péptido OVA257-264, 5 ug/ml de IL-2 recombinante de ratón y 40 µM de { {15}} mercaptoetanol. Las células se incubaron a 37 grados durante 5 días. Para establecer el cocultivo de células tumorales OT-I y OVA+, se recogieron esplenocitos después de un 5- día de activación. Las células OT-I se purificaron utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+ de ratón EasySep (Stemcell). Se sembraron células B16-OVA durante la noche. Luego se agregaron células OT-I al cultivo en diferentes proporciones. Todas las células se recogieron mediante tripsinización y se analizaron mediante citometría de flujo (FACS).

Células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) y macrófagos (BMDM)

Se aisló médula ósea de fémures de ratones C57BL/6 y se cultivó en medio completo RPMI1640 con 20 ng/ml de GM-CSF (I+D). Las células se incubaron a 37 grados y 5% de CO2. Se añadieron 10 ml adicionales de medio con 20 ng/ml de GM-CSF el día 3. El día 7, las células no adherentes y poco adherentes en el sobrenadante del cultivo se recogieron mediante lavado suave con PBS y se consideraron BMDC. Las células adherentes se consideraron BMDM.

Perfil de células inmunes intratumorales

Para cuantificar la expresión de células T intratumorales y de citocinas efectoras de células T, se prepararon suspensiones de células individuales a partir de tejidos tumorales frescos pasando físicamente a través de filtros de células de 100 μm. Las células inmunes se enriquecieron mediante centrifugación en gradiente de densidad. Para la tinción con citoquinas, las células inmunes intratumorales se incubaron en medio de cultivo RPMI que contenía PMA (5 ng/ml), ionomicina (500 ng/ml), brefeldina A (1: 1, 000) y Monessen (1: 1). ,000) a 37 grados durante 4 horas. 2-3 ul de Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD Biosciences), anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) y anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) se agregaron durante 20 minutos para teñir la superficie. Luego, las células se lavaron y se resuspendieron en 1 ml de solución Fix/Perm recién preparada (BD Biosciences) a 4 grados durante la noche. Después de lavarlas con tampón Perm/Wash (BD Biosciences), las células se tiñeron con 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), y anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) durante 30 minutos, se lavaron y se fijaron en formaldehído al 4% (Sigma Aldrich). Todas las muestras se leyeron en un citómetro LSR Fortessa y se analizaron con el software FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Cálculo de la puntuación de la firma

Utilizamos la expresión normalizada de genes para definir las siguientes firmas: infiltración de células T CD8+ (CD8A, CD8B, PRF1 y GZMB), expresión de MHC-I (HLA-A, HLA-B y HLA-C). y señalización HSF1 (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 y HSP90B1).

análisis estadístico

Para los experimentos basados ​​en células, se realizaron triplicados biológicos en cada experimento en general, a menos que se indique lo contrario. Para estudios con animales, se emplearon no menos de 5 réplicas por grupo. Los animales fueron asignados al azar en diferentes grupos después de la inoculación de células tumorales. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados. Los datos se muestran como valores medios con derivación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Se utilizó la prueba t 2- de dos colas para comparar los grupos de tratamiento con los grupos de control; La función de supervivencia se estimó mediante métodos de Kaplan-Meier y se utilizó la prueba de rangos logarítmicos para calcular las diferencias estadísticas.

Disponibilidad de datos

Los datos de RNA-seq (GSE99299) y los datos unicelulares procesados ​​(GSE123814) se obtuvieron de Gene Expression Omnibus (GEO). Los datos de proteómica de MS (PXD006003) se obtuvieron del repositorio PRIDE. Los conjuntos de datos sobre cáncer de TCGA se obtuvieron de UCSC Xena (//xena.ucsc.edu/). Los datos de RNA-seq y la información clínica para los ensayos clínicos de ICB fueron proporcionados por los respectivos autores correspondientes. Todos los datos brutos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente. Los datos fuente se proporcionan en este documento.

Disponibilidad de código

Todos los análisis utilizados en este estudio se realizaron siguiendo los manuales de Prism Graphpad versión 8.0 y el sitio web en línea en http://xena.ucsc.edu/. Durante este estudio no se desarrollaron nuevos códigos ni algoritmos.

Datos extendidos

Datos ampliados Fig. 1:

LIMIT se correlaciona con genes inmunes efectores en múltiples tipos de cáncer.

Datos ampliados Fig. 2:

Loci genéticos y secuencias de LIMIT humano y Limit de ratón.

Datos extendidos Fig. 3: LIMIT aumenta la expresión MHC-1

Datos ampliados Fig. 5:

LIMIT aumenta la expresión de MHC-1 cargado de antígeno in vivo.

Datos ampliados Fig. 6:

LIMIT cis activa las GBP para estimular el MHC-1 y la inmunidad tumoral.

Datos ampliados Fig. 7:

Los GBP activan HSF1 para estimular la expresión de MHC-I.

Datos ampliados Fig. 8:

HSF1 impulsa la expresión de MHC-I y la inmunidad tumoral.

Datos ampliados Fig. 9:

Los genes de señalización HSF1 se correlacionaron con el MHC-I y la inmunidad tumoral.

Datos ampliados Fig. 10: Esquema que muestra cómo el eje LIMIT-GBP-HSF1 afecta al MHC-I y a la inmunidad tumoral

Material suplementario

Consulte la versión web en PubMed Central para obtener material complementario.

Expresiones de gratitud

Agradecemos a los miembros del laboratorio Zou por su aporte intelectual. Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de investigación de las subvenciones NIH/NCI R01 de EE. UU. (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) y (CA216919, CA213566, CA120458 (MC), y el NIH a través de la Universidad de la Beca del Centro Oncológico Rogel de Michigan (CA46592).

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