La proteína secretora conservada rica en cisteína MaCFEM85 interactúa con MsWAK16 para activar las defensas de las plantas

Abstracto: Metarhizium anisopliaees un hongo entomopatógeno que puede mejorar el crecimiento y la resistencia de las plantas cuando actúa como endófito en plantas hospedantes. Sin embargo, se sabe poco sobre las interacciones de las proteínas o sus mecanismos de activación. Las proteínas comunes en la membrana extracelular de los hongos (CFEM) se han identificado como reguladores inmunológicos de las plantas que suprimen o activan las respuestas de resistencia de las plantas. Aquí, identificamos una proteína que contiene un dominio CFEM, MaCFEM85, que estaba localizada principalmente en la membrana plasmática. Los ensayos de dos híbridos de levadura (Y2H), glutatión-S-transferasa (GST) y complementación de fluorescencia bimolecular demostraron que MaCFEM85 interactuaba con el dominio extracelular de unmedicamento sativa(alfalfa) proteína de membrana, MsWAK16. Los análisis de expresión génica mostraron que MaCFEM85 y MsWAK16 estaban significativamente regulados positivamente enanisopliaeyM. sativa, respectivamente, de 12 a 60 h después de la coinoculación. Los ensayos adicionales de dos híbridos de levadura y la mutación específica del sitio de aminoácidos indicaron que el dominio CFEM y la cisteína número 52 eran específicamente necesarios para la interacción de MaCFEM85 con MsWAK16. Los ensayos de la función de defensa mostraron que JA estaba regulado positivamente, pero el tamaño de la lesión de Botrytis cinerea y la reproducción de Myzus persicae fueron suprimidos por la expresión transitoria de MaCFEM85 y MsWAK16 en la planta huésped modelo Nicotiana benthamiana. En conjunto, estos resultados proporcionan conocimientos novedosos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones de M. anisopliae con las plantas hospedadoras.

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Palabras clave: quinasa asociada a la pared; CFEM; Metahizium anisopliae; inmunidad vegetal; medicamento sativa

1. Introducción

Las interacciones entre plantas y microbios están muy extendidas y son el resultado de una coevolución pasada y actual. Estas interacciones pueden tener resultados beneficiosos, neutrales o adversos para cada participante [1–3]. La microbiota rizosférica beneficiosa puede mejorar el crecimiento de las plantas y mejorar la salud general al proteger contra enfermedades transmitidas por el suelo o mejorar la absorción de nutrientes [4,5]. Una amplia gama de microbios beneficiosos pueden mejorar las capacidades de las plantas, como la absorción de nutrientes, el crecimiento y las defensas contra patógenos e insectos [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın es un género importante de hongos entomopatógenos con la capacidad de colonizar plantas [8], pero también hay evidencia que sugiere que los miembros del género pueden mejorar la resistencia a los patógenos de las plantas. Por ejemplo, un estudio de laboratorio encontró una inhibición del 60% de Fusarium solani (Mart.) Sacc. en presencia de Metarhizium robertsii (anteriormente conocido como M. anisopliae) en comparación con controles sin M. robertsii [9]. Algunas cepas de Metarhizium tienen el potencial de mejorar la resistencia de las plantas a plagas y enfermedades de insectos al alterar la expresión de genes de defensa de las plantas. La colonización endofítica con M. Roberts activa la expresión de las vías de defensa del ácido jasmónico (JA) y del ácido salicílico (SA) en las hojas de maíz; además, dicha colonización está asociada con la promoción del crecimiento de las plantas y la supresión del desarrollo larvario de Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense activó la -1,3-glucanasa y quitinasa en la cáscara del fruto de Lansium parasiticum, lo que resultó en la inhibición del crecimiento de Botrytis sp. y Fusarium sp. sobre el fruto de Aglaia dookkoo Griff [11]. Además, cuando se aplicó M. anisopliae a plántulas de maní, se activaron una variedad de factores de transcripción que incluyen WRKY, MYC, TGA y factores de transcripción sensibles al etileno, mientras que los transportadores de nitrato y las proteínas que se unen a elementos sensibles a la deshidratación también se expresaron diferencialmente [12] . Esto sugiere que M. anisopliae regula los genes de defensa de las plantas a medida que coloniza la planta. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre los mecanismos que subyacen a las respuestas de defensa de las plantas después de la infección por Metarhizium. Los efectores son un medio común mediante el cual los microorganismos regulan la resistencia de las plantas [13]. La activación de la resistencia de las plantas suele caracterizarse por un estallido oxidativo y la inducción de hormonas, metabolitos y otras señales [13]. Las hormonas vegetales SA y JA desempeñan funciones importantes en la inducción de la resistencia de las plantas, mediando dos vías de señalización de defensa separadas [14]. La vía de señalización SA funciona principalmente en la respuesta alérgica de las plantas y en la resistencia sistémica adquirida a los patógenos, pero también puede estar involucrada en respuestas indirectas de defensa de las plantas inducidas por la alimentación de insectos que pican [15]. La acumulación de SA se asocia con una mayor expresión de genes que codifican proteínas de transferencia de lípidos (LTP) y fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) [16], que median la síntesis y acumulación de metabolitos especializados posteriores, como flavonoides y lignina [17]. La vía de señalización de JA funciona en respuestas directas e indirectas a daños mecánicos, hongos patógenos y plagas de insectos. Los estudios han demostrado que la señalización de JA tiene un efecto regulador sobre la síntesis de metabolitos especializados como terpenoides, fenilpropanoides y alcaloides, que tienen una amplia gama de funciones biológicas [18]. Se ha demostrado que algunos metabolitos especializados se acumulan en las células vegetales después del tratamiento con metilJA (MeJA), incluido el paclitaxel en las especies Taxus [19,20], los terpenoides en Centella Asiatica (L.) Urban [21] y las saponinas en el ginseng [22]. . La aplicación de SA y quitosano (CHT) como inductores indujo la acumulación de lignina y reacciones enzimáticas de defensa en tomates, lo que redujo la incidencia de la infección por Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Además, los niveles de JA y SA en el trigo se acumularon significativamente mediante la aplicación del elicitor PeaT, mejorando la respuesta de defensa contra el pulgón de la avena Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Esto indica que la inmunidad de las plantas podría ser regulada por estos efectores a través de hormonas y metabolitos vegetales.

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Las proteínas comunes en la membrana extracelular de los hongos (CFEM) están presentes en una amplia gama de hongos. Codifican dominios que suelen tener 60 aminoácidos (aa) de longitud y contienen ocho cisteínas característicamente espaciadas [25]. Los dominios CFEM son similares a los dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), que funcionan como receptores extracelulares, transductores de señales o moléculas de adhesión en las interacciones huésped-patógeno [26]. Las proteínas que contienen dominios CFEM pueden manipular la respuesta de resistencia de las plantas actuando como efectores. En el hongo de la roya de la hoja del trigo Puccinia triticina Erikas, el candidato efector CFEM PTTG_08198 aceleró el progreso de la muerte celular y promovió la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) [27]. El hongo antracnosis Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils contiene cinco efectores (CgCFEM6, 7, 8, 9 y 15) que se ha demostrado que suprimen la muerte celular programada inducida por BAX en Nicotiana benthamiana Domin [28]. Se informó que el hongo micorrízico fitosimbiótico Laccaria bicolor (Maire) PDOrton secreta varias proteínas CFEM, como Lac310796, Lac296573 y Lac296572, en tejidos simbióticos [29]. Aunque las funciones complejas de estas proteínas no se han estudiado más a fondo en la simbiosis micorrízica, resultados anteriores sugieren que las proteínas CFEM pueden funcionar en la señalización entre hongos y plantas. M. anisopliae puede funcionar como hongo entomopatógeno o endofítico en una planta huésped [30]. Sin embargo, aún no se ha informado sobre las funciones de las proteínas CFEM. Anteriormente identificamos una proteína que contiene el dominio CFEM en M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Aquí, informamos sobre la relación entre MaCFEM85 y la quinasa MsWAK16 asociada a la pared de Medicago sativa. Analizamos la secuencia de MaCFEM85 y realizamos experimentos para determinar qué residuos son críticos para la interacción con MsWAK16. Finalmente, utilizando N. benthamiana como nuestra planta modelo, evaluamos las respuestas de defensa de la planta a Botrytis cinerea y al pulgón Myzus persicae con y sin expresión transitoria de MaCFEM85 y MsWAK16.

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2. Resultados

2.1. MaCFEM85 estaba más estrechamente relacionado con CFEM fúngicos no patógenos y estaba localizado en la membrana plasmática

Se construyó un árbol filogenético para analizar las relaciones entre MaCFEM85 y otras proteínas CFEM de hongos modelo patógenos y no patógenos. Estos incluyeron Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge y Beauveria bassiana (Bals.) (ver Sección 4). MaCFEM85 estaba más estrechamente relacionado con las proteínas CFEM en B. bassiana y, por lo tanto, evolutivamente más cerca de los hongos no patógenos que de los patógenos (Figura 1a).

Figura 1a

2.2. MaCFEM85 se reguló positivamente durante las interacciones con M. sativa

Las quinasas similares a receptores asociadas a la pared (WAK) representan un subgrupo dentro de la superfamilia de proteínas quinasas similares a receptores (RLK) e incluyen un dominio extracelular, una hélice transmembrana y un dominio quinasa intracelular. Desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento, el desarrollo, la respuesta al estrés y las vías de señalización de la resistencia a patógenos de las plantas [32]. Se extrajo ARN de hifas de M. anisopliae y raíces de M. sativa después de la coincubación para investigar los patrones de expresión de MaCFEM85 y MsWAK16. Tanto MaCFEM85 como MsWAK16 se expresaron en niveles significativamente más altos durante la coincubación de 12 a 60 h (Figura 1c,d). De 0 a 36 h, la expresión de MaCFEM85 aumentó gradualmente, alcanzando un máximo a las 36 h. Se expresó × 593 veces más en la combinación de M. anisopliae y M. sativa en comparación con M. anisopliae cultivado solo. Aunque la expresión de MaCFEM85 disminuyó ligeramente en el período de 48 a 60 h, todavía se expresó en niveles significativamente más altos que en M. anisopliae cultivado solo. MsWAK16 también se reguló significativamente, con un máximo de expresión a las 36 h. En M. sativa infectada con M. anisopliae, MsWAK16 se expresó × 89,06 veces más que en M. sativa sin M. anisopliae. De 36 a 60 h, los niveles de MsWAK16 disminuyeron ligeramente, pero su expresión aún fue significativamente mayor que en las plantas no inoculadas.

2.3. MaCFEM85 interactúa con MsWAK16 in vitro e in vivo

Para investigar el posible mecanismo funcional de MaCFEM85 en respuesta al tratamiento con M. anisopliae, se realizó una evaluación de dos híbridos de levadura (Y2H) para identificar preliminarmente las proteínas del huésped que interactúan con MaCFEM85. La interacción entre el dominio extracelular de MsWAK16 (MsWAK16-ED) y MaCFEM85 se examinó con un ensayo de dos híbridos de levadura uno a uno utilizando MaCFEM85 en pGBKT7 como vector BD y MsWAK16 en pGADT7 como vector AD. Toda la levadura transformada creció bien en un medio deficiente en SD-T/L, y el grupo de control positivo y el grupo experimental crecieron exitosamente en un medio deficiente en SD-T/L/H/A + X- -gal. Esto indicó que MaCFEM85 podría interactuar con MsWAK16-ED (Figura 2a).

Figura 2. Validación de la interacción entre MaCFEM85 y MsWAK16.

Para la validación in vitro, se insertó MsWAK16-ED marcado con glutatión-S-transferasa (GST) (que codifica un producto de 60 kDa) en pGEX6-P2, y MaCFEM85 marcado con polihistidina (His) ( que codifica un producto de 17 kDa) se insertó en pET-21b. La inmunotransferencia con anticuerpos His y GST mostró que la proteína recombinante MaCFEM85-His interactuaba con la presa GST-MsWAK16-ED pero no solo con GST y que GST-MsWAK16- ED interactuaba con His. -MaCFEM85 (Figura 2b). Para confirmar aún más la interacción entre MaCFEM85 y MsWAK16, realizamos un ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con construcciones MaCFEM85-YFPN y MsWAK16-YFPC. La coexpresión de MaCFEM85-YFPN y MsWAK16-YFPC en hojas de tabaco generó una señal de fluorescencia amarilla, lo que indica que MaCFEM85 interactuaba con MsWAK16 (Figura 2c).

2.4. Sitios clave para interacciones MaCFEM85 y MsWAK16

Para definir la región de MaCFEM85 que se requiere para la interacción con MsWAK16-ED, se predijeron los dominios de proteínas con el software en línea SMART (Figura 3a). MaCFEM85 contenía un dominio CFEM en la región 19-86 aa. También se predijo la estructura terciaria (Figura 3b). Las ocho cisteínas en este dominio dieron como resultado cuatro enlaces disulfuro (CYS26 y CYS69, CYS30 y CYS64, CYS43 y CYS50, y CYS52 y CYS85), manteniendo la estabilidad de la proteína (Figura 3b). Para validar los supuestos sitios de interacción en MaCFEM85, se generaron siete versiones mutadas de la proteína y se insertaron en pGBKT7 como proteínas cebo. Cada vector recombinante se cotransfectó con AD-MsWAK16-ED en la cepa Y2H Gold. La cepa con CYS52 mutado no creció en medios selectivos (Figura 3c, delineada en rojo), lo que indica que se requiere CYS52 para la interacción de MaCFEM85 con MsWAK16-ED.

2.5. La interacción de MaCFEM85 con MsWAK16 activa la respuesta inmune de las plantas

2.5.1. Evaluación del papel de MaCFEM85 y MsWAK16 en la resistencia a enfermedades contra B. cinerea

Para explorar la posible participación de MaCFEM85 y MsWAK16 en las respuestas de defensa de patógenos, examinamos si la sobreexpresión de MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85 y MsWAK16 podría conferir una mayor resistencia a B. cinerea. Expresamos transitoriamente estos vectores en hojas de N. benthamiana. Un ensayo de transferencia Western mostró que MaCFEM85 y MsWAK16 se expresaron en niveles comparables cuando se expresaron solos o juntos, lo que muestra que MaCFEM85 y MsWAK16 se expresaron con éxito en tabaco (Figura 4a). También se realizaron ensayos de enfermedades utilizando N. benthamiana infiltrada con MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 o el control GFP. Las lesiones fueron significativamente más pequeñas (~30 % a los 2 días después de la inoculación) en las hojas infiltradas con MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 en comparación con las plantas de control (Figura 4b). Estos datos demuestran que la expresión transitoria de MaCFEM85 en N. benthamiana confirió una mayor resistencia a B. cinerea y que MaCFEM85 y MsWAK16 regularon positivamente la respuesta de defensa contra B. cinerea.

Figura 3. Identificación del sitio de interacción entre MaCFEM5 y MsWAK16.

Figura 4. Inducción de resistencia de las plantas mediante expresión transitoria de MaCFEM85 y MsWAK16.

2.5.2. Evaluación del papel de MaCFEM85 y MsWAK16 en la defensa de los pulgones en N. benthamiana

Para investigar más a fondo el papel de MaCFEM85 y MsWAK16, se infestaron plantas de N. benthamiana que expresaban transitoriamente MaCFEM85 y MsWAK16 con M. persicae y se evaluaron las poblaciones. Para este experimento, se agroinfiltró una gran área de cada hoja de N. benthamiana con el vector binario recombinante pYBA1132 que contiene MaCFEM85 y MsWAK16. Se utilizó GFP como control. A las 12 h después de la infiltración, se enjaularon 20 adultos de M. persicae en cada hoja, exponiendo el área infiltrada a los pulgones. En los tres días siguientes se registró la mortalidad de pulgón adulto y el número de ninfas; Luego se eliminaron las ninfas. No hubo diferencias significativas en el riesgo de mortalidad entre las poblaciones de M. persicae que se alimentan de plantas que expresan MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Figura 4c). Sin embargo, a las 24, 48 y 72 h, el número promedio de progenie producida por cada pulgón adulto fue significativamente mayor en N. benthamiana que expresaba el control GFP en comparación con aquellos que expresaban MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 (Figura 4d).

2.5.3. Evaluación del papel de MaCFEM85 y MsWAK16 en la acumulación de hormonas y la expresión genética relacionada con hormonas

Para analizar las diferencias entre las respuestas de defensa de las plantas de N. benthamiana que expresan eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 y MaCFEM85+MsWAK16, medimos los niveles de JA, SA y flavonoides totales, y la expresión de genes relacionados. Los resultados mostraron que los niveles de JA y SA diferían entre las plantas que expresaban eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 y MaCFEM85+MsWAK16 (Figura 5a). En comparación con las que expresan eGFP, los niveles de JA fueron significativamente más bajos en las plantas que expresan MaCFEM85; Los niveles de SA aumentaron ligeramente, pero las diferencias no fueron significativas. Por el contrario, las plantas que expresan MsWAK16 no mostraron diferencias significativas en los niveles de JA en comparación con el control de eGFP, mientras que los niveles de SA fueron significativamente más bajos que en el control (Figura 5a). Los niveles de JA y SA aumentaron y disminuyeron significativamente, respectivamente, en plantas que expresaban MaCFEM85+MsWAK16 en comparación con eGFP.

Figura 5. Niveles hormonales y expresión genética de respuesta hormonal.

El contenido total de flavonoides fue significativamente mayor en las plantas que expresaban MaCFEM85+MsWAK16 en comparación con todos los demás grupos de tratamiento (Figura 5a). Los niveles de expresión de genes biosintéticos fueron similares en plantas que expresaban MsWAK16 y MaCFEM85+MsWAK16. Por ejemplo, los genes relacionados con la respuesta de JA, a saber, COI1, MYC2 y PDF1.2, estaban significativamente regulados positivamente en comparación con las plantas que expresan GFP (Figura 5b). De manera similar, los genes NPR1, WRKY70 y PR1 relacionados con SA se expresaron de manera significativamente diferencial en plantas que expresan MsWAK16 y MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 estaba regulado positivamente, mientras que WRKY70 y PR1 estaban regulados negativamente en comparación con el control (Figura 5b). También examinamos la expresión de genes clave en las vías de síntesis del ácido shikímico y de los fenilpropanoides, ambos relacionados con la síntesis de flavonoides. En general, la expresión de MaCFEM85 sola no indujo una expresión significativamente mayor de estos genes en el tabaco. Sin embargo, estos genes estaban regulados positivamente en el tabaco que expresaba MsWAK16 o MsWAK16+MaCFEM85 en comparación con el control de GFP (Figura 5c).

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3. Discusión

3.1. El motivo proteico CFEM conservado cumple múltiples funciones en especies de hongos

El dominio CFEM es exclusivo de los hongos y ocurre comúnmente en las proteínas de la membrana extracelular de los hongos. El dominio se originó en el ancestro común más reciente de Ascomycota y Basidiomycota [33]. Investigaciones recientes han demostrado que las proteínas CFEM en patógenos fúngicos pueden actuar como reguladores inmunológicos de las plantas, causando supresión o activación inmune de la planta huésped según el tipo de infección [28,34,35]. Ha habido pocos informes de proteínas que contengan dominio CFEM en M. anisopliae, sólo en el contexto de una comparación evolutiva con otros hongos [36]. En este estudio, comparamos las proteínas CFEM de M. anisopliae con otras proteínas CFEM conocidas en hongos patógenos y no patógenos. Confirmamos que el homólogo más cercano de MaCFEM85 es Cfem5 que se encuentra en Beauveria bassiana, una de las 12 proteínas CFEM de esa especie (Figura complementaria S1). BbCfem5 es esencial para la adquisición de hierro [37]. Además, según la estructura terciaria predicha, el dominio CFEM en MaCFEM85 es muy similar a la proteína del antígeno de superficie 2 (CSA2) encontrada en Candida albicans (CPRobin) Berkhout, en la que se han modelado 65 residuos (96% de la secuencia) con 99,8 % de confianza [31]. Candida albicans es un patógeno animal; CSA2 desempeña un papel importante en el crecimiento y la patogenicidad al extraer el hemo de la hemoglobina y transportarlo desde la pared celular al plasma [38-40]. Nuestra hipótesis es que MaCFEM85 puede estar involucrado en la virulencia de M. anisopliae de los insectos huéspedes. Estas funciones combinadas de MaCFEM85 en la infección patógena animal y la activación de la inmunidad vegetal hacen de la proteína un interesante foco de investigación futura.

3.2. Los enlaces disulfuro son estructuras importantes para la función de las proteínas

La integridad conformacional de una estructura proteica está directamente relacionada con su capacidad para funcionar. Los enlaces disulfuro formados por pares de cisteína promueven el plegamiento de proteínas y la estabilidad conformacional y se considera que forman sitios clave para el reconocimiento y la unión de receptores o ligandos específicos [41]. Por ejemplo, la interrupción de cualquiera de los tres enlaces disulfuro conservados en la proteína efectora AVR4 del patógeno vegetal Cladosporium fulvum produce sensibilidad a la proteasa y una capacidad reducida de unión a la quitina [42]. En otras tres proteínas de C. fulvum (ECP1, ECP2 y ECP5), las sustituciones únicas de alaninas por cisteínas amortiguan la respuesta hipersensible del tomate, lo que indica que las cisteínas son fundamentales para mantener la estabilidad y la actividad inductora de la respuesta hipersensible [43]. Además, en la proteína madura MC69 de Magnaporthe oryzae, la mutagénesis de dos residuos de cisteína conservados (Cys36 y Cys46) puede alterar la función de MC69 sin afectar la secreción, lo que sugiere la importancia del enlace disulfuro específicamente en la patogenicidad de MC69 [44]. El dominio CFEM parece ser similar en tamaño y en el patrón de residuos de cisteína a los dominios similares a EGF, que contienen tres o cuatro pares de enlaces disulfuro. Las proteínas EGF pueden funcionar como receptores de superficie celular, transductores de señales o moléculas de adhesión en interacciones huésped-patógeno [45]. En este estudio, no solo encontramos que el dominio CFEM de MaCFEM85 contenía ocho cisteínas conservadas que formaban cuatro pares de enlaces disulfuro (Figura 3b), sino que también validamos que CFEM era el dominio crítico para la interacción entre MaCFEM85 y MsWAK16. Además, a través de la mutación dirigida al sitio de los residuos de cisteína a alanina, encontramos que el residuo de cisteína en la posición 52 era el sitio central requerido para la interacción (Figura 3c). Estos resultados proporcionan una base para estudios adicionales sobre las funciones fisiológicas de la interacción CFEM85-WAK16.

3.3. La interacción de MaCFEM85 con las defensas vegetales activadas por MsWAK16

En las interacciones entre microbios y plantas, las respuestas de defensa de las plantas generalmente son activadas por proteínas efectoras microbianas. La defensa inducida se está convirtiendo en una herramienta importante en el control biológico de plagas para promover la resistencia. Las proteínas CFEM han sido identificadas como efectoras involucradas en la regulación de la activación o inhibición inmune de las plantas [28,46]. Sin embargo, hay escasez de investigaciones publicadas que vinculen la regulación de estos factores inmunes con sus funciones específicas en las enfermedades de las plantas y la resistencia de los insectos. En este estudio, utilizamos un hongo entomopatógeno y endofítico, M. anisopliae, para identificar una interacción entre MaCFEM85 y una quinasa asociada a la pared celular, MsWAK16, en M. sativa. Los resultados mostraron que esta interacción redujo la proporción de lesiones después de la inoculación con B. cinerea (Figura 4b) y disminuyó la tasa de crecimiento de la población de M. persicae (Figura 4d), lo que indica que la interacción entre MaCFEM85 y MsWAK16 aumentó la resistencia de M. sativa a los pulgones. Los cambios en los niveles de JA, SA y etileno (ET) se pueden utilizar como marcadores para evaluar la inducción de resistencia de las plantas [47,48]. Aquí, demostramos que MaCFEM85 interactuaba con MsWAK16 para influir en la resistencia de las plantas a través de la regulación hormonal y para inhibir la tasa de reproducción de M. persicae (Figura 4d). Se han informado estudios similares anteriormente. Por ejemplo, se demostró que la proteína efectora PeBL1 de Brevibacillus laterosporus induce la acumulación de JA y SA en tomates y disminuye la tasa de crecimiento de las poblaciones de segunda y tercera generación de M. persicae que se alimentan de esas plantas. Además, las plantas de tomate rociadas con efectores tienen un efecto repelente sobre M. persicae [49]. La aplicación de la proteína elicitora PeBC1 al frijol común (Phaseolus vulgaris L.) produce efectos subletales pronunciados y significativos sobre los pulgones verdes del melocotón. Las plantas tratadas con PeBC1 muestran una regulación positiva significativa de genes relacionados con JA y SA [50]. El elicitor PeBb1 de Beauveria bassiana reduce la fecundidad de M. persicae en el tabaco e induce la expresión de genes relacionados con JA y ET [51]. En el presente estudio, la expresión transitoria de MaCFEM85 y MsWAK16 en el tabaco aumentó significativamente los genes COI1, MYC2 y PDF1.2 relacionados con la respuesta de JA (Figura 5b) y aumentó el contenido de JA y flavonoides totales (Figura 5a), lo cual fue comparable a los resultados. en la literatura como se describe anteriormente. Sin embargo, no detectamos niveles altos de SA en el tabaco 12 h después de la infiltración, y las plantas que expresan transitoriamente MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 mostraron niveles de SA significativamente reducidos y una regulación negativa de los genes involucrados en la respuesta de SA (Figura 5a, b). . Esto demostró que la estimulación de diferentes hormonas vegetales puede conducir no sólo a actividades sinérgicas sino también a interferencias y retroalimentación, lo que permite a las plantas responder adecuadamente a diferentes estímulos. Anteriormente se han informado niveles elevados de JA pero niveles bajos de SA en plantas. Por ejemplo, en A. thaliana defectuosa para la acumulación de SA, los niveles de JA fueron 25- veces más altos que en A. thaliana de tipo salvaje, y se activaron genes que responden a JA [52]. También se ha informado que algunas bacterias pueden aumentar los niveles de JA en las plantas para inhibir la acumulación de SA, evitando el daño causado por el SA. Por ejemplo, Pseudomonas syringae se dirige al receptor COI1 a través de una toxina, la coronatina, que regula negativamente la vía JA [53]. Esto promueve la regulación positiva inducida por MYC2- de los factores de transcripción ANAC019, ANAC055 y ANAC072 [54], inhibiendo la transcripción de ICS1 (un gen clave para la síntesis de SA) y, por lo tanto, regulando negativamente la producción de SA y la transducción de señales. En el presente estudio, la interacción entre MaCFEM85 y MsWAK16 condujo a una mayor acumulación de JA y a una regulación positiva de los genes que responden a JA, pero a la inhibición de la acumulación de SA y la transcripción de genes relacionados con SA. Esto indicó que la interacción entre MaCFEM85 y MsWAK16 indujo JA, mejorando así la resistencia de las plantas a los pulgones.

En N. benthamiana que expresa transitoriamente MaCFEM85 y MsWAK16, los niveles de JA aumentaron y el tamaño de las lesiones de B. cinerea disminuyó (Figura 4b), de acuerdo con estudios previos. El JA participa en la resistencia de las plantas a insectos y patógenos necrotróficos [52,55]. Como patógeno necrotrófico, B. cinerea fue inhibida por la acumulación de JA y ET [56]. En el mutante ein2-1 con deficiencia de ET de A. thaliana y el mutante coi1-1 con respuesta a JA, los niveles del gen de defensa posterior, PDF1.2, se redujeron significativamente y se mejoró la sensibilidad a B. cinerea [ 57]. Aquí encontramos que la acumulación de JA y la transcripción de genes relacionados con JA aumentaron significativamente en N. benthamiana que expresaba transitoriamente MaCFEM85 y MsWAK16, mientras que la acumulación de SA y la transcripción de genes relacionados con SA se inhibieron. La expresión de MaCFEM85 y MsWAK16 también mostró un efecto inhibidor sobre B. cinerea. Esto indicó que JA fue activado por MaCFEM85 y MsWAK16 y desempeñó un papel principal en la resistencia de las plantas a B. cinerea.

4. Materiales y métodos

4.1. Cepas de hongos, materiales vegetales y métodos de cultivo

Las cepas aisladas de Metarhizium anisopliae Ma 9 se cultivaron en medio de papa-azúcar-agar (PSA) (200 g de extracto de papa pelada hervido en agua, 20 g de sacarosa y 15 g de agar/L). Se recogió polvo de esporangio fresco después de 10 días. Las plantas de Nicotiana benthamiana se cultivaron en una cámara climática artificial con un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h (27/25 ◦C). Para la expresión génica transitoria mediante transformación mediada por Agrobacterium, se cultivó la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens en medio Luria Broth (LB) (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl/l). La cepa de levadura Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) se cultivó en medio de peptona dextrosa (YPDA) de extracto de levadura (10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de glucosa y 0,03 g de hemisulfato de adenina/l). Para cada vector y cepa, se utilizaron antibióticos apropiados, a saber, rifampicina, kanamicina o ampicilina (25, 50 o 50 µg/ml, respectivamente). Las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria S1. Las semillas de Medicago sativa se esterilizaron en superficie con etanol al 75% durante 1 min, seguido de NaClO al 50% (5,5%) durante 15 min. Las semillas se mezclaron completamente y luego se lavaron en agua esterilizada tres veces durante 5 minutos cada una. Las semillas se incubaron a 4 ◦C en la oscuridad durante más de 24 h, luego germinaron en placas de agar agua al 1% a temperatura ambiente durante la noche. Tres días después de la germinación, las plántulas en desarrollo se transfirieron a papel de filtro en placas de Petri estériles de 9- cm, con 20 plántulas por placa. Los tratamientos y el control se asignaron a 15 platos cada uno, respectivamente. Luego, las plántulas se irrigaron con 10 ml de suspensión de esporas de M. anisopliae que contenía 107/ml y el control se irrigó con 10 ml de agua estéril. A las 0, 12, 24, 48 y 60 h, se tomó una selección aleatoria de plántulas de tres cajas de Petri para cada intervalo de tiempo. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ◦C.

4.2. qRT-PCR y construcción de plásmidos

El ARN total se extrajo de M. anisopliae (hifas) y M. sativa (raíces) con reactivo TRIzol (Invitrogen, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad y abundancia del ARN resultante se midieron con un NanoPhotometer® (Implen, Münich, Alemania). La síntesis de ADNc de primera cadena (hasta 2 ug de ARN) se realizó utilizando 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canadá) siguiendo las instrucciones del fabricante. La qRT-PCR se realizó utilizando 2 × SYBR Green qPCR Master Mix de EE. UU. EVER BRIGHT ® INC. y el sistema ABI QuantStudio 5 siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para cada gen se enumeran en la Tabla complementaria S2. Maury [58], Msactin [59] y Nbactin [60] se utilizaron como genes de referencia internos para la normalización de los datos de expresión. La reacción se realizó bajo las siguientes condiciones: 5 min a 95 ◦C, seguido de 40 ciclos a 95 ◦C por 15 s y a 60 ◦C por 40 s. Hubo tres réplicas técnicas para cada muestra. La expresión relativa se calculó utilizando el método 2−∆∆Ct [61]. La significación estadística se determinó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba de rangos múltiples de Duncan en SPSS v20.0 (SPSS).

4.3. Expresión transitoria de proteínas en N. benthamiana

La secuencia codificante de MaCFEM85 (CDS) se amplificó con ADN polimerasa de ultra fidelidad utilizando ADNc como plantilla. Para los ensayos de localización subcelular, los productos de PCR que contienen el CDS para MaCFEM85 se clonaron en pYBA1132-eGFP (digerido con EcoRI y SalI) y pcambia1300-cereza (EcoRI y SacI), respectivamente. Todas las construcciones fueron validadas con secuenciación (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, China). Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria S2. Para la expresión transitoria de MaCFEM85-eGFP y MaCFEM85-mCherry en N. benthamiana, se transformó la cepa GV3101 de A. tumefaciens con cada plásmido y se verificó con PCR. La Agrobacterium se cultivó durante la noche a 28 ◦C con agitación. Las células se recogieron mediante centrifugación de 5 minutos a 5000 rpm a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con agua bidestilada estéril y se resuspendieron en tampón MgCl2 10 mM (que contiene MES 10 mM y acetosiringona 10 mM, pH 5,7). La suspensión celular se ajustó a una DO600 de 0,5 y luego se infiltró en la parte inferior de hojas de N. benthamiana de 4- a 5- semanas de edad con una jeringa de 1- ml. Cada hoja fue infiltrada con 50 µL de A. tumefaciens; Se trataron tres hojas por planta y tres plantas en cada grupo de tratamiento. Las hojas tratadas se recogieron después de 30 h y se visualizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Alemania) para determinar la localización subcelular.

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4.4. Análisis filogenético

Se construyó un árbol filogenético utilizando el método de unión de vecinos en MEGA X. 1000 réplicas de arranque utilizaron el modelo de distancia P. Las secuencias de aminoácidos utilizadas para generar el árbol se obtuvieron con búsquedas BLASTP en la base de datos NCBI de hongos relacionados (p. ej., Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus) utilizando MaCFEM85 como consulta.

4.5. Ensayos de dos híbridos de levadura

Se utilizó el sistema de dos híbridos Matchmaker Gold Yeast (Clontech Laboratories, Inc.; ahora Takara Bio USA, Inc.) para verificar la interacción entre MaCFEM85 y MsWAK16. MaCFEM85 sin el péptido señal se introdujo en pGBKT7 como cebo y el dominio extracelular de MsWAK16 (MsWAK16-ED) se insertó en pGADT7 como presa. La preparación y las transformaciones de células competentes para levaduras se realizaron utilizando un Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos cebo y presa se cotransformaron en la cepa de levadura Gold. Las interacciones proteína-proteína se analizaron en función del crecimiento en placas de medio de doble abandono SD (DDO, SD/-Trp-Leu) y de medio de abandono cuádruple SD (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).

4.6. Ensayo BiFC

Para generar las construcciones BiFC, los vectores pUC-SPYNE y pUC-SPYCE se linealizaron mediante digestión con BamHI. Cada uno de los CDS de longitud completa de MaCFEM85 y MsWAK16 se clonó y se insertó en los plásmidos linealizados utilizando una enzima recombinante para obtener las construcciones MaCFEM85-YFPN y MsWAK16-YFPC. Los plásmidos que contienen MaCFEM85 y MsWAK16 se cotransformaron con vectores vacíos como controles negativos (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE y pUC-SPYNE + pUC-SPYCE). . Todos los vectores se introdujeron en N. benthamiana mediante transformación mediada por Agrobacterium como se describe anteriormente. Se observaron señales de fluorescencia en células epidérmicas de hojas utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Alemania). Los cebadores utilizados para la construcción de vectores se enumeran en la Tabla complementaria S2.

4.7. Ensayo desplegable GST

Para los ensayos desplegables de GST, se insertó MsWAK16-ED en el vector pGEX-6P-2 y se insertó MaCFEM85 en pET-21b. Las proteínas de fusión purificadas (GST-MsWAK16- ED) y la proteína sin carga pGEX-6P-2 (GST) se utilizaron como proteína de cebo y pET-21 purificado. La proteína de fusión b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) se utilizó como presa. Los ensayos de extracción de GST se realizaron con el sistema de purificación de proteínas Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las Mag-Beads se lavaron cinco veces con solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS, pH 7,4) para liberar el protector de alcohol y luego se agregaron 10 ml de GST o GST-MsWAK16-ED. Las perlas se mezclaron por inversión a temperatura ambiente durante 30 min. Después de retirar el sobrenadante, las Mag-Beads se lavaron cinco veces con 1X PBS. Se añadió His-MaCFEM85 a Mag-Beads ya unidas con GST y la mezcla se incubó durante la noche a 4 ◦C con rotación. Luego, las perlas se lavaron cinco veces con PBS 1X para eliminar las proteínas no unidas. Posteriormente, las proteínas inmovilizadas en las perlas se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (100 V, 1 h) y se analizaron mediante transferencia Western. Las membranas se lavaron tres veces durante 10 minutos cada una con PBS + Tween (PBST). Las membranas se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con leche desnatada al 5%, luego se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-His ProteinFind (TransGen Biotech, Beijing, China) (diluido 1:3000) o el anticuerpo monoclonal de ratón anti-GST ProteinFind durante 2 horas. h a 4 ◦C. Luego, las membranas se sumergieron en el anticuerpo IgG (H+L) (HRP) anti-conejo de cabra ProteinFind (TransGen Biotech, Beijing, China) (diluido 1:5000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se visualizaron con el kit EasySee® Western Blot (TransGen Biotech, Beijing, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.

4.8. Identificación del sitio clave en MaCFEM85

Para determinar el tamaño requerido para la interacción de MaCFEM85 con MsWAK16, se realizó una amplificación por PCR para generar múltiples formas truncadas de MaCFEM85. El dominio CFEM (MaCFEM85-CFEM; residuos aa 19–86) y el terminal C sin el dominio CFEM (MaCFEM85-C, residuos aa 87–170) se insertaron en el vector pGBKT7 como proteína cebo (Tabla complementaria S1). Se construyeron otras cinco variantes usando síntesis de polipéptidos para mutar cisteína a alanina en las posiciones 26, 30, 43, 52 y 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆ CFEM8552 y ∆CFEM858 todos, respectivamente). Estas variantes se utilizaron para realizar experimentos Y2H con MsWAK16-ED. Se analizó el crecimiento de las células de levadura transformadas en placas SD/-Trp-Leu abandonadas sintéticas y placas SD/-Trp-Leu-His-Ade que contenían X- -galactosidasa (X- -Gal).

4.9. Ensayos de resistencia de plantas

Myzus persicae se obtuvieron de Henan Quanying Biological Co., Ltd. Una semana antes del inicio de los bioensayos, se colocaron 150 pulgones adultos en tres plantas de N. benthamiana (50 pulgones por planta). Después de 72 h, se eliminaron todos los adultos con un cepillo de artista suave y se permitió que las ninfas se alimentaran durante cuatro días más antes de transferirlas a N. benthamiana para los ensayos de desempeño de los pulgones.

4.10. Ensayos de rendimiento de pulgones

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) se utilizó para evaluar el rendimiento de M. persicae, la resistencia a enfermedades de las plantas contra B. cinerea y la expresión de genes relacionados con hormonas. Se cultivaron Agrobacterium que portaban pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 o pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 en LB suplementado con antibióticos apropiados durante 36 h a 28 ◦C. Las células se lavaron tres veces y luego se resuspendieron en tampón de infiltración (MgCl2 10 mM, MES 10 mM y acetosiringona 100 µM, pH 5,6) hasta una DO600 de 0,6. Para la coinfección, las bacterias portadoras de MaCFEM85 y MsWAK16 se ajustaron a una DO600 de 1,2 y luego se mezclaron en volúmenes iguales. Se infiltraron hojas completamente expandidas con bacterias utilizando jeringas sin aguja de 1- ml. Se infiltraron tres hojas en cada planta y cada tratamiento se aplicó a tres plantas para un total de 12 plantas por experimento.

Para los ensayos de comportamiento de los pulgones, se aplicaron 20 pulgones adultos en el área infiltrada de cada hoja 12 h después de la aplicación de Agrobacterium. Los pulgones se confinaron utilizando jaulas tipo clip de 5 mm de diámetro. Cada tratamiento se repitió cinco veces. La mortalidad de los pulgones adultos y el número de ninfas recién puestas se registraron diariamente durante tres días. B. cinerea se cultivó durante cinco días en PDAY. 12 h después de la infiltración de Agrobacterium, la B. cinerea recién cultivada se introdujo en una torta de hongo de 5- mm y la superficie de crecimiento del micelio se unió al área de infiltración en la superficie de la hoja. Para facilitar el desarrollo de la enfermedad, las plantas se mantuvieron húmedas cubriéndolas con film plástico en bandejas a 22 ◦C para facilitar la progresión de la enfermedad. Después de 48 h, se estimó el progreso de la enfermedad en las hojas inoculadas midiendo el tamaño de las lesiones. Para cuantificar la expresión relativa de genes relevantes, las tres hojas infiltradas se recolectaron de cada planta 12 h después de la infiltración, luego se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 grados. La extracción de ARN total, la síntesis de ADNc y la qRT-PCR se realizaron como se describe en la Sección 3.2. Se midieron los niveles de ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y flavonoides en 15 hojas de N. benthamiana filtradas por tratamiento. Las hojas se recogieron, se congelaron en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 grados. Las hormonas vegetales se cuantificaron utilizando los kits ELISA de ácido salicílico vegetal y ácido jasmónico vegetal (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), y los flavonoides se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de flavonoides microplantales (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

4.11. Análisis estadístico

Los datos se analizaron en SPSS v20.0. Se determinaron diferencias significativas en los niveles de expresión de MaCFEM85 y MsWAK16 mediante una prueba t de Student. Se determinaron diferencias significativas en los niveles de SA, JA y flavonoides mediante ANOVA unidireccional y la prueba de rangos múltiples de Duncan con un umbral de p <0,05.

5. Conclusiones

En este estudio, identificamos y caracterizamos una nueva proteína secretada, MaCFEM85, en M. anisopliae. Se descubrió que es un efector conservado que puede interactuar con MsWAK16 y activar la respuesta de defensa de N. benthamiana. Demostramos que el dominio CFEM y el residuo de cisteína en la posición 52 en MaCFEM85 fueron críticos para la interacción. Esta interacción puede activar respuestas inmunes relacionadas con JA y mecanismos de resistencia a enfermedades y insectos en la planta.

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