Las partículas finas 2.5 regulan al alza la melanogénesis en células de melanoma humano A375
Jul 19, 2023
Sr. Editor: Estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a partículas finas 2,5 (PM2,5) aumenta el riesgo de hiperpigmentación de la piel.[1] Un estudio reciente demostró que PM2.5 podría inducir la melanogénesis mediante la regulación de la tirosinasa (TYR) y la expresión de la proteína 1 (TYRP1) y 2 (TYRP2) relacionada con la tirosinasa a través de la activación de señalización del receptor de hidrocarburo de arilo (AhR)/proteína quinasa activada por mitógeno.[ 2] El AhR está muy extendido en las células de la piel y su ligadura controla la oxidación/antioxidación, la función de barrera epidérmica, la respuesta fotoinducida, la inmunidad innata y la melanogénesis. Puede ser activado por dioxinas e hidrocarburos aromáticos policíclicos (los constituyentes de PM2.5) y su activación induce la transcripción de genes que codifican enzimas del metabolismo xenobiótico tanto de fase I como de fase II (citocromos P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 y CYP1B1). [3,4] El BaP y las dioxinas peligrosas activan el AhR con una sólida generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que está mediada, al menos en parte, por CYP1A1. Además, el estrés oxidativo mediado por CYP1A1-es responsable de la producción de citocinas proinflamatorias, como la interleucina (IL)-1, IL-6 e IL-8 en el medio ambiente. queratinocitos humanos tratados con contaminantes.[3,5] Sin embargo, hay muy pocos estudios sobre los efectos tóxicos de PM2.5 en las células melanogenéticas. Aquí, tratamos células de melanoma humano A375 con varias concentraciones de PM2.5 para investigar si PM2.5 puede promover la melanogénesis y su relación con la señalización de AhR, el estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria.
El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y tiene la capacidad de eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.
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El PM2.5 se recolectó durante el invierno (de diciembre a enero) en Beijing. Se utilizó un muestreador inteligente de partículas suspendidas totales (TSP) de flujo grande HY-1000 (cortador opcional de PM2.5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, China) para el muestreo con filtro de cuarzo. La membrana de cuarzo se sumergió en etanol al 75 por ciento seguido de agitación ultrasónica. Se utilizó agua estéril para preparar una solución madre de alta concentración. Se cultivaron células de melanoma humano A375 en CO2 al 5 por ciento a 37 grados en medio Eagle modificado de Dulbecco regular (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, EE. UU.) que contenía suero fetal bovino (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las células A375 se trataron con diferentes concentraciones de PM2.5 (0, 100, 200 y 400 ug/mL) durante 24 horas y las células se usaron para los siguientes estudios. Para el análisis estadístico se utilizaron la prueba t de Student para datos no apareados y el análisis de varianza unidireccional, y se consideró que P < 0,05 era estadísticamente significativo.
Para investigar la influencia de PM2.5 en las células A375, se detectó la proliferación celular usando un kit CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y la apoptosis celular usando isotiocianato de fluoresceína de anexina V/ kit de apoptosis con yoduro de propidio (FITC/PI) (Multisciences, EE. UU.), basado en las instrucciones del fabricante. Los resultados indicaron que PM2.5 exhibió citotoxicidad dependiente de la concentración para las células A375, pero no afectó la apoptosis [Figura 1 complementaria, http://links.lww.com/CM9/A917].
Se utilizó el método NaOH para determinar el contenido de melanina. Las células A375 tratadas con PM2.5- se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron con agua. Los lisados se centrifugaron a 12, 000 r/min durante 5 minutos, se lavaron con ácido tricloroacético al 10 por ciento (500 ml) (Sigma, St. Louis , MO, EE. UU.) y etanol al 75 por ciento (500 ml), y luego se clarifica nuevamente. A continuación, se añadieron a los gránulos 50 ml de NaOH 1 mol/l que contenía sulfóxido de dimetilo al 10 por ciento durante 1 hora a 80 grados centígrados. La absorbancia a 490 nm (OD 490) se midió utilizando un lector de microplacas. Como TYR es la enzima melanogénica más importante, a continuación detectamos la actividad de TYR mediante el ensayo de levodopa (L-DOPA). Se sembraron placas de seis pocillos (Corning, EE. UU.) con células A375 a una densidad de 3 x 105 células/pocillo. A continuación, las células se lavaron con PBS y se lisaron con desoxicolato de sodio al 0,5 por ciento (Sigma). El lisado se dividió en tres grupos y se añadió 0,1 por ciento de L-DOPA (Sigma) a cada muestra. Después de 5 minutos, se midió la DO 490 y se usó L-DOPA al 0,1 por ciento como estándar. También medimos los niveles de expresión de ARNm y proteína de TYR. El ARN total se extrajo utilizando un mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.). La transcripción inversa se realizó con el kit ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japón). Posteriormente, se realizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) en Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japón). Los cebadores de Invitrogen se presentan en la Tabla complementaria 1, http://links. lww.com/CM9/A917, y el nivel de expresión de cada ARNm se calculó mediante el método 2*DDCT. Los niveles de expresión de proteínas se analizaron mediante transferencia de Western. Las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón RIPA (Beyotime, China) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (mezcla de inhibidores de proteasa, 20:1, Sigma-Aldrich). Las concentraciones de proteínas se midieron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime, China). La proteína total se hirvió a 70 grados durante 10 minutos, se separó en un gel del 4 al 12 por ciento a 200 V durante 40 minutos, se transfirió a una membrana a 4 grados usando 120 mA durante 75 a 100 minutos y luego se incubó con agua al 5 por ciento. leche descremada durante 1 hora. A continuación, las membranas se sondaron con anticuerpos anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 y anti-CYP1B1 (Abcam) durante la noche a 4 grados. Se usó anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Proteintech, EE. UU.) como anticuerpo secundario. Los resultados indicaron que PM2.5 aumentó el contenido de melanina y la actividad de TYR de forma dependiente de la dosis. Los niveles de expresión de ARNm y proteína de TYR aumentaron [Figura complementaria 2 A-D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 puede aumentar la actividad de TYR al activar la vía AhR. Para determinar si PM2.5 afecta la señalización de AhR, detectamos los niveles de transcripción de AhR y sus genes clásicos aguas abajo CYP1A1 y CYP1B1 mediante qRT-PCR y transferencia Western. Los resultados mostraron que PM2.5 regulaba al alza los niveles de expresión de ARNm de AhR y CYP1A1, así como la expresión de proteína de CYP1A1 [Figura complementaria 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
La activación de AhR provoca la generación de ROS, que también puede aumentar la actividad de TYR.[5] Por lo tanto, evaluamos la producción de ROS utilizando 20,70 -diclorofluoresceína diacetato (DCFHDA) y citometría de flujo. Después de 24 horas de tratamiento con PM2.5, las células A375 se incubaron con DCFH-DA (5mmol/L) durante 30 minutos a 37 grados en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces en PBS y la fluorescencia se midió con un citómetro de flujo. La intensidad de fluorescencia media se cuantificó utilizando el software FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, Nueva York, NY, EE. UU.). Como se cree que la producción de ROS inducida por CYP1A1-es responsable de la respuesta inflamatoria,[5] los niveles de expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} y factor de necrosis tumoral [TNF]-a). Se descubrió que PM2.5 aumentó la producción de ROS, así como los niveles de ARNm de IL-1a, IL-6 e IL-8 en células A375 [Figura complementaria 2 H e I, http ://Enlaces. lww.com/CM9/A917].
Los hallazgos de este estudio indicaron que PM2.5 promovió la melanogénesis y aumentó tanto la actividad como la expresión de TYR en las células A375. Además, PM2.5 podría activar la señalización de AhR e inducir el estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria, que puede ser una cascada de señalización melanogénica responsable de la hiperpigmentación.
Expresiones de gratitud
Expresamos nuestro sincero agradecimiento a los siguientes: Prof. Dr. Masutaka Furue y Prof. Dr. Tsuji Gaku del Hospital Universitario de Kyushu, quienes mejoraron el manuscrito y ayudaron con la información relacionada con AhR. También estamos agradecidos por la edición en inglés proporcionada por el Prof. Dr. Robert Schwartz de la Escuela de Medicina de Rutgers New Jersey.
Fondos
Este estudio fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 2101000271).
Conflictos de interés
Ninguno.
Referencias
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Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. Las partículas promueven la hiperpigmentación a través de la activación de señalización de AhR/MAPK y al aumentar los niveles paracrinos de a-MSH en los queratinocitos. Contaminación ambiental 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Papel potencial de PM2.5 en la melanogénesis. Medio Ambiente Internacional 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Receptor de hidrocarburos arílicos (AhR) un posible objetivo para el tratamiento de enfermedades de la piel. Hipótesis Med 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Impacto de las partículas suspendidas en el aire sobre la piel: una revisión sistemática desde la epidemiología hasta los estudios in vitro. Parte Fibra Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
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