Determinación de cinco componentes en Rehmannia Glutinosa y establecimiento de huellas dactilares por HPLC

Abstracto:El método de determinación del contenido de cinco componentes enRehmannia glutinosa, a saber,rehmanósido D, leonurina,echinacósido,cistanqueside Ayverbascósido, y se estableció la huella digital de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de Rehmannia glutinosa para proporcionar una base científica para el control de calidad de Rehmannia glutinosa. Se utilizó la columna Shiseido CAPCELL PAK C18, con acetonitrilo-0.Solución de ácido fórmico al 1% como fase móvil, elución en gradiente, temperatura de la columna de 30 grados, determinación de longitud de onda variable y caudal de 1,0. ml/min. La huella digital HPLC de Rehmannia glutinosa fue analizada por el "Sistema de evaluación de similitud de huellas dactilares cromatográficas de medicina china (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), la RSD de la prueba de precisión, la prueba de repetibilidad y la prueba de estabilidad fue 0.12%~1,58%, y la tasa promedio de recuperación de la muestra fue del 96,5% ~98,6%; la huella digital de HPLC de Rehmannia glutinosa establecida identificó 23 picos comunes, y la similitud entre la muestra de Rehmannia glutinosa y la huella digital de control fue 0.904~0,950. Los resultados sugieren que el método de determinación de contenido establecido y la huella digital de HPLC son adecuados para la evaluación de la calidad de Rehmannia glutinosa y la identificación de Rehmannia glutinosa cruda y Rehmannia glutinosa cocida, con alta precisión y buena reproducibilidad, y pueden proporcionar soporte técnico para el control de calidad de Materiales medicinales de Rehmannia glutinosa.

Palabras clave:Rehmannia glutinosa; determinación de contenido; huella dactilar; evaluación de calidad

NUEVA CISTANZA DE HIERBAS CONEQUINACOSIDO,CISTANCHESIDE AYVERBASCOSIDO

Rehmannia glutinosaes el tubérculo de raíz fresco o seco de la planta Scrophulariaceae Rehmannia glutinosa Libosch. Debido a los diferentes métodos de procesamiento, se divide principalmente en rehmannia fresca, rehmannia cruda y rehmannia cocida [1-2]. Las principales zonas de producción son las tierras de Henan, Shanxi, Shaanxi, etc. Entre ellos, la rehmannia glutinosa cruda tiene los efectos de eliminar el calor y enfriar la sangre, nutrir el yin y promover la producción de líquidos, y se utiliza principalmente para tratar el calor en la sangre, toxinas y manchas calientes, etc.; La rehmannia glutinosa cocida tiene los efectos de nutrir la sangre y el yin, reponer la esencia y reponer la médula, y se utiliza principalmente para tratar la deficiencia de sangre, clorosis, etc. Palpitaciones, inquietud, etc.[1-2]. Los dos tienen propiedades y sabores diferentes, pero ambos pertenecen a los meridianos del hígado y del riñón. Rehmannia glutinosa contiene componentes químicos complejos, que incluyen principalmente iridoides, iononas, glucósidos de feniletanol, flavonoides, etc. [3-5].

Después de que Rehmannia glutinosa se procesa mediante diferentes métodos de procesamiento, los tipos, contenidos y proporciones de los componentes químicos en cada producto procesado varían mucho, lo que resulta en diferencias significativas en su actividad farmacológica [6-10]. de acuerdo a

Estudios relacionados[11-12] muestran que en el proceso de cambio de Rehmannia glutinosa de "crudo" a "cocido", el contenido de componentes químicos como catalpol, agripalma, estaquiosa y aminoácidos disminuyó significativamente, y el contenido de fructosa, 5-hidroximetilfurfural, etc. Los contenidos de , isorebascósido, etc. aumentaron significativamente. En la actualidad, el control de calidad de rehmannia glutinosa cruda y cocida utiliza principalmente los contenidos de catalpol y rehmanniaside D como indicadores de evaluación. Los indicadores del sistema de evaluación son relativamente únicos, lo que dificulta el control integral de la calidad de rehmannia glutinosa. Además, los estudios han demostrado que el contenido de rehmannia glutinosa D cambia antes y después del procesamiento. Es pequeño y tiene poca especificidad para caracterizar los cambios de composición después del procesamiento y el grado de procesamiento [12-13].

Por lo tanto, para evaluar la calidad de Rehmannia glutinosa de manera más completa, este estudio estableció la relación entre rehmanniasido D y Yimu en Rehmannia glutinosa.

Métodos de determinación para el contenido de cinco componentes comunes, incluidos glucósido, equinácea, cistanqueósido A y verbascósido, y establecieron una huella digital HPLC de Rehmannia glutinosa para analizar el contenido de los componentes principales en Rehmannia glutinosa de diferentes áreas de producción y antes y después del procesamiento. con el fin de brindar información para el control de calidad de Rehmannia glutinosa. Apoyo técnico.

Instrumentos, reactivos y medicamentos de prueba.

Cromatógrafo líquido de alto rendimiento Agilent 1260 (el detector es una matriz de diodos); balanza analítica electrónica de rango variable (METTLER TOLEDO); limpiador ultrasónico digital (Fábrica de Instrumentos Ultrasónicos de Shanghai, KH-500DE). El metanol (Grupo Sinopharm) es de grado analítico; el acetonitrilo (Merck) es de grado cromatográfico; El agua es agua embotellada de Watson. Sustancia de referencia Rehmannia glutinosa D (número de lote RFSD8401909016, pureza 98,0%), sustancia de referencia glucósido de leonurus (número de lote RFS-Y22002208010, pureza 98,0%), y sustancia de referencia cistanchesida A (lote número RFS-R05002009014, pureza 96,0%) se adquirieron todos de Chengdu Ruifensidedan Biotechnology Co., Ltd.; La sustancia de referencia equinacósido (número de lote 111670-201907, pureza 91,8%) y la sustancia de referencia verbascósido (número de lote 11530-201914, pureza 95,2%) se compraron en los Institutos de Inspección de Alimentos y Medicamentos de China. Se recolectaron muestras de Rehmannia (SX1 ~ SX4, HN1 y HN2) de diferentes áreas productoras (ver Tabla 1), de las cuales SX4 y HN2 fueron vaporizadas por SX1 y HN1 respectivamente, y SX2 y SX3 se recolectaron de la misma área productora. Todas las muestras fueron identificadas como auténticas por Song Pingshun, jefe de medicina china del Instituto Provincial de Control de Drogas de Gansu.

Tabla 1 Información de muestras de Semen Rehmanniae

2.1 Condiciones cromatográficas

Se utilizó la columna Shiseido CAPCELL PAK C18 (250.0 mm×4,6 mm, 5 μm), acetonitrilo como fase móvil A y solución de ácido fórmico al 0,1 % como fase móvil B. Las condiciones de elución en gradiente fueron: 0-3 min, 1% A; 3-9 min, 1%A→5%A; 9-24 min, 5%A→35%A; 24-35 min, 35%A→65%A; 35-40 min, 65%A→90%A. Detección de longitud de onda variable (0-24 min, 203 nm; 24-40 min, 330 nm). El volumen de inyección fue de 15 µL de la solución de referencia y 20 µL de la solución de muestra.

2.2 Preparación de la solución

2.2.1 Preparación de la solución de referencia

Tome cantidades adecuadas de las cinco sustancias de referencia anteriores y agregue 70 % de metanol para preparar una solución de referencia mixta con una concentración másica de 0,4 mg/ml.

2.2.2 Preparación de la solución de prueba

Pesar aproximadamente 1,0 g de polvo de Rehmannia (pasado a través del tamiz n.° 2), pesar con precisión, colocar en un matraz cónico tapado, agregar con precisión 25 ml de metanol al 70 %, sellar, pesar, tratar ultrasónicamente (potencia 300 W, frecuencia 50 kHz) durante 30 min, dejar enfriar a temperatura ambiente, pesar nuevamente, recuperar la masa perdida con metanol al 70%, filtrar y tomar el filtrado para obtener.

2.3 Investigación metodológica

2.3.1 Investigación de especificidad

Tome la solución de referencia mixta en "2.2.1" y la solución de prueba (muestra SX1) en "2.2.2", e inyecte y mida de acuerdo con las condiciones cromatográficas en "2.1". Los resultados muestran que el cromatograma de la muestra de Rehmannia presenta un pico cromatográfico con el mismo tiempo de retención que los estándares de referencia de Rehmannia glutinosa D, Leonurina, Echinacósido, Cistanche deserticola A y Verbascósido (ver Figura 1), lo que indica que este método tiene fuertes especificidad.

2.3.2 Investigación de relaciones lineales

Añadir 70% de metanol a la solución de referencia mixta, diluir 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces y 250 veces respectivamente, e inyectar y medir de acuerdo con las condiciones cromatográficas en "2.1". Las curvas estándar se dibujaron con la concentración de masa de cada referencia como eje horizontal (x) y el área del pico cromatográfico correspondiente como eje vertical (y). Los resultados se muestran en la Tabla 2, lo que indica que cada componente tiene una buena relación lineal dentro del rango de concentración de masa correspondiente.

1.rehmanniosido D; 2. leonurida; 3. equinacósido; 4. castanósido A;5. acteosido

Figura 1 Cromatogramas de investigación de especificidad.

Tabla 2 Relación lineal de 5 componentes en Semen Rehmanniae

2.3.3 Investigación de precisión

Tome la solución de prueba (muestra SX1) en "2.2.2" y realice la prueba de inyección de acuerdo con las condiciones cromatográficas en "2.1". Inyecte la muestra 6 veces seguidas, registre el área del pico de cada componente y calcule el área del pico RSD de rehmannia glutinosa D, glucósido de agripalma, glucósido de equinácea, glucósido A de cistanche y verbascósido en la muestra de prueba como 0. 46%, 0.12%, 0.85%, 0.48% y 0.82%, respectivamente, lo que indica que el instrumento tiene buena precisión.

2.3.4 Estudio de repetibilidad

Se prepararon en paralelo seis muestras de la misma muestra de raíz de Rehmannia (SX1) según el método descrito en "2.2.2" y se inyectaron y determinaron según las condiciones cromatográficas descritas en "2.1". Las RSD de los contenidos de glucósido D de raíz de rehmannia, glucósido de agripalma, glucósido de equinácea, glucósido A de cistanche y verbascosido en las seis muestras fueron 0.46%, 0.69%, 1,42%, {{ 12}}.48% y 1,58%, respectivamente, lo que indica que el método tiene buena repetibilidad.

2.3.5 Estudio de Estabilidad

Tome la solución de prueba (muestra SX1) en "2.2.2" e inyéctela y mida de acuerdo con las condiciones cromatográficas en "2.1" a 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 1{{ 15}} h, 12 h, 18 h y 24 h, respectivamente. La RSD de las áreas de pico de rehmannia glutinosa D, glucósido de agripalma, equinacósido, glucósido A de cistanche y verbascósido fue 0.94 %, 1,04 %, 0.73 %. , 0,83% y 0,71%, respectivamente, lo que indica que la solución de prueba tiene buena estabilidad dentro de las 24 h.

2.3.6 Tasa de recuperación de muestras

{{0}}.5 g de muestra de raíz de Rehmannia (SX1) con contenidos conocidos de 5 componentes se pesaron con precisión en un matraz cónico con tapón, se agregaron 6 porciones paralelas y se agregaron 5 soluciones de referencia de ciertas concentraciones. respectivamente. Las muestras se prepararon según el método indicado en "2.2.2" y las muestras se inyectaron y midieron según las condiciones cromatográficas indicadas en "2.1". Se calculó la tasa de recuperación y los resultados se muestran en la Tabla 3. La tasa de recuperación de muestra promedio de cada componente fue del 96,5% al ​​98,6% y la RSD fue del 0,73% al 1,52%, lo que indica que el método tiene buena precisión.