Gao-Zi-Yao mejora la función de aprendizaje y memoria en ratas viejas hipertensas espontáneas, parte 2
Feb 19, 2024
Animales de experimentación
Se compraron ratas macho hipertensas espontáneas (SHR) de doce meses y ocho semanas de edad en el Centro de modelos animales de Nanjing.
Existe una fuerte relación entre los machos de 8-unas semanas y la memoria. Durante este período, el cerebro del macho se desarrolla rápidamente y las conexiones entre sus neuronas aumentan gradualmente, lo que a su vez afecta el desarrollo de su memoria.
Las investigaciones muestran que la memoria de las criaturas masculinas sigue mejorando con la edad. Esto no sólo tiene un impacto significativo en su supervivencia y reproducción, sino que también les ayuda a adaptarse mejor al medio ambiente y afrontar nuevos desafíos.
Por lo tanto, debemos alentar activamente a los hombres jóvenes a participar en una variedad de actividades beneficiosas, como resolver acertijos, aprender nuevas habilidades y explorar nuevas áreas. Estas actividades estimulan sus cerebros, permitiéndoles desarrollarse más rápido y mejorar sus capacidades de memoria.
Al mismo tiempo, también debemos proporcionar un entorno y una atmósfera adecuados para las criaturas macho jóvenes. Hacer que se sientan seguros y cercanos puede favorecer el desarrollo de su cerebro y mejorar su memoria.
En resumen, deberíamos hacer todo lo posible para ayudar a los machos jóvenes a mejorar su memoria para que se conviertan en criaturas más inteligentes, más seguras y capaces. Esto no sólo favorece su desarrollo personal sino también la prosperidad y supervivencia de toda la especie. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola tiene efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antienvejecimiento, que pueden ayudar a reducir las reacciones oxidativas e inflamatorias en el cerebro, protegiendo así la salud del sistema nervioso. Además, Cistanche deserticola también puede promover el crecimiento y la reparación de las células nerviosas, mejorando así la conectividad y la función de las redes neuronales. Estos efectos pueden ayudar a mejorar la memoria, el aprendizaje y la velocidad del pensamiento, y también pueden prevenir el desarrollo de disfunciones cognitivas y enfermedades neurodegenerativas.
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En este modelo, la hipertensión comienza a desarrollarse a los 4 meses de edad con la aparición de cambios relacionados con la hipertensión en la microvasculatura cerebral a los 6 meses de edad [37].
Las ratas se alojaron en condiciones óptimas con higiene estándar, se mantuvieron a una temperatura de 25 grados con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 y se alimentaron con comida estándar para ratas y agua ad libitum.
Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las pautas para el cuidado y uso de animales establecidas por la Universidad de Soochow, lo cual es consistente con nuestro informe anterior [35].
Los experimentos se realizaron de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el uso de animales de laboratorio (NIH, publicación número 85-23, revisada en 1996). El presente estudio está informado por las pautas ARRIVE.
Se aplicó SHR de ocho semanas de edad para el control del envejecimiento (SHR-Young, n=10). Se trataron ratas de doce meses con o sin Gao-Zi-Yao para agua destilada (Old SHR-C, n=10), dosis baja (Old SHR-L, n=10), dosis media (Antiguo SHR-M, n=10), dosis alta (Antiguo SHR-H, n=10) mediante alimentación gástrica.
Dosis de Gao-Zi-Yao baja, media y alta iguales a 1/2-, 1-, dosis triples para aplicación clínica en pacientes calculadas según la superficie corporal. Gao-Zi-Yao se disolvió en 5 ml de agua destilada antes de la aplicación y se administró una sola vez con lácteos durante 4 semanas.
La presión arterial y la frecuencia cardíaca se controlaron cada semana mediante el método del manguito de la cola, y el peso corporal también se controló cada semana según nuestra observación anterior [35].
Después de 4 semanas, se realizó el experimento del laberinto acuático de Morris y las ratas se sacrificaron bajo anestesia con pentobarbital sódico (50 mg/kg ip), y se recogió tejido del hipocampo para su posterior análisis. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité de licencias de ética de la Universidad de Soochow.
Experimento del laberinto acuático de Morris
El experimento del laberinto acuático de Morris (BW-MWM101, Shanghai Bio-will Co., Ltd., Shanghai, China) se realizó como se describió anteriormente con algunas modificaciones [38]. La prueba se planificó para 6 días, los días 1 a 5 fueron para el período de entrenamiento y el día 6 fue para los resultados de la prueba.
Las ratas recibieron entrenamiento durante 2 minutos lácteos, registrando el tiempo de embarque en la plataforma como tiempo de latencia. El día 6 se retiró la plataforma. Las ratas se colocaron en el cuadrante de distancia más alejado y se registró la trayectoria de natación durante 2 minutos.
El software calculó los parámetros para la función de aprendizaje y memoria.
Medición de niveles séricos de NO y factores inflamatorios mediante ELISA.
Niveles séricos de NO (número de catálogo: S0023), IL-1 (número de catálogo: A301BH80153), IL-2 (número de catálogo: A31038348), IL-6 (número de catálogo: A30681042), y TNF- (número de catálogo: A38280855) se midieron utilizando kits ELISA disponibles comercialmente (Biotechnology Co., Ltd. Shanghai enzima investigación. Shanghai, China). Todos los pasos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
tinción de nissl
Se aisló tejido de hipocampo de rata, se fijó, se incluyó en parafina y luego se incubó en una solución de tinción con azul de toluidina al 1% durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Se enjuagaron diez secciones en agua destilada, se remojaron en etanol al 95% durante 5 a 30 minutos y se deshidrataron en etanol al 100%.
Después de la deshidratación, la rebanada se colocó en xileno y se cubrió con un medio de resina. El número de neuronas en las regiones CA1, CA2 y la circunvolución dentada (DG) del hipocampo se observaron y analizaron utilizando el programa de análisis ImageJ.
Western blot para proteínas relacionadas con el aprendizaje y la memoria
La transferencia Western para proteínas relacionadas con el aprendizaje y la memoria se llevó a cabo como se describe en nuestro informe anterior con algunas modificaciones [39].
Los tejidos del hipocampo se homogeneizaron con tampón RIPA (50 mmTris, NaCl 150 mM, 1% Triton-X-100, pH 7,0) que contenía fluoruro de fenilmentanosulfonilo (R&D Systems Inc., Minneapolis, EE. UU.). Los homogeneizados se centrifugaron a 12,000 × g durante 10 minutos a 4 grados.
Las proteínas celulares se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Hybond TM-ECL; AmershamPharmacia Biotech, Inc.). Las membranas se bloquearon en leche descremada al 5% en PBS y 0.Tween al 1%-20a temperatura ambiente.
Luego, las transferencias se incubaron con anticuerpo primario: receptor 1 anti-glutamato (1:1000, Abcam, Inc., número de catálogo: ab183797), anticuerpo antiNMDAR2B (1:1000, Abcam, Inc., número de catálogo: ab28373), anticuerpo anti-fosfo -Anticuerpo CaMKII (1:1000, Abcam, Inc., número de catálogo: ab171095), anticuerpo antifosfo-CREB (1:1000, Abcam, Inc., número de catálogo: 32096) o anti-GAPDH (Santa Cruz Biotech,Inc., Número de catálogo: sc-47724).
A continuación, las membranas se incubaron durante 1 h con un anticuerpo secundario (Ig-G anti-conejo conjugado con HRP, 1:2000, Abcam, Inc. Número de catálogo: ab205718). Luego, las membranas se lavaron tres veces durante 15 minutos usando TBS-T para eliminar el exceso de anticuerpos antes de la incubación durante 1 minuto con reactivos quimioluminiscentes (ECL, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.).
Además, las bandas inmunorreactivas se detectaron mediante un sistema de análisis de gel de electroforesis (GL2200 Pro, Crestream Inc. EE. UU.). La intensidad de las bandas se analizó mediante el software Image J. La cantidad de proteínas diana se normalizó mediante la expresión de GAPDH [39].
análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó el software SPSS 18.0. Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos agrupados se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de Student-Newman-Keuls. Un valor P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo según nuestro informe anterior [35].
Resultados
Presión arterial sistólica (PAS), frecuencia cardíaca y peso corporal entre SHR jóvenes y SHR mayores
Yong SHR mostró una PAS más baja en las primeras dos semanas en comparación con el antiguo SHR, luego aumentó hasta no haber diferencias entre los dos grupos en las últimas tres semanas (Fig. 2A).
Por el contrario, la frecuencia cardíaca no hubo diferencias entre los dos grupos en las primeras dos semanas, luego la SHR de los jóvenes aumentó notablemente en comparación con la SHR de los viejos en las últimas tres semanas (Fig. 2B). Los SHR jóvenes mostraron un peso corporal más bajo en comparación con los SHR mayores durante todo el período de observación (Fig. 2C).
Parámetros del laberinto acuático de Morris entre SHR jóvenes y SHR viejos
Para determinar el aprendizaje y la memoria dependientes del hipocampo, se realizó el experimento del laberinto acuático de Morris. Los SHR antiguos mostraron una latencia de escape más larga en los primeros cuatro días en comparación con los SHR jóvenes (Fig. 3A).
Los tiempos de cruzar el cuadrante objetivo fueron menores en los SHR antiguos que en los SHR jóvenes (Fig. 3B).
El porcentaje de tiempo en el cuadrante de la plataforma objetivo fue más corto en los SHR antiguos en comparación con los SHR jóvenes (Fig. 3C). El porcentaje de longitud del camino en el cuadrante también fue más corto en los SHR antiguos en comparación con los SHR antiguos (Fig. 3D). Estos resultados sugieren que el viejo SHR tiene un deterioro en la función cognitiva.
Número de neuronas en el hipocampo entre SHR jóvenes y SHR viejos
El número de neuronas en diferentes áreas del hipocampo se contó mediante tinción de Nissl. Los resultados mostraron que hay una menor cantidad de neuronas en las regiones CA1, CA2 y DG de los SHR antiguos en comparación con los SHR jóvenes (Fig. 4).
Expresiones de proteínas relacionadas con el aprendizaje y la memoria en el hipocampo entre SHR jóvenes y SHR mayores
Los resultados de la transferencia Western mostraron que la expresión de proteínas relacionadas con el aprendizaje y la memoria (GluR1, NMDAR 2B, CaMK II fosforilada y CREB fosforilada) en el hipocampo SHR antiguo era menor que en el hipocampo SHR joven (Fig. 5).
Efecto de Gao‑Zi‑Yao sobre la PAS, la frecuencia cardíaca y el peso corporal en el antiguo SHR
Se analizó el efecto de Gao-Zi-Yao sobre la PAS. El tratamiento con una dosis baja de Gao-Zi-Yao disminuyó notablemente la PAS en los SHR antiguos desde la segunda a la cuarta semana en comparación con el grupo de control de SHR antiguos, las dosis medias y altas de Gao-Zi-Yao disminuyeron notablemente la PAS en los SHR antiguos desde la primera semana hasta la cuarta semana en comparación con el antiguo SHR de control (Fig. 6A). Estos resultados indican que Gao-Zi-Yao ejerce un efecto antihipertensivo en el antiguo SHR.
También comparamos los datos sobre los efectos de la frecuencia cardíaca y el peso corporal de Gao-Zi-Yaoon. Nuestros datos demostraron que no hubo diferencias significativas en la frecuencia cardíaca y el peso corporal entre todos los grupos durante todo el período de observación (Fig. 6B, C).
Efecto de Gao‑Zi‑Yao sobre los niveles séricos de NO, IL‑1, IL‑2 y TNF‑ en SHR antiguos
El tratamiento con dosis medias y altas de GAO-ZIYAO aumentó los niveles séricos de NO en comparación con los niveles en el grupo de control SHR (Fig. 7A). El tratamiento con todas las dosis probadas de GAO-ZI-YAO redujo los niveles séricos de IL-1, IL-2 en comparación con los niveles en el grupo de control SHR (Fig. 7B, C); sin embargo, sólo la dosis alta de GAO-ZI-YAO suprimió los niveles séricos de TNF- (Fig. 7D).
Estos resultados demuestran que GAO-ZI-YAO podría regular el estrés oxidativo y la inflamación.
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