Inmunidad innata del epitelio gastrointestinal: regionalización y organoides como nuevo modelo

El tracto gastrointestinal humano está en constante contacto con estímulos microbianos. Sus barreras deben garantizar la coexistencia con las bacterias comensales al tiempo que permiten la vigilancia de patógenos intrusos. En el centro de la interacción se encuentra la capa epitelial, que marca los límites del cuerpo. Está equipado con una multitud de diferentes sensores inmunes innatos, como los receptores tipo Toll, para generar respuestas inflamatorias a los microbios. La disfunción de este intrincado sistema da como resultado patologías asociadas con la inflamación, como la enfermedad inflamatoria intestinal. Sin embargo, la complejidad de las interacciones celulares, su base molecular y su desarrollo siguen sin comprenderse bien. En los últimos años, los organoides derivados de células madre han ganado cada vez más atención como modelos prometedores tanto para el desarrollo como para una amplia gama de patologías, incluidas las enfermedades infecciosas. Además, los organoides permiten el estudio de la inmunidad innata epitelial in vitro. En esta revisión, nos enfocamos en la barrera epitelial gastrointestinal y su organización regional para analizar la detección y el desarrollo de la inmunidad innata.

La exposición a estímulos microbianos puede mejorar la inmunidad, porque los estímulos microbianos pueden estimular al cuerpo para que produzca células inmunitarias y moléculas inmunitarias, estimulando así la respuesta inmunitaria del cuerpo. Específicamente, la exposición a estímulos microbianos puede activar células inmunitarias como macrófagos, células dendríticas y células asesinas naturales, acelerar la proliferación y diferenciación de células inmunitarias y mejorar la vitalidad y la resistencia a enfermedades de las células inmunitarias. Además, los estímulos microbianos también pueden promover las respuestas inflamatorias y la regulación inmunitaria, y mejorar las defensas inmunitarias del cuerpo contra los patógenos. Por lo tanto, una exposición razonable a estímulos microbianos puede promover la mejora de la inmunidad humana. Se puede ver que necesitamos mejorar la inmunidad. Cistanche puede mejorar significativamente la inmunidad. La ceniza de carne contiene varios ingredientes biológicamente activos, como polisacáridos, dos hongos, Huang Li, etc. Estos ingredientes pueden estimular varios tipos de carne en el sistema inmunológico. células, aumentando su viabilidad inmunológica.

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Palabras clave

Tracto gastrointestinal. Inmunidad. Regionalización y organoides.

Introducción

El tracto gastrointestinal (GI) es necesario para la digestión de los alimentos y se extiende desde la cavidad oral a través del esófago, el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso hasta el ano. La luz GI está colonizada por una gran variedad de comensales, simbiontes y, en ocasiones, patógenos. La colonización microbiana sigue un gradiente con menos de 103 microbios/ml en el estómago a 103–107 microbios/ml en el intestino delgado y 1011–1012 microbios/ml en el colon (revisado en [1–3]). Desde el estómago glandular en adelante, el tracto gastrointestinal está revestido por una sola capa de células epiteliales columnares. Esta capa epitelial comprende diferentes células especializadas, estrechamente entrelazadas por complejos de proteínas de unión, que refuerzan la barrera física (Fig. 1).

La interacción entre la microbiota intestinal y los patógenos ingeridos y las células epiteliales está mediada por receptores de reconocimiento de patrones (PRR), incluidos los receptores tipo Toll (TLR), los receptores similares al dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD) (NLR) y otros. receptores citosólicos (Fig. 2, revisado en [7, 11]). Estos PRR juegan un papel clave en el reconocimiento de patrones moleculares asociados a microbios (MAMP) y patrones moleculares asociados a daños (DAMP). Tras la activación de PRR en las células epiteliales, las cascadas de señalización aguas abajo inducen la expresión de diferentes citocinas y quimiocinas a través de vías inflamatorias, como la vía NF-κB, para dirigir las células inmunitarias profesionales (revisado en [8, 12–16]). Además de los PRR clásicos, recientemente se han descubierto otros sensores de actividades bacterianas, como la alfa-quinasa 1 (ALPK1) [17-19]. Los inflamasomas, complejos citoplasmáticos compuestos por proteínas NLR, reconocen patrones moleculares adicionales, como los metabolitos bacterianos (revisado en [7, 9]).

Las respuestas inmunitarias innatas gastrointestinales, incluida la detección de PRR, deben equilibrar la necesidad de protección contra patógenos potencialmente dañinos con la capacidad de tolerar la exposición al microbioma luminal diverso. Por lo tanto, se espera que la expresión y la función de la señalización de PRR tengan un impacto importante no solo en la detección de patógenos, sino también en la homeostasis de los tejidos (Cuadro 1) y enfermedades inflamatorias, incluidas la gastroenteritis aguda, la gastritis y las enfermedades inflamatorias del intestino (EII) (revisado en [ 12, 13, 20, 21]). Aunque cada una de estas enfermedades muestra patogenias completamente diferentes, comparten una característica crítica: la interfaz entre el medio ambiente y el cuerpo se altera significativamente. Sin embargo, existe un debate en curso acerca de si los cambios en la capa epitelial intestinal, en particular aquellos que afectan su función inmune innata, son causa o consecuencia de las enfermedades mencionadas.

La mayor parte del conocimiento sobre la señalización de PRR se ha recopilado a partir de la investigación sobre células hematopoyéticas. Ha sido un desafío discriminar las funciones de la señalización de PRR en las células epiteliales de las de las células inmunitarias infiltrantes. Los principales obstáculos incluyen dificultades para aislar células epiteliales puras y generar anticuerpos confiables contra los PRR. Con el avance de los organoides que se derivan de las células madre epiteliales intestinales, ahora está disponible un modelo experimental reduccionista que permite investigar la respuesta inmunitaria innata de las células epiteliales primarias. Los organoides se definen como cultivos celulares 3- dimensionales derivados de células madre que tienen la capacidad de autoorganización y conservan algunas de las funciones del órgano original (p. ej., secreción, filtración, absorción, contracción). Dado que los organoides se pueden cultivar a partir de células madre adultas residentes en tejidos (ASC) o de células madre pluripotentes (PSC), las células no se transforman. Juntos, los dos tipos de organoides cubren un amplio repertorio de órganos que se pueden imitar (revisado en [4, 22, 23]). Ambas tecnologías tienen sus ventajas (revisadas en [4, 22, 23]). Por ejemplo, los cultivos de organoides derivados de ASC tienen un tremendo potencial de expansión y son relativamente homogéneos, y los organoides derivados de PSC son más complejos en el sentido de que combinan células de orígenes de desarrollo muy diferentes (por ejemplo, células epiteliales y mesenquimatosas). Los organoides derivados de PSC permiten el análisis de los pasos de desarrollo, pero es posible que no alcancen el nivel completo de diferenciación en la capa epitelial que se encuentra in vivo [24]. Los organoides derivados de ASC generados a partir de tejidos fetales también pueden permitir el estudio de la maduración de los epitelios fetales ya que envejecen en cultivo [24, 25].

Esta revisión destacará los conocimientos de los estudios que utilizan organoides y discutirá el potencial de esta tecnología para el estudio de la inmunidad innata epitelial. Nos enfocamos en la organización regional en el tracto gastrointestinal.

Identidad regional y señalización inmune innata en el tracto GI

Al observar las enfermedades gastrointestinales, es importante tener en cuenta que algunas de ellas se limitan a una sección específica del tracto gastrointestinal. La EII incluye la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (CU), que muestran un patrón de inflamación diferencial y específico de la enfermedad: mientras que la CU comienza en el recto y se encuentra en el colon, la EC puede afectar todas las partes del tracto GI desde la cavidad bucal hasta el ano. Además, la EC se caracteriza por una inflamación segmentaria y discontinua dentro del tracto gastrointestinal, mientras que la CU generalmente se describe como una inflamación continua del colon (revisado en [26, 27]). En el esófago, el estómago y el colon, la incidencia de cáncer es alta, y la infección y la inflamación pueden promover el desarrollo y la progresión de estos cánceres (revisado en [28, 29]). Por el contrario, la transformación maligna en el intestino delgado es muy rara (revisado en [30]). La aparente especificidad de segmento de estas enfermedades en el tracto GI sigue siendo enigmática, pero es tentador especular que su origen específico de la región tiene sus raíces en alteraciones específicas de la región del sistema estrechamente equilibrado de la función de barrera epitelial, la inmunidad innata y la regeneración de la mucosa. . Por lo tanto, es interesante resaltar las diferencias en los segmentos dentro del tracto GI.

El tracto GI comprende varios segmentos definidos anatómicamente con funciones físicas muy distintas (revisado en [31]). La función principal del estómago es la digestión de los alimentos y la eliminación de los patógenos entrantes por el ácido gástrico. Los nutrientes no tienen que llegar a la capa epitelial del estómago; por lo tanto, el cuerpo invierte mucho en una barrera protectora de moco, protegiendo a las células epiteliales no solo de su ácido sino también del contenido luminal (revisado en [32, 33]). Por el contrario, la función principal del intestino delgado no es solo la digestión sino también la absorción de nutrientes. De acuerdo con esto, el intestino delgado tiene un área de superficie significativamente agrandada debido a que las vellosidades sobresalen en la luz intestinal, donde las superficies de las células entran en estrecho contacto con los nutrientes. La mayor parte de la digestión tiene lugar en el intestino delgado proximal, el duodeno y el yeyuno, donde las vellosidades son largas y delgadas. El yeyuno tiene la proporción más alta de células de Paneth que secretan péptidos antimicrobianos [34], que decoran el moco bastante suelto, protegiendo así la capa epitelial y manteniendo las criptas estériles (revisado en [35]).

Las vellosidades se vuelven progresivamente más cortas y anchas hacia el íleon (revisado en [36]), donde nuevamente, el moco asume una parte importante de la protección: con la mayor proporción de células caliciformes, el íleon tiene una capa de moco más gruesa y una menor tasa de digestión y absorción que el yeyuno [34] (revisado en [31]). Por último, el colon reabsorbe agua y se convierte en una cubierta de moco extensa, espesa y de dos capas para poder albergar de manera segura billones de bacterias comensales. El colon no tiene vellosidades y las criptas son más pequeñas que las del intestino delgado. No hay células de Paneth, y la proporción de células caliciformes puede ser de hasta el 25 por ciento de la capa epitelial [37]. Así, los tres segmentos intestinales tienen diferentes estrategias para mantener una distancia segura entre las células epiteliales y la microbiota. El reconocimiento de MAMP y la activación de las vías inmunes es otra capa de esta interacción y, por lo tanto, es razonable que también estén estructurados a lo largo del tracto GI (revisado en [38]). Sin embargo, sigue siendo un enigma fascinante sobre qué es exactamente lo que da forma a la estructura de la organización PRR.

Si bien es intuitivo que los genes importantes para las funciones regionales, como la digestión y la absorción de nutrientes, siguen una compartimentación espacial a lo largo del eje cefalocaudal (revisado en [39]), tal organización no se esperaba para la señalización inmunitaria innata epitelial. Estudios anteriores habían informado sobre la regulación de la señalización de PRR en respuesta a la estimulación con MAMP. Por ejemplo, la capacidad de respuesta de TLR4 disminuye después del nacimiento, presumiblemente debido a la exposición a LPS durante el parto y la posterior colonización del intestino [40]. Además, la estimulación de TLR9 con su ligando CpG-DNA conduce a una disminución en la expresión de Tlr4 e inhibe la señalización de TLR4 [41]. Por lo tanto, se esperaba que el contacto con los microorganismos, sus moléculas y metabolitos en el tracto GI conduciría al silenciamiento de la expresión de PRR hacia la luz intestinal (revisado en [14]). Sin embargo, los resultados contradictorios, causados ​​por dificultades técnicas como anticuerpos poco confiables dirigidos a los TLR, generaron confusión en el campo y no estaba claro si se expresaba o no un PRR en particular (revisado en [42]). Las primeras transferencias Northern para el ARNm de Tlr2 y Tlr4 en células epiteliales aisladas ex vivo indicaron que los niveles de expresión de estas dos moléculas Tlr eran específicos del segmento: Tlr2 se expresó principalmente en el colon, mientras que Tlr4 se expresó principalmente en el estómago y el colon. Los autores denominaron esto " compartimentación estratégica" de estos TLR [43]. Estudios recientes ahora han descubierto que este principio de expresión específica de segmento se extiende más allá de estos dos TLR y ha desentrañado una organización regional altamente compleja de señalización de PRR que no siempre sigue la carga microbiana [44, 45].

El primero de los dos estudios provino del grupo de Barton y reveló varios niveles de organización de la expresión de TLR. El grupo generó cinco cepas de ratones informadores, lo que permitió el análisis de la expresión de TLR2, 4, 5, 7 y 9, respectivamente. TLR2 y 5 se expresaron en el intestino delgado y el colon proximal, TLR4 se expresó en el colon y TLR7 y 9 no se expresaron. La expresión del reportero en los organoides de estos ratones imitó de cerca la expresión in vivo, lo que indica que la expresión es independiente del contacto con la microbiota o con las células inmunitarias [45].

El segundo estudio utilizó un biobanco de organoides humanos y murinos recién generados que cubrían los diferentes segmentos del tracto GI: cuerpo, píloro, duodeno, yeyuno, íleon y colon. El análisis transcripcional de los organoides confirmó los patrones de expresión de los TLR informados por el grupo de Barton, pero además reveló una gran extensión de expresión diferencial de TLR, NLR, componentes del inflamasoma y otros genes relacionados con la inmunidad innata (Fig. 3 y [44]. ]). Por ejemplo, Nod2 se expresó principalmente en el estómago, mientras que las expresiones de varios componentes de la vía del inflamasoma como Nlrp1b, Nlrp6 y Aim2 se restringieron al intestino. Varios receptores se expresaron uniformemente; por ejemplo, la expresión de Tlr3 se detectó en cada segmento del tracto GI murino en grandes cantidades, mientras que Tlr5 se expresó en cada segmento pero en cantidades bajas [44]. Como resultado, cada segmento parece tener su propio complemento específico de receptores inmunitarios innatos y componentes de señalización.

La comparación de los organoides gastrointestinales humanos y murinos demostró que en ambas especies el principio de la organización compleja de los componentes de señalización de PRR era el mismo, pero los perfiles de expresión de PRR individuales podían diferir. Algunos PRR, como TLR4 y NLRP6, tenían un patrón similar a lo largo del tracto gastrointestinal de ambas especies. TLR4 se expresó predominantemente en el estómago y el colon y la expresión de NLRP6 se ​​restringió a los segmentos del intestino. Por otro lado, varios PRR como TLR1 y TLR2 mostraron patrones diferentes entre ambas especies. Mientras que en los organoides murinos, la expresión de ambos aumentó a lo largo del tracto GI y fue más alta en el colon, en los organoides humanos la expresión fue más alta en el estómago y disminuyó a lo largo del tracto GI [44]. Además, la expresión de TLR5 fue mayor en los organoides humanos, observándose los niveles más altos en el estómago [44].

Como se mencionó anteriormente, los organoides también permiten probar si una ruta en particular es funcional mediante la adición del ligando y el análisis posterior de la expresión del gen objetivo aguas abajo. Complementando el análisis de expresión específica de la región, el estudio también encontró que los organoides humanos y murinos muestran una función específica de la región: el estómago murino respondió al ligando LPS de TLR4, pero no al ligando de TLR2 PAM3CSK4 o al ligando de TLR5 flagelina, mediante la regulación positiva de NF- Gen diana de κB Cxcl2. El yeyuno murino sobrerregulaba Cxcl2 en respuesta a PAM3CSK4 y flagelina, pero no en respuesta a LPS. Además, el colon expresó Cxcl2 en respuesta a todos estos 3 ligandos probados [44]. Por el contrario, los organoides humanos de todas las regiones expresaron el análogo de Cxcl2 humano IL-8 en respuesta a flagelina, pero no en respuesta a LPS y PAM3CSK [44]. Por lo tanto, no solo la expresión sino también la función de los PRR en el intestino está altamente organizada y es específica del segmento. Estos experimentos se realizaron agregando el estímulo al medio organoide, estimulando así solo el lado basal, ya que el lado apical se enfrenta a la luz sellada de los organoides. Otros experimentos demostraron que existe un nivel de organización aún mayor, ya que la expresión de PRR dentro de un segmento puede restringirse a tipos de células específicos o incluso a ubicaciones subcelulares, como solo el compartimento basal. Estos se describen con más detalle a continuación.

Cada región del tracto GI expresa su conjunto específico de genes inmunitarios innatos. Aunque es difícil hacer una generalización, los datos actuales sugieren que los TLR se expresan más en el estómago y el colon, mientras que el intestino delgado se caracteriza por la expresión de componentes del inflamasoma. Actualmente, el mecanismo molecular subyacente y el beneficio evolutivo no están claros.

Sospechamos que las barreras físicas y químicas que cubren las capas epiteliales en los diferentes segmentos intestinales requieren el monitoreo de amenazas específicas. Por ejemplo, el estómago y el colon tienen una capa mucosa espesa de dos capas con la capa mucosa interna firmemente adherida a la capa epitelial, mientras que el intestino delgado está cubierto por una capa mucosa delgada y viscosa [46]. Las diferentes constituciones de las capas de moco, a su vez, probablemente se deban a las diferentes funciones de los respectivos segmentos intestinales (digestión frente a absorción de nutrientes frente a resorción de agua). Es concebible que el espesor del moco influya en el tipo de PRR necesarios en sitios específicos.

Células especializadas con función inmune en el epitelio

Un concepto de larga data en la inmunidad innata epitelial es la existencia de un reconocimiento inmunitario innato específico del tipo de célula. Los prototipos de las células epiteliales especializadas con función de defensa son las células microfold (M) y las células de Paneth, complementadas recientemente por una célula caliciforme especializada, la célula caliciforme centinela. La existencia de estas células especializadas destaca los sistemas intrincados y redundantes que aseguran el equilibrio de la absorción de nutrientes, la coexistencia con la microbiota y el control de posibles invasores. La diferenciación dirigida de organoides ahora también permite el estudio de estas células en cultivo celular.

Las células M se encuentran en el epitelio asociado al folículo que cubre las placas de Peyer. Tienen una morfología única con bordes en cepillo irregulares y estructuras de microvellosidades reducidas. Su función es transportar antígenos en la luz intestinal a través de la capa epitelial hasta el tejido linfoide subyacente para la regulación de las respuestas inmunitarias [47]. Se demostró que las propias células M, así como el epitelio asociado al folículo, expresan varios TLR [48] (revisado en [14]). Sin embargo, las células M han sido difíciles de estudiar ya que no hay muchas en el tejido epitelial y solo se encuentran cerca de la estructura compleja de las placas de Peyer [47]. Sin embargo, las células M se pueden generar en cultivos de organoides utilizando la diferenciación dirigida. Para ello, se añade al medio el receptor activador del ligando NF-κB (RANKL), que regula al alza el factor de transcripción SpiB, que es característico de la diferenciación de células M [49]. Los organoides generados a partir de ratones genéticamente deficientes para la subunidad RelB de NF-κB no pueden producir células M después de la estimulación con RANKL, lo que indica que la activación de NF-κB es esencial para el desarrollo de células M [50]. En el cultivo de organoides humanos, además de RANKL, la linfotoxina y el ácido retinoico son cruciales para inducir la diferenciación hacia las células M. Estas células M captan específicamente virus entéricos como el rotavirus y el reovirus, lo que indica una fenocopia correcta de la función natural de las células M también en cultivos de organoides [51]. El trabajo futuro con organoides deberá continuar para desentrañar la interconexión de la señalización epitelial de NF-κB, el desarrollo de células M y la comunicación con las células inmunitarias.

Las células de Paneth se entremezclan con las células madre intestinales en la base de la cripta y durante mucho tiempo se ha considerado que son las guardianas del compartimento de células madre porque secretan péptidos antimicrobianos. Por ejemplo, las células de Paneth secretan alfa-defensinas, un proceso que se ha demostrado que está regulado por patrones microbianos y mecanismos inmunitarios innatos [52, 53]. Además, NOD2, que se detectó por primera vez en la región de las criptas del intestino delgado murino [54], regula la secreción de varias alfa-defensinas por las células de Paneth, lo que a su vez conduce a la activación de la inmunidad adaptativa. Las células de Paneth también expresan TLR5 y los organoides enriquecidos con células de Paneth expresan niveles especialmente altos de TLR5. La secuenciación del ARN después de la estimulación revela que mientras que los organoides normales del intestino delgado solo expresan niveles moderados de los genes diana TLR5 aguas abajo en respuesta a la estimulación con flagelina, como las citoquinas inducidas por NF-kB, los organoides dirigidos a contener un alto número de células Paneth montan un mucho más fuerte. respuesta, lo que indica que las células de Paneth son las principales respondedoras a la flagelina en el intestino delgado [44, 45]. En contraste con la expresión del gen objetivo, la respuesta más dramática de las células de Paneth (desgranulación, extrusión y muerte celular) no se desencadena por la estimulación con ligandos TLR, sino que requiere la estimulación con la citocina interferón gamma profesional derivada de células inmunitarias [55]. Estos resultados de los organoides están de acuerdo con las observaciones que muestran la desgranulación y extrusión de las células de Paneth después de la estimulación con interferón-gamma in vivo [55]. Esto subraya con elegancia el sistema de controles y equilibrios en la capa epitelial.

Las células caliciformes son importantes para la defensa epitelial porque producen las mucinas glicosiladas cruciales para la formación de una barrera mucosa en la capa epitelial (revisado en [56]). En ratones, la deficiencia de MUC2 da como resultado una inflamación espontánea y aumenta la susceptibilidad a la infección [57, 58]. Recientemente, se describió un subconjunto de células caliciformes denominadas células caliciformes centinela en el colon del ratón. Usando explantes de tejido, el estudio identificó el engrosamiento de la capa de moco en respuesta a la exposición a los ligandos TLR1/2, 4 y 5, pero no a los ligandos TLR9, NOD1 y NOD2 [59], en congruencia con un informe anterior de Tlr 2 ,4 y 5 se expresan en células caliciformes [60]. Los autores determinaron que la respuesta también dependía de la presencia del inflamasoma Nlrp6 y era independiente de los linfocitos de la mucosa usando tejidos de una variedad de ratones knockout [59]. Además, un informe anterior demostró la importancia del inflamasoma NLRP6 para la secreción de moco por parte de las células caliciformes [61]. Las imágenes revelaron que las células caliciformes específicas ubicadas en las regiones apicales de la cripta endocitaron LPS marcado con fluorescencia [59]. Estas nuevas células caliciformes centinelas no solo experimentan una rápida desgranulación y expulsión epitelial después del tratamiento con los ligandos TLR, sino que también transmiten una señal de calcio a las células vecinas a través de puentes citoplásmicos intercelulares formados por uniones comunicantes, probablemente estimulando otras células caliciformes para aumentar la secreción de moco [59]. . Tanto las células caliciformes como las de Paneth pertenecen al linaje secretor. Los organoides permiten la diferenciación dirigida hacia ambas identidades celulares, produciendo organoides fuertemente enriquecidos en células caliciformes o células de Paneth [62]. La comparación de los transcriptomas de estos organoides sesgados ayudó a identificar los reguladores clave de la vía de diferenciación [63]. El análisis adicional de los datos ómicos, así como el análisis funcional de estos organoides, permitirán una mejor comprensión del papel de ambos tipos de células en la defensa inmunitaria innata.

Por último, también se ha informado que las propias células madre expresan PRR específicos como TLR4 [64, 65], que no se encuentran en las vellosidades del intestino delgado murino o en las células de Paneth [66]. Además, la mayoría de la expresión de Nod2 en la cripta murina parece estar restringida a las células madre [67]. La estimulación con el ligando NOD2 aumentó la supervivencia de las células madre y la formación de organoides, lo que indica que la estimulación de los PRR también puede regular directamente la regeneración del epitelio intestinal.

Sin duda, los esfuerzos actuales para generar atlas de expresión génica que cubran cada tipo de célula con cada vez más detalle pronto brindarán una imagen más completa de la organización celular de la señalización inmunitaria innata en el intestino, así como en todo el cuerpo [68–71]. ].

Polaridad celular y respuestas inmunitarias innatas específicas de un lado

Finalmente, también es relevante considerar que las células epiteliales gastrointestinales están altamente polarizadas, con un lado apical especializado mirando hacia la luz del intestino con su microbiota y un lado basolateral hacia el tejido. Bajo homeostasis, los MAMP alcanzan solo el lado apical. Sin embargo, cuando se rompe la barrera epitelial, los microorganismos también pueden desafiar el lado basolateral. Por lo tanto, se ha planteado la hipótesis de que las células epiteliales pueden montar selectivamente una respuesta proinflamatoria solo cuando se estimulan desde el lado basolateral, para igualar la amenaza planteada por la señal. Por ejemplo, se demostró que TLR9 induce distintas vías de señalización cuando se estimula desde el lado apical o basolateral en líneas celulares de cáncer [72] y TLR5 solo inducía el gen de respuesta NF-κB IL-8 cuando se estimulaba desde el lado basal [73 ].
Si bien los estudios anteriores que usaron el etiquetado de anticuerpos contra TLR informaron expresión específica en un solo lado (revisado en [14, 16]), el análisis de ratones informadores de TLR que usaron tinción de una etiqueta HA no confirmó esto, sino que demostró TLR2, 4 y 5 receptores en los lados apical y basal del colon proximal, así como algunos TLR4 intracelulares [45]. Estas diferencias aparentes probablemente se deban a los diferentes enfoques técnicos.

Los organoides ahora permiten realizar pruebas funcionales directas de las respuestas inmunitarias específicas de un lado, ya que la polarización celular se conserva en los organoides. En condiciones estándar, cuando los organoides crecen en una matriz extracelular, el lado apical mira hacia la luz del organoide y el lado basal mira hacia la matriz extracelular [74–76]. Cuando se cultiva fuera de una matriz extracelular, la polaridad puede invertirse [77, 78]. Cuando las células de los organoides se siembran en superficies de cultivo celular estándar, como placas de cultivo o transpocillos, el lado apical mira hacia la luz del pocillo [44, 79–82].

Varios estudios utilizaron organoides para probar la función general de PRR particulares sin abordar las diferencias específicas entre la estimulación apical y basal. Estos estudios incluyeron el estímulo en el medio de los organoides, que, en condiciones estándar, estimula el lado basal de la célula. Usando esta técnica, se identificó la regulación al alza de los genes diana aguas abajo de NF-κB después de la estimulación basal con ligandos de TLR4 en el estómago, TLR2 y 3 en el intestino delgado y TLR2, 3, 4 y 5 en el colon de ratones [44, 45, 83] y ligandos de TLR2 y 5 en el estómago y TLR5 en el intestino delgado y colon de humanos [44]. Además, la estimulación basal de organoides de colon murino con agonistas de TLR4 indujo la diferenciación celular, especialmente hacia el linaje secretor [64], mientras que los agonistas de NOD2 indujeron una mayor supervivencia de las células madre [67, 84], y la taurina estimuló la regulación positiva dependiente de NLRP6- del gen objetivo aguas abajo del inflamasoma IL-18 [85]. En todos estos estudios, no se probó la estimulación apical.

Solo unos pocos estudios han abordado las funciones específicas de lado de los PRR. Es de destacar que, contrariamente a los estudios que utilizan líneas celulares de cáncer polarizadas, hasta ahora, ninguno de los estudios que utilizan organoides ha identificado una activación específica de un lado de un gen proinflamatorio típico dependiente de NF-κB. Las monocapas Transwell derivadas de organoides de colon humano expresan niveles similares del gen diana IL-6 de NF-κB cuando se estimulan desde el lado apical o basal con ligandos de TLR1/2, 3, 4, 5, 7/8 y 9 [82]. Los organoides gástricos murinos también respondieron a una estimulación apical con el ligando LPS de TLR4 en varios ensayos, incluso en transwells y microinyección de LPS en la luz de los organoides [44]. Las células epiteliales del intestino delgado murino no expresaron el gen diana icam1 de NF-κB en respuesta a una variedad de ligandos, independientemente de si se agregaron a organoides intactos, estimulando así el lado basal, o se agregaron a células disociadas individuales, estimulando así todos. lados [55].

Sin embargo, más allá de la respuesta de NF-κB, un estudio reciente identificó una función lateral específica de TLR3 y su importancia en la infección viral [82]. Los resultados de los experimentos con monocapas derivadas de organoides de colon humano mostraron que la expresión de los genes críticos de defensa del virus tipo I y tipo III de interferón aumentó después de la estimulación basal con el agonista de TLR3, pero no después de la estimulación con otros agonistas de TLR. Cuando se infectaron con un virus, de manera similar, la respuesta de interferón de los organoides fue mucho más fuerte cuando se infectaron desde el lado basal en comparación con la infección desde el lado apical. Esto fue visible en monocapas derivadas de organoides, así como en organoides microinyectados con el virus. El estudio identificó además al adaptador de clasificación de clatrina AP-1B como la molécula responsable de la expresión polarizada de TLR3. En consecuencia, los ratones deficientes en Ap-1b mostraron respuestas inmunitarias exacerbadas después de la infección viral [82]. Esto confirma la función polarizada de los PRR y destaca la importancia de este nivel de regulación para modular aún más el reconocimiento y la defensa de patógenos.

Hasta el momento, no existe una respuesta "única para todos" a la cuestión de la polaridad, y resolver la naturaleza específica del sitio de la señalización de PRR sigue siendo una tarea técnicamente desafiante para el futuro.

La tolerancia como respuesta a la colonización y como programa de desarrollo por defecto

Los mecanismos que contribuyen a la organización de la inmunidad innata epitelial aún no están claros. El concepto principal en este sentido ha sido la inducción de tolerancia después de la colonización del intestino estéril durante el nacimiento, la llamada ventana de oportunidad (revisado en [86–88]). Este concepto postula un período de preparación del sistema inmunitario innato y adaptativo después del nacimiento, que prepara el escenario para la homeostasis inmunitaria y las subsiguientes interacciones entre el huésped y los microbios.

El sistema inmunológico neonatal y la inmunidad innata epitelial están equipados de manera única para dominar esta transición de la esterilidad a la coexistencia con la microbiota. Al nacer, el intestino neonatal humano está completamente maduro con vellosidades intestinales y criptas que contienen células de Paneth. La capa epitelial intestinal murina neonatal es más inmadura y sufre un cambio dramático medible a nivel transcriptómico comparando diferentes etapas de desarrollo [89] y visible en la arquitectura tisular y la diferenciación celular: el eje cripta-vellosidad aún no se ha formado y la proliferación celular es inferior, sin migración celular ni exfoliación. No contiene células de Paneth maduras; sin embargo, los enterocitos producen el péptido antimicrobiano similar a la catelicidina (CRAMP) [90]. Las células de Paneth aparecen cuando se forman las criptas 2 semanas después del nacimiento [91]. En el momento del destete, el epitelio está completamente formado con criptas y vellosidades, enterocitos, células caliciformes y células enteroendocrinas; Las células de Paneth se han hecho cargo de la producción de péptidos antimicrobianos; y las células caliciformes han aumentado la producción de mucinas para formar la capa de moco (revisado en [92]).

Esta transición del epitelio dependiente de la edad va de la mano con una disminución gradual de la expresión de TLR5 en el epitelio del intestino delgado. Al mismo tiempo, la expresión de TLR3 aumenta durante el período neonatal. Otros PRR, como TLR2, 4 y 9, se expresan en niveles similares en ratones recién nacidos y adultos [45, 93].

Los mecanismos que conducen a la regulación de la expresión y función de PRR después del nacimiento siguen sin estar claros. Como se mencionó anteriormente, varios estudios han propuesto una contribución del medio ambiente, en particular la colonización microbiana, a la regulación de la expresión de PRR después del nacimiento [40, 41] (revisado en [14]). Sin embargo, los ratones libres de gérmenes frente a los libres de patógenos específicos no mostraron diferencias en la expresión de TLR ni en el intestino delgado ni en el colon, lo que indica que ni la regulación al alza de TLR3 ni la regulación a la baja de TLR5 en este período inicial dependen de la microbiota [45, 93]. Además, en organoides, la expresión de muchos, pero no todos, los componentes de señalización de PRR ya estaba definida en organoides de tejidos que nunca habían estado en contacto con productos microbianos [44]. Esto indica que una gran parte de la organización de las vías de señalización inmunitaria innata se define independientemente del contacto con la microbiota y parece estar determinada por procesos de desarrollo predeterminados, como los descritos anteriormente, que dan forma a la identidad general del tejido a lo largo del tracto gastrointestinal. . Esto no excluye un mayor ajuste de la expresión de PRR por factores ambientales durante la edad adulta.

La importancia de la regulación oportuna de las interacciones microbianas epiteliales se hace evidente cuando el epitelio inmaduro se enfrenta prematuramente a la colonización microbiana: los recién nacidos prematuros son propensos al desarrollo de enterocolitis necrosante (ECN), caracterizada por necrosis intestinal, sepsis sistémica y múltiples alteraciones orgánicas. falla. Aunque la patogenia se considera multifactorial, varios estudios han indicado que se desarrolla en respuesta a un desequilibrio entre la señalización proinflamatoria y los mecanismos de reparación en el intestino prematuro (revisado en [94]) y se ha sugerido una contribución de los PRR [41, 65, 95 –97]. Varios estudios han utilizado organoides fetales humanos [24, 98, 99], organoides murinos normales expuestos a bacterias e hipoxia para modelar NEC [100] u organoides de un modelo NEC murino, así como de pacientes con NEC [101]. Los estudios futuros utilizarán estos modelos organoides establecidos y nuevos para definir aún más la contribución del epitelio en NEC.

Modelado de aspectos de la EII dependientes del epitelio con organoides

La pérdida de la integridad de la barrera epitelial intestinal es una característica definitoria de la EII, es decir, la EC y la CU, y parece estar causada por una interacción multifactorial de predisposición genética, factores ambientales, cambios en la microbiota intestinal y alteraciones de la respuesta inmunitaria local y sistémica (revisado en [27]). Las terapias actuales se dirigen predominantemente a las respuestas inmunitarias (aberrantes) en la EII, que se asocian con altas tasas de no respondedores y efectos secundarios (revisado en [27]). Se requiere una mejor comprensión de la contribución específica del epitelio a la fisiopatología de la EII para identificar nuevos objetivos terapéuticos que también puedan tener un impacto directo en la restauración de la barrera epitelial intestinal y, por lo tanto, en la cicatrización de la mucosa.

Para obtener información sobre la patología epitelial, varios grupos han establecido biobancos vivos compuestos por organoides generados a partir de pacientes individuales con CU o EC. Aunque este enfoque es obvio, hasta el momento, solo unos pocos estudios han informado resultados de organoides derivados de este grupo de pacientes [102–104]. Esto puede explicarse por la observación de que los organoides de pacientes con EII son más difíciles de generar. Nuestra propia experiencia es que los organoides generados a partir de pacientes con EC crecen más lentamente durante los primeros pases y se perdieron algunas muestras, lo que se asoció con una mayor tasa de contaminación bacteriana en los cultivos [105].

La caracterización de organoides derivados de pacientes con EII reveló un fenotipo con tamaño reducido y capacidad de gemación, aumento de la tasa de muerte celular, desechos luminales y polarización parcialmente invertida de las células epiteliales [106]. La comparación global de organoides de pacientes con CU o CD y controles sanos mostró que las diferencias transcripcionales y de metilación observadas en el epitelio intestinal se mantuvieron in vitro [102, 103, 107]. Además, un estudio anterior de organoides generados a partir de pacientes con EC sugirió alteraciones permanentes de las células madre intestinales en la EII. Esto se basó en la observación de que los organoides generados a partir de lesiones activas de CD mantuvieron altos niveles de expresión de marcadores de células madre epiteliales intestinales [108]. Esto se confirmó hasta cierto punto en un estudio reciente en el que los organoides de colon derivados de pacientes pediátricos con EII mostraron un patrón de expresión prolongada de genes presentadores de antígenos [109].

Centrándose en los cambios en la función de la barrera epitelial intestinal, incluida la pérdida de uniones estrechas y desmosomas, que generalmente se encuentran en la EII [110], se demostró que los organoides de pacientes con EC mantienen este fenotipo de alteraciones de la unión en condiciones de cultivo [105]. Este fue especialmente el caso cuando los organoides se generaron a partir de sitios de inflamación severa [105]. También podría inducirse una disminución de las proteínas de unión en organoides de donantes sanos mediante la aplicación de la citocina proinflamatoria TNF- y/o IFN- [106, 111]. Sin embargo, el patrón fijo de cambios de proteínas de unión en organoides de pacientes con EII se observó solo a nivel de proteína pero no a nivel de ARNm [105].

Estas observaciones sugieren que se fijan varios cambios en los organoides de los pacientes con EII. La observación de que algunos, pero no todos, los cambios permanentes solo son visibles en la proteína, pero no en el nivel de ARN, sugiere que existen alteraciones permanentes en las modificaciones postranscripcionales o la degradación de proteínas en los organoides de pacientes con EII. Esto, sin embargo, queda por investigar en detalle.

No está claro qué induce exactamente las alteraciones permanentes en los patrones de expresión del epitelio inflamado. Durante mucho tiempo se sospechó un efecto de la microbiota; sin embargo, un estudio reciente demostró que el efecto de la microbiota sobre el epitelio se pierde con el tiempo [112]. El estudio comparó varias instalaciones de ratones porque las diferentes composiciones de microbiomas de las colonias de ratones se identificaron como factores de confusión en estudios in vivo. Para aclarar este efecto, el estudio comparó aislamientos epiteliales y cultivos de organoides de ratones libres de gérmenes y dos colonias separadas de ratones libres de patógenos específicos con diferente microbiota. Si bien el epitelio recién aislado mostró una huella de la exposición a la microbiota en los niveles de ARN y proteínas, este efecto se perdió después de varias semanas de cultivo de organoides del intestino delgado [112]. Además, una comparación global de la expresión génica de organoides generados a partir de regiones inflamadas o no inflamadas de los mismos pacientes con EII demostró que los organoides con EII de las regiones inflamadas ya perdían la expresión del gen inflamatorio después de unas pocas semanas en cultivo. A continuación, se agruparon los transcriptomas de los organoides por paciente; por lo tanto, se mantuvieron las diferencias permanentes entre la EII y los controles sanos. El fenotipo inflamatorio en los organoides de la EII podría volver a inducirse mediante la adición de un cóctel de citoquinas [107]. En general, esto sugiere que los cambios permanentes observados en los organoides de los pacientes con EII son independientes del contacto con la microbiota o las citocinas.

Por lo tanto, aunque es razonable especular que algunos de los cambios permanentes en las células epiteliales intestinales de pacientes con EII pueden ser causados ​​por cambios en la señalización inmunitaria innata, actualmente la evidencia de esto es escasa. Además, no todos los cambios epiteliales observados en las regiones inflamadas del intestino se conservan permanentemente en el epitelio purificado, lo que indica importantes contribuciones del entorno local. En el futuro, nuevos estudios con modelos de organoides más complejos, que también incorporen células inmunitarias, estimulación de citoquinas inflamatorias y cocultivos con microorganismos, deberían ayudar a abordar esta hipótesis con más detalle.

Conclusiones, perspectivas futuras y Outlook

En resumen, mientras que muchas enfermedades dentro del tracto GI aún no se conocen por completo, la creciente evidencia apunta a un papel crítico del epitelio gastrointestinal en la patogenia de muchas de ellas, aunque su papel específico sigue sin estar claro.

El conocimiento limitado de la función inmune innata del epitelio gastrointestinal se ha atribuido a la falta de modelos experimentales apropiados. Con la implementación de la tecnología de organoides, se ha dado un gran paso para superar este problema. Los organoides generados a partir de cada región del tracto gastrointestinal se sumarán significativamente al conocimiento existente. Como revelaron estudios previos, la generación de organoides proporciona la ventaja crucial de poder observar las respuestas de las células gastrointestinales primarias frente a las líneas celulares transformadas, que en su mayoría se generan a partir de tumores malignos gastrointestinales. Una de las características más fascinantes de los organoides es que mantienen características específicas del segmento del tracto gastrointestinal del que se generaron como parte de su identidad celular durante la edad adulta. Según estudios experimentales actuales, la identidad regional se fija en las células madre gastrointestinales. En este contexto, un problema pendiente será determinar exactamente cómo y cuándo ocurre esta programación intrínseca durante el desarrollo.

Al observar conceptos específicos de cómo el epitelio puede responder o interactuar con el medio ambiente, la tecnología de organoides ahora ha permitido iluminar la expresión y función diferencial y específica del segmento de los PRR dentro del epitelio gastrointestinal. Las consecuencias funcionales generales para los complejos sistemas reguladores dentro de todo el tracto gastrointestinal aún no están claras y deberán abordarse en el futuro. Para ello, también será importante cocultivar organoides con células inmunitarias (revisado en [113]), células del sistema nervioso entérico [114] y factores luminales como cocultivos bacterianos (revisado en [115]) (Fig. . 4).

Otro aspecto importante es que los organoides generados a partir de tejido de pacientes afectados por enfermedades gastrointestinales como la EII mantienen algunas de las características observadas en las muestras de tejido correspondientes de las que se derivaron. Esto ofrece la posibilidad única de desentrañar aún más la contribución específica del epitelio y de la enfermedad a la patogenia de las enfermedades gastrointestinales, no solo aquellas que involucran cambios inducidos por inflamación, sino también aquellas que involucran cambios en enfermedades malignas. Ambos pueden resultar implicar una contribución específica de la inmunidad innata derivada del epitelio. Para ello, el establecimiento sistemático de "biobancos vivos" sería un paso importante. Como visión para el futuro, dichos biobancos vivos podrían unirse a los biobancos ya existentes, que actualmente proporcionan únicamente biomateriales "muertos". Esto representaría otro paso importante no solo para la investigación, sino también para facilitar el diagnóstico y la terapia individualizados para los pacientes.

Recuadro 1. La inmunidad innata y las células epiteliales en el tracto gastrointestinal no están claros si el impacto observado se debe a la señalización inmunitaria innata en las células epiteliales o en las células inmunitarias profesionales.

Para desentrañar la interacción de las células inmunitarias profesionales y las células epiteliales, varios estudios han utilizado knockouts específicos del epitelio o, más recientemente, organoides epiteliales. En modelos de ratón, ninguna de las deleciones epiteliales específicas de los PRR conduce a una inflamación espontánea. Sin embargo, los ratones con inactivación epitelial específica de MyD88 son más susceptibles a la colitis experimental y muestran una alteración grave de la barrera, una alteración de las respuestas de las células caliciformes y de Paneth [121] y una producción reducida de mucina y péptidos antimicrobianos [121, 122]. Los organoides del intestino delgado no generan una respuesta inflamatoria a varios ligandos PRR purificados [55], aunque esto no se puede generalizar y depende de la especie, la ubicación y la edad del tejido del que se generan los organoides [44, 45].

La ausencia de un fenotipo inflamatorio espontáneo en los modelos de eliminación de PRR específicos de células epiteliales respalda la hipótesis de que otros factores además de una respuesta inflamatoria general del epitelio tienen un impacto en la homeostasis epitelial. Por ejemplo, la estimulación con el agonista de NOD2 muramil dipéptido (MDP) aumentó la cantidad de organoides que crecen a partir de células madre aisladas, lo que indica que la señalización inmunitaria innata apoyó la supervivencia de las células madre [67, 84]. Además, los datos de ratones destacan la importancia de los efectos antiapoptóticos de la señalización de NF-κB en respuesta a otros estímulos, como TNF- [123]. Curiosamente, en humanos, los polimorfismos en los genes inmunitarios innatos, incluidos NOD2 y TLR4, se asocian con un mayor riesgo de desarrollar EII [124] y el bloqueo del TNF- es actualmente el tratamiento más eficaz para la EII en algunos pacientes (revisado en [125]).

Surge una imagen en la que un bajo nivel de estimulación inmunitaria innata es importante para la secreción de moco, la integridad de la barrera y la supervivencia de las células epiteliales. Su deterioro puede permitir la translocación de bacterias intestinales desde la luz hacia el tejido subepitelial, lo que lleva a la inflamación.

Expresiones de gratitud

Agradecemos a Ömer Kaya por la ayuda con las ilustraciones y a Rike Zietlow por la edición.

Contribución del autor

Idea: SB Concepto inicial: SB y Ö.K.; búsqueda bibliográfica: Ö.K., NS y SB; Borrador inicial: Ö.K. Revisión, reescritura, adición de secciones: NS, SB Todos los autores revisaron críticamente el manuscrito final.

Fondos

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Este trabajo recibió el apoyo de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; Modelos de tejido 3D para estudiar infecciones microbianas por patógenos humanos, Proyecto 10, para SB), el Centro interdisciplinario de investigación clínica (IZKF; www.med.uni-wuerzburg.de/izkf) /startseite) en Würzburg (Grant AD-427 a NS y SB), y el DFG SPP1982 SCHL1962/5-2 a NS.

Declaraciones

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acceso abierto

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